Este trabajo fue apoyado por el premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia (ARD), los Institutos Nacionales de Salud a través de Nuevo Director del NIH Programa Premio a la Innovación 1-DP2-OD007078 (ARD), el William Bowes, Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), y el Instituto Cardiovascular de Stanford beca predoctoral Joven (JC). Los autores agradecen a James Spudich por el préstamo de equipos de microscopía.

1. Flujo de Preparación de la célula <ol><li> Cubreobjetos (# 1.5, 22x22 mm y 22x40 mm, VWR) se limpian con ultrasonidos. <ol><li> Añadir los cubreobjetos a un pequeño envase de cristal capaz de mantener cubreobjetos y equipamiento en el baño de ultrasonidos (ver paso 2). </li><li> Llenar el recipiente con isopropanol y sonicar en un sonicador de baño durante 20 minutos. </li><li> Deseche el isopropanol y lavar los cubreobjetos con grandes cantidades de agua desionizada producida por un aparato de Barnsted MilliQ o dispositivo similar. Llene el recipiente con agua y déjelos en remojo durante 20 minutos. </li><li> Después de ultrasonidos, secar los cubreobjetos en una corriente de agua filtrada, libre de polvo del aire. Utilice sólo los que aparecen cubreobjetos limpio (es decir, sin manchas). </li><li> Con cuidado la llama de los cubreobjetos durante unos segundos para limpiarlos de cualquier resto de polvo y la humedad: pasar los cubreobjetos a través de una llama de gas que se produce con un mechero Bunsen, teniendo cuidado de no deformar el cubreobjetos, debido al exceso de calor. Este paso elimina residual en la superficiecontaminantes. </li></ol></li><li> Utilizando cinta de doble cara adhesiva, fije los dos cubreobjetos juntos. Corte la cinta ~ 3 cm de longitud y 0,3 cm de ancho. Coloque la cinta sobre el cubreobjetos mm 22x40 dejando un canal cm 1,6 en el medio. Utilice una punta de pipeta para presionar suavemente sobre el cubreobjetos para asegurarse de que la cinta se ha adherido correctamente. </li></ol> 2. Configuración magnética Pinzas y Calibración <ol><li> Pinzas magnéticas eran de configuración usando permanentes imanes de tierras raras como se describió anteriormente 10,12. Un soporte de aluminio L-fue construido con un orificio de 1 mm de diámetro y montado sobre un eje vertical Z-traductor (Thorlabs) para modular la altura de las pinzas. Dos permanentes imanes de tierras raras se adjunta a la ménsula a cada lado de la estenopeica para crear la trampa magnética (Figura 1). </li><li> Preparación de ADN: ADN de fago lambda marcado en su extremo 5 &#39;y 3&#39; termina con biotina y digoxigenina (IDT ADN, San Diego, CA) se utiliza para calibrar la magnitudpinzas de genética. <ol><li> Mezclar 50 l de 4 nM λ-DNA con 2 l de 40 nM biotina oligonucleótido conjugado y se calienta a 60 ° C durante 10 minutos. Luego enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Añadir ADN ligasa de acuerdo con las especificaciones del fabricante y ligar a temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Añadir 2 l de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Añadir 1,5 l de 10 mM de ATP y continuar ligación del oligonucleótido conjugado con digoxigenina a la λ-DNA durante 3 horas. </li><li> Retire el exceso de los oligonucleótidos y la ADN ligasa con 100 filtros de espín kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de intercambio de tampón de 1000 veces en buffer TE es suficiente para eliminar el exceso de los oligos. Nota: Es importante no utilizar velocidades de centrifugado&gt; 500xG porque va a llevar a la rotura del ADN. </li><li> Examinar una muestra del ADN mediante electroforesis en un gel de agarosa 0,7% para asegurar que el ADN is no desnaturalizado o cortadoras. </li><li> Medir la concentración de ADN. El uso de un Nanodrop UV-Vis espectrómetro (Thermo Scientific) se recomienda ya que el volumen de muestra disponible puede ser muy pequeña. </li></ol></li><li> Prepare las celdas de flujo como se describe en la sección 1. </li><li> Para la fijación del ADN a la celda de flujo, añadir anticuerpos anti-digoxigenina (IgG de oveja; 1 mg ml -1; Roche Bioscience, Manheim, Alemania) y permitir que se adhieren a la superficie de vidrio durante 15 minutos. </li><li> Pasivar la superficie de la celda de flujo para evitar que se pegue no específica de ADN mediante la adición de 2 mg ml -1 de BSA, 0,1% de Tween-20 en PBS 1x. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Repita el paso 2.5. </li><li> Añadir 50 pM de fuctionalized λ-DNA y permiten asociar al cubreobjetos durante 15 minutos. </li><li> Eliminar el exceso de ADN con 1x PBS. </li><li> Añadir streptavidina revestida de piedras superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1; 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1 </sa&gt;) y permitir que se adhieren al ADN inmovilizado durante 15 minutos. </li><li> Eliminar el exceso de cuentas con 1x PBS. </li><li> La calibración magnética Pinzas <ol><li> Mueva los imanes permanentes a una posición que está lejos de la superficie de la muestra (&gt; 15 mm). </li><li> Colocar la celda de flujo preparada en el microscopio. </li><li> Mueva los imanes permanentes en su posición por encima de la celda de flujo. </li><li> Elegir el plano focal de cuentas de ADN λ-funcionalizados, centrándose en las cuentas de distancia de las dos superficies de vidrio. El plano focal correcta es aquella en la que las perlas deseadas tienen un centro brillante. </li><li> Tome un video de movimiento cordón a 80 Hz o superior a 500 marcos. </li><li> Mueva el imán más cerca de la superficie de la muestra. Para distancias más allá de 5 mm, se mueven en incrementos de 1 mm. Para distancias de entre 1 y 5 mm, se mueven en incrementos de 0,5 mm. Para distancias de menos de 1 mm, se mueven en incrementos de 0,25 mm. </li><li> Repita los pasos 2.11.5 y 2.11.6 en cada posición del imán nuevo. </li><li> Para cada conjunto de datosestablecido, rastrear el centro de las perlas usando un ajuste 2D gaussiana. </li><li> Calcular la fuerza a través de las fluctuaciones browniano con: </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> donde k B T es la energía térmica de Boltzmann, L es la longitud de λ-DNA, y &lt;x 2&gt; es la variación en la posición centroide. <ol start="10"><li> Confirmar la exactitud de las fuerzas comprobando el cálculo de la fuerza a través de un espectro de ajuste de potencia de Lorentzian con el fin de encontrar la frecuencia de corte. Fuerza aplicada está relacionada con la frecuencia de corte por la relación: </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> Cuando 0 ƒ es la frecuencia de corte, uno es el radio de talón, y μ es la viscosidad del fluido 12. </li></ol> 3. El colágeno péptido adjunto a las celdas de flujo A fin de proporcionar un ejemplo concreto de aplicación de nuestra metodología, se describen los trabajos recientes en nuestro laboratorio que caracteriza a la proteolisis de un péptido de colágeno modelo trimérica. Creemos que este enfoque general se puede aplicar ampliamente a otras proteínas y polinucleótidos. <ol><li> El péptido modelo colágeno consta de un N-terminal de 6x Su etiqueta para la purificación, seguido por una etiqueta 5x myc, (CPE) 10 para hacer cumplir la formación de triple hélice, el colágeno a1 residuos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que forman la MMP- 1 sitio de reconocimiento, la secuencia foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), y un KKCK C-terminal para facilitar el etiquetado con biotina-maleimida. Foldon deriva de la proteína fibritin T4-fago, y se estabiliza trímeros de colágeno del modelo cuando se fusiona en cualquiera de la N - o C-terminal 13,14. </li><li> El péptido de colágeno y proteínas MMP-1 se expresa y se purificó como se describió anteriormente 4,15. &lt;/ Li&gt; <li> Añadir anti-myc (15 mg ml -1) a la celda de flujo y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el anti-myc para sujetar a la superficie de la celda de flujo. </li><li> Pasivar la celda de flujo para evitar fijación no específica de proteínas utilizando 5 mg mL -1 de BSA en la misma forma como se describe en el paso 2,5. </li><li> Añadir 150 péptido de colágeno pM y permitir que se conecte al anticuerpo a través de la etiqueta myc durante 45 minutos. </li><li> Eliminar el exceso de colágeno utilizando tampón PBS. </li><li> Añadir cuentas de streptavidin cubierto superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1 y 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1) y permitir que se adhieren a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Las perlas de 1 micras debe diluirse a la concentración deseada en PBS. Las perlas de 3 micras debe ser separado de la solución utilizando imanes fuertes, entonces resolubilizado en PBS. Este proceso debe ser repetido 3 veces. Nos dimos cuenta de que este paso es esencial para GEt las perlas 3 micras para unirse a la superficie inmovilizada péptido de colágeno. </li></ol> 4. Equipo de ensayo proteólisis <ol><li> Una vez que la celda de flujo se ensambla con el péptido de colágeno y perlas magnéticas, la imagen de la celda de flujo magnético en la trampa bajo bajo, ~ 1 fuerza pN. En nuestra experiencia, una subpoblación de las perlas es a veces débilmente adherido a la superficie en una forma no específica. La aplicación de la fuerza modesta asegura que estas perlas son liberados. </li><li> Añadir enzima activa a la celda de flujo. En este caso MMP-1 fue pre-activadas mediante la adición de 3,5 mM de APMA (4-aminofenilmercúrico acetato) y se incubaron a 37 ° C durante 3 horas. La activación se verificó mediante SDS-PAGE. </li><li> Tan pronto como la celda de flujo se vuelve a introducir en el aparato magnético pinzas, grabar un vídeo que abarca unos pocos campos de vista, dando típicamente varios cientos de perlas adjuntos. Esto será t = 0. </li><li> Repita el mismo proceso de grabación de varios campos de la vista (cuando regresaba to el mismo campo de visión) en los puntos regulares de tiempo, hasta que todas las cuentas de separar o no la proteólisis adicional es discernible. </li><li> Análisis de datos cinéticos <ol><li> Contar los granos en los diversos campos de la vista en momentos diferentes y un promedio de ellos. Normalizar el número de cuentas dividiendo el número medio de bolas en cada momento por el número de perlas en el instante t = 0. Esto asegura que podamos comparar las tasas de la proteólisis de distintos experimentos, debido a que el número absoluto de cuentas será diferente de experimento a experimento. </li><li> Trazar la relación como una función del tiempo. En este caso, se ajustaba a un decaimiento exponencial más una constante. </li></ol><img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> donde f (t) es la relación de las perlas unidas (o moléculas de colágeno unproteolyzed), t es el tiempo, una es la fracción de perlas unidas por una correa de sujeción colágeno, b es la tasa constante de desintegración, y ces la fracción de perlas que están unidos no específicamente. <ol start="3"><li> El mismo experimento se repitió en diferentes concentraciones y fuerza de MMP-1 para dilucidar el efecto de la fuerza en la proteólisis de colágeno por la MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos El protocolo anterior describe un nuevo uso de pinzas magnéticas (Figura 1) para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática. Hemos calibrado las pinzas para 1 y 3 micras perlas micras utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones observadas browniano y el cálculo de la frecuencia de corte en las posiciones del imán diferentes (Figura 2). En los experimentos de fuerza proteolisis, la configuración es similar, excepto que el ADN se sustituye con colágeno (Figuras 3, 4). El número normalizado de perlas restantes se pueden representar como función del tiempo para encontrar las tasas de proteolisis (Figura 5), y este proceso puede serrepite para diferentes concentraciones de la enzima y las fuerzas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática del proceso de calibración trampa magnética (no a escala). Dos imanes permanentes de tierras raras crear un campo magnético que tira de la superparamagnético talón. Traducir el imán hacia arriba y abajo se ajusta la fuerza aplicada. Las cuentas se visualizan con un brillante convencional microscopio de campo con la luz que pasa a través de un agujero entre los dos imanes Recuadro:. Imagen tomada con un objetivo de 40x de aire. Los puntos cortantes, redondos corresponden a las perlas unidas a la superficie cubreobjetos. Los objetos fuera de foco son cuentas separadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> Figura 2. Los gráficos de la fuerza calibrada como una función de la distancia del imán de la superficie de la muestra durante 1 micras (izquierda) y 2.8 micras (derecha) de talóns. Los datos se ajustaron a la función empírica <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> , Donde x es la distancia desde el imán. Una = 31,8, b = 5,61, y c = 4,39 para las perlas de 1 micras y con una = 140, b = 3,10 y c = 1,86 para los 3 perlas de micras. Estos valores son específicos para nuestro instrumento específico y la geometría experimental, y cada instrumento debe ser calibrado individualmente. Las barras de error en cada punto representa una variabilidad ~ 10% en la fuerza aplicada sobre un talón a base de bolas, debido a la variabilidad en el tamaño de talón. La fuerza aplicada es proporcional al volumen de las perlas, y el volumen de bolas varía ~ 9% con respecto a la media (de acuerdo con las especificaciones del fabricante). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> Figura 3. Proteólisis Fuerza ensayo de la instalación (no a escala). El trímero modelo colágeno está unido a la superficie del cubreobjetos a través de myc / conjugación de anti-myc. Las perlas superparamagnéticas estreptavidina-revestidas se adjunta a los trímeros de colágeno a través de un enlace biotina-estreptavidina. Activada la MMP-1 corta el colágeno a través del tiempo, provocando que las perlas se desprenden de la superficie y se alejan del plano focal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> Figura 4. Dibujos animados esquemática de la proteolisis como una función del tiempo. La caricatura muestra un campo de muestra de vista con el tiempo, se produce la proteólisis. Con el tiempo, la MMP-1 cortes de colágeno y las perlas de la separe y se alejan del plano focal bajo la influencia del campo magnético. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> Las tasas de la Figura 5. Proteólisis dependerá de la fuerza aplicada 16. Se muestran los datos recogidos en el 1,0 pN (3 mM MMP-1, el negro), 6,2 pN (3 mM MMP-1, roja) y 13 pN (0,2 mM MMP-1, magoNTA). Las tasas de proteólisis (parámetros de ajuste) son los siguientes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min-1 (6,2 PN), y 2,08 ± 0,18 min-1 (13 PN). La fracción de perlas unproteolyzed en puntos de tiempo largos (&gt; 15 minutos) se mantiene aproximadamente constante a través de ~ 0,25 experimentos diferentes. Las barras de error corresponden a la estadística de Poisson que refleja el número de observaciones en cada momento. El error en cada punto de tiempo para perlas n es n 1/2. El error en la fracción de perlas unidas se calculó por error propagation.1 perlas micras fueron utilizados para experimentos y 1,0 pN 6.2 pN y 2,8 micras perlas fueron utilizados para experimentos pN 13.

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No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo se describe un nuevo uso para una sola molécula técnica clásica. Pinzas magnéticas permiten a medio y alto rendimiento de los ensayos de una sola molécula de una manera costo-eficiente. Sin embargo, como todas las técnicas experimentales que hay desafíos y peligros potenciales. Limitaciones de pinzas magnéticas En comparación con una trampa óptica de la resolución espacial y temporal de un aparato de TA es baja. Por otra parte, las fuerzas ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Micro cubierta del cristal # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro cubierta del cristal # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 ADN ligasa </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anticuerpos anti-myc </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-aminofenilmercúrico Acetato </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> La biotina marcada oligo </td><td> IDT ADN </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> Digoxigenina marcado oligo </td><td> IDT ADN </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> El colágenogen del péptido </td><td> ADN 2.0 </td><td> La síntesis </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard plásmido de base de datos </td><td></td></tr><tr><td> z-traductor </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servo control para el traductor </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

La generación y detección de las fuerzas mecánicas es un aspecto omnipresente de la fisiología celular, con relación directa con la metástasis del cáncer 1, 2 y aterogénesis cicatrización de la herida 3. En cada uno de estos ejemplos, las células tanto de ejercer la fuerza de su entorno y al mismo tiempo enzimáticamente remodelación de la matriz extracelular (MEC). El efecto de las fuerzas de ECM se ha convertido en un área de considerable interés debido a su probable importancia biológica y médica 4-7. Técnicas de una sola molécula, tales como la captura óptica 8, microscopía de fuerza atómica 9, y pinzas magnéticas 10,11 permitirá a los investigadores para probar la función de las enzimas a nivel molecular, al ejercer fuerzas sobre las proteínas individuales. De estas técnicas, pinzas magnéticas (MT) se caracterizan por su bajo costo y alto rendimiento. MT ejercen fuerzas en el rango de 1-100 ~ pN y puede proporcionar milisegundo resolución temporal,cualidades que son bien emparejados para el estudio del mecanismo de la enzima en el nivel de una sola molécula de 12. Aquí mostramos un ensayo altamente paralelizable MT para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis de las moléculas de proteínas individuales. Se presenta el ejemplo específico de la proteolisis de un péptido de colágeno trimérica por metaloproteinasas de matriz 1 (MMP-1), sin embargo, este ensayo se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sustratos y proteasas.

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K vistas.  Stanford University. En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Investigación

Bioingeniería

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...