Le système vasculaire cérébral est un réseau complexe d’artères pénétrantes, de capillaires et de veinules ascendantes. Ces vaisseaux sont enveloppés par des cellules murales, telles que les péricytes gainants, qui expriment l’actine musculaire alpha lisse, et se trouvent dans les quatre premières branches des artères pénétrantes. Nous utilisons des souris transgéniques Acta2-RCaMP 1.07 pour visualiser les transitoires de calcium dans ces cellules, grâce à l’expression de l’indicateur de calcium génétiquement codé RCaMP.
Le calcium joue un rôle important dans la contraction de ces cellules et le contrôle du flux sanguin. Les péricytes capillaires se trouvent plus en aval dans le réseau vasculaire et peuvent être marqués dans d’autres modèles transgéniques. Cependant, nous nous concentrons sur l’ensemencement des péricytes dans cette méthode.
Nos souris ont été implantées chirurgicalement avec une fenêtre crânienne chronique qui permet d’accéder au système vasculaire cérébral pour l’imagerie. Ici, nous décrivons les étapes de préparation nécessaires et l’injection de la veine caudale suivies des deux méthodes d’imagerie photonique et d’analyse nécessaires pour acquérir des données sur le calcium péricyte et des informations sur le flux sanguin chez les animaux anesthésiés. Les éléments suivants sont requis pour une injection de cathéter veineux de queue: seringues à insuline, un morceau de tube PE10 de 15 centimètres, aiguilles de calibre 30, gaze, solution saline, pinces, colorant dextran de fluorescéine verte, pince et ciseaux.
Nous avons également une aiguille avec une anesthésie à la kétamine xylazine que nous allons injecter avant l’imagerie car elle est meilleure que l’isoflurane pour les mesures du débit sanguin. À l’aide de la pince, cassez une aiguille de calibre 30 du moyeu. Insérez soigneusement l’aiguille dans l’extrémité du morceau de tube PE10 attaché à une seringue remplie de solution saline.
Il s’agit du cathéter pour injection. Anesthésier une souris avec de l’isoflurane et appliquer le gel I-Lube. Placez un champ de gants avec de l’eau tiède sur la queue pour dilater la veine latérale.
Après avoir nettoyé la queue avec de l’éthanol, insérez l’aiguille dans la veine et injectez doucement une solution saline à travers le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est placée correctement. Allumez la seringue sur le cathéter pour une seringue remplie de colorant fluorescéine dextran. Injectez lentement le colorant pour vous assurer qu’aucune bulle ne pénètre dans le tube.
Remplacez la seringue dextran par la seringue saline et rincez le tube jusqu’à ce qu’il ne reste plus de colorant dans le tube. Retirez l’aiguille et appuyez avec de la gaze. Injecter une anesthésie à la kétamine xylazine pour l’imagerie.
Avec la tête de souris fixée sur un coussin chauffant, nettoyez la fenêtre crânienne avec des applicateurs dentaires. Appliquez du gel à ultrasons sur la fenêtre et faites la mise au point à travers l’objectif du microscope à deux photons. Pour l’imagerie à deux photons, nous utilisons un microscope avec laser saphir en titane réglable pour les fluorescents, l’excitation et les tubes photomultiplicateurs pour la détection des émissions.
Dans le logiciel du microscope, réglez la longueur d’onde à 990 nanomètres pour exciter à la fois le RCaMP et la fluorescéine dextran. Ensuite, réglez la puissance du laser en ajustant la tension de la cellule pockel et la sensibilité du détecteur PMT. Le balayage en direct avec ces paramètres et une résolution plus élevée, les cellules murales RCaMP positives et le plasma sanguin marqué par fluorescence peuvent être vus.
L’acquisition d’une pile de profondeur est recommandée pour localiser correctement les péricytes dans le réseau vasculaire. Lorsque vous êtes focalé en haut du tissu près des vaisseaux PO, définissez-le comme point zéro et haut de la pile de la série Zed, puis concentrez-vous vers le bas dans le tissu à la profondeur souhaitée et définissez-le comme le bas de la pile. La puissance du laser doit être ajustée pour augmenter à mesure que le microscope se déplace plus profondément dans la pile.
En ouvrant la série Zed dans un logiciel de traitement d’image, fusionnez les deux canaux en tant qu’images colorées et parcourez la pile à la recherche de péricytes et de vaisseaux sanguins d’intérêt. Sélectionnez les régions d’intérêt qui contiennent des péricytes et enregistrez les positions pour aider à localiser à nouveau ces points lors de futures séances d’imagerie. Pour collecter et déplacer un événement de calcium péricyte, augmentez la fréquence d’images d’acquisition à plus de 10 images par seconde.
Définissez la durée de l’imagerie sur 60 secondes et mettez à jour le chemin d’enregistrement avec un nom de fichier unique. Zoomez optiquement sur le vaisseau pour tenir compte de la résolution inférieure et pour avoir une vue plus rapprochée du péricyte. Acquérir la série T.
Pour mesurer le diamètre des vaisseaux sanguins et la vitesse des globules rouges, sélectionnez le balayage linéaire pour commencer un balayage unidimensionnel au microscope. Définissez d’abord la durée de l’analyse en millisecondes. Tracez ensuite une ligne qui coupe en deux le navire d’intérêt et se déplace parallèlement le long du navire.
Cela générera un kymographe du diamètre du vaisseau à gauche et des stries des globules rouges se déplaçant à travers le vaisseau à droite. Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste complète des programmes et des packages utilisés dans ce protocole. Sélectionnez d’abord les régions d’intérêt à la main dans un logiciel de traitement d’image.
Chargez le fichier de la série T, prenez la moyenne de la pile et créez une image colorée. Sélectionnez l’outil polygone et tracez le contour des structures péricytaires en gainage visibles telles que le soma et les processus. Donnez à chaque région d’intérêt un nom unique et enregistrez-les dans un dossier zip qui peut être chargé ultérieurement dans le logiciel de programmation.
Ouvrez le logiciel de programmation et assurez-vous que les dossiers des packages de traitement d’image se trouvent sur le chemin. Importez la série calcium T dans le logiciel de programmation et définissez ce qui se trouve sur chaque canal. Dans ce cas, il s’agit d’un signal cellulaire sur le canal un et du plasma sanguin sur le canal deux.
Tracez les données sous forme de film dans le logiciel de programmation pour faciliter la visualisation. Pour éliminer les fluorescents verts de la fluorescéine dextran qui saigne dans le canal rouge RCaMP, décomfondez les canaux dans le package de traitement d’image. Sélectionnez d’abord une région qui ne contient que du fluorophore 1, RCaMP dans ce cas.
Deuxièmement, sélectionnez une région qui ne contient que du fluorophore 2, de la fluorescéine dans le plasma. Enfin, sélectionnez une zone d’arrière-plan qui n’a pas de fluorophore. Cela génère une matrice de contribution spectrale, qui est appliquée à chaque pixel de chaque canal.
Il améliore considérablement la localisation du signal RCaMP, ce qui améliorera la détection des événements calciques dans ces structures. Il existe plusieurs façons d’analyser les données d’imagerie calcique dans les packages de traitement d’image. Exécutez d’abord l’analyse de signalisation cellulaire sur le film de calcium non mélangé et chargez les régions d’intérêt à partir du dossier zip qui ont été sélectionnées à la main dans les péricytes plus tôt.
Définissez le facteur d’échelle sur un car les régions n’ont pas besoin d’être redimensionnées. Après le traitement, générez des tracés de chaque ROY et des traces de calcium normalisées de différentes couleurs. Si le code ne détecte pas la majorité des événements calciques dans les traces individuelles, modifiez les paramètres intégrés dans la zone d’optimisation, par exemple en diminuant le seuil pour les données filtrées de passe courte à trois fois l’écart-type de la période de référence, qui est les 30 premières images de la série T.
Afin de détecter et de classer les signaux, la trace de calcium normalisée est filtrée en passe longue et passe-bande, ce qui permet de lisser les données pour l’amplitude et avec des estimations, mais aussi de déterminer si les signaux sont des pics simples, des pics multiples ou des plateaux. Produisez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse statistique plus approfondie. Exécutez l’analyse de signalisation cellulaire une deuxième fois sur le film de calcium non mélangé et sélectionnez l’identification automatisée de la région d’intérêt en fonction de l’activité et du changement des fluorescents en trois dimensions, X, Y et le temps.
Tracez les résultats du processus pour afficher les régions d’intérêt identifiées de différentes couleurs. Si l’algorithme ne détecte pas les ROYs qui sont clairement visibles à l’œil nu dans le film, modifiez les paramètres intégrés, tels que l’augmentation du filtre gaussien qui lisse les données dans le temps et la diminution du seuil de recherche de ROYs à trois fois l’écart type de la ligne de base. Tracez les ROYs comme un film pour une visualisation plus poussée.
Produisez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse statistique plus approfondie. Importez le fichier de données kymograph à balayage linéaire dans le logiciel de programmation et définissez ce qui se trouve sur chaque canal. Exécutez la fonction d’analyse de diamètre sur le balayage linéaire, qui ouvre une boîte pour sélectionner la zone qui correspond au diamètre dans le kymographe.
Dessinez une boîte à l’extérieur des limites des fluorescents du kymographe, qui correspond au diamètre du récipient. Traiter cette classe de données afin de mesurer la pleine largeur à des demi-maxima pour le diamètre du récipient et de générer un tracé. Ensuite, exécutez le taux de vitesse sur l’analyse de transformation et dessinez une boîte à l’intérieur de la bordure des fluorescents du kymographe.
Traitez cette classe de données afin de calculer la vitesse, le flux et la densité linéaire des globules rouges. Produisez les résultats du flux sanguin sous forme de fichier CSV pour une analyse plus approfondie. La sélection des structures cellulaires à la main permet de détecter les fluctuations du calcium dans ces régions, y compris différents types de pics de signal, tels que les pics simples et les pics multiples, une fois que les traces de calcium normalisées sont filtrées passe-bas et passe-bande.
De plus, les régions d’intérêt sont identifiées en regroupant les pixels actifs où l’intensité des fluorescents change au fil du temps à l’aide d’algorithmes de traitement d’image. Cela peut être appliqué à n’importe quel signal cellulaire dynamique en ajustant le temps, le seuil et les paramètres spatiaux pour englober la taille et la forme attendues du signal. La diminution du seuil d’identification du signal trouve plus de régions d’intérêt.
Des kymographes hémodynamiques clairs sont analysés pour mesurer le diamètre et la vitesse des globules rouges dans les vaisseaux sanguins près des péricytes ensgayants. Le diamètre est calculé à partir de la pleine largeur à la moitié maximale des fluorescents. La vitesse des globules rouges est approximative à partir des stries faites à partir de globules rouges non étiquetés, où l’angle est entré dans une transformation du radon pour calculer la vitesse.
Les kymographes de mauvaise qualité, où il y a une saturation fluorescente, un mauvais rapport signal /bruit ou un mouvement du champ d’imagerie, créent des tracés peu fiables avec des points d’erreur, indiqués sous forme de croix rouges, où les données ne peuvent pas être déterminées. La qualité des données acquises est essentielle pour un bon résultat et suivre les étapes décrites dans ce protocole garantit de bons résultats. Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’imagerie calcique combinée des péricytes en gainant le cerveau et les mesures du débit sanguin par microscopie à deux photons.
Ces techniques sont utiles pour répondre aux questions sur la physiologie cellulaire murale et la localisation dans le réseau vasculaire du cerveau, mais elles peuvent être adaptées pour étudier les transitoires de calcium dans n’importe quel type de cellule du cerveau ou d’un autre système organique.
