Nous remercions le Dr Chen Yih-Fan de l&#39;aide avec les pinces optiques axiales et de contribuer certaines de ses données d&#39;étirement pour ce manuscrit. Ce travail a été financé par la NSF subvention PHY-0957293 et ​​FOCUS subvention PHY-0114336.

1. Pince à épiler Setup <ol><li> Le faisceau d&#39;un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l&#39;autre est utilisée à des fins d&#39;étalonnage (voir Fig. 2). </li><li> L&#39;intensité du faisceau est commandée par la manipulation d&#39;un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l&#39;orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d&#39;orientation du faisceau et de télescopes optiques, respectivement. </li><li> Les faisceaux sont ensuite recombinés avec un autre séparateur de faisceau polarisant et en outre conditionnée par un ensemble final de l&#39;optique télescopiques à peu trop remplir l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif de microscope. Un trop-plein 50% pour le faisceau d&#39;étalonnage mène à une trappe étanche optique, tandis qu&#39;un facteur légèrement inférieur à la largeur de manipulation, d&#39;environ 20%, donne une orientation superficielle qui se traduit par une plus grande région réalisable du potentiel linéaire. Les poutres sont étroitement focalisé par une Planapo 60x/1.4 obj microscope à immersion d&#39;huilecace sur la cellule échantillon. </li><li> Cette configuration pincettes est combiné avec un microscope à champ clair foyer construit qui fournit l&#39;éclairage d&#39;une lampe halogène focalisé sur la chambre de mesure par un condenseur. L&#39;image à fond clair est séparée de la lumière laser par un miroir dichroïque, puis reproduite sur deux caméras CCD. On agit comme nos CCD principal moyen d&#39;acquisition de données et le logiciel est déclenché pour donner des taux d&#39;échantillonnage précis, tandis que l&#39;autre CCD est utilisée pour l&#39;image d&#39;une microsphère de référence unique coincé dont la position sert de système de rétro-contrôle pour compenser la dérive dans le microscope. </li><li> L&#39;échantillon est grossièrement positionné par rapport à l&#39;objectif d&#39;une table XY, et peut ensuite être positionné avec précision par un noyé trois dimensions piézo-étape. </li><li> La lumière laser diffusée vers l&#39;avant et transmise est recueillie par le condenseur fond clair et concentré sur un photodétecteur. Le signal résultant est filtré à travers un filtre anti-repliement à 100 kHz, amplifié et uncquired à 200 kHz avec une carte DAQ. </li></ol> 2. Calibrage taille apparente de la perle de la position axiale <ol><li> Chargez une chambre 9 échantillon avec une solution en dispersion de 800 nm de diamètre microsphères de polystyrène dilué dans du tampon phosphate salin. Laisser reposer pendant 10-15 minutes, puis rincer légèrement avec un tampon pour enlever l&#39;excédent de microsphères. </li><li> Localiser une microsphère de manière aléatoire collé à la lamelle et régler la hauteur de la chambre de mesure jusqu&#39;à ce que la microsphère est d&#39;environ 1 um en dessous de la mise au point afin de générer une image défocalisée. </li><li> Pour mesurer la taille apparente de l&#39;image, tout d&#39;abord trouver le centre de la microsphère en utilisant le modèle géométrique fonction de correspondance dans LabView. </li><li> Ensuite, générer un profil d&#39;intensité radiale de la microsphère en faisant la moyenne sur 360 ° autour du centre de chaque section transversale. Le profil radial, ce qui correspond à un anneau blanc dans chacune des images en fond clair, peut être équipé d&#39;une fonction quadratique de trouverun pic de luminosité. La distance entre ce sommet et le centre peut être utilisé comme une mesure de la taille apparente du bourrelet. </li><li> En utilisant la piezostage calibré, augmenter progressivement la position axiale de la microsphère et acquérir une image à chaque position axiale par la caméra CCD. </li><li> Répéter l&#39;analyse d&#39;image pour chaque image successive de corréler la taille apparente de la microsphère avec son emplacement axial (voir Fig. 3). La résolution axiale obtenue par la méthode est d&#39;environ 1,4 nm 7. </li></ol> 3. Cartographie du potentiel optique du faisceau de manipulation <ol><li> Commencez par aligner le faisceau colinéaire manipulation et le faisceau d&#39;étalonnage. Le faisceau d&#39;étalonnage devrait être autour de 50 mW à l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif pendant que le faisceau de manipulation devrait être beaucoup plus faible, soit 10 mW. </li><li> Avec le faisceau de manipulation éteint, confiner une microsphère libre dans le piège beaucoup plus rigide du faisceau d&#39;étalonnage. </li><li> Maintenant, tournez sur la manifaisceau pulation. Depuis le faisceau de manipulation est beaucoup plus faible que le faisceau d&#39;étalonnage, la position axiale de la microsphère sera légèrement perturbé. Le changement résultant dans une position axiale peut être mesurée à partir des images en fond clair defocused déjà décrites. </li><li> Désactiver le faisceau de manipulation et de la microsphère encore piégés dans le faisceau d&#39;étalonnage, recentrer le faisceau axial de l&#39;étalonnage en réglant la lentille télescopique. Activer le faisceau de manipulation, la mesure de déplacement ultérieur de la microsphère et la répétition. </li><li> L&#39;AX déplacements peut être relevée en position axiale de la focalisation du faisceau d&#39;étalonnage. La position axiale correspondant à la plus grande cylindrée de la microsphère détermine le centre de la zone linéaire du piège optique (voir Fig. 4). </li><li> La dernière étape de l&#39;obtention de la force optique du faisceau de manipulation en fonction de la position axiale nécessite une attention de mesure de la rigidité de l&#39;faisceau d&#39;étalonnage. Pour obtenir cela, déplacer la microsphère, piégés par le faisceau d&#39;étalonnage, à environ un micromètre au-dessus de la surface de réglage de la lentille télescopique tandis que le faisceau de manipulation est mis hors tension. </li><li> Enregistrer le mouvement thermique axiale de la microsphère en mesurant l&#39;intensité de la lumière transmise à un photodétecteur. </li><li> L&#39;auto-corrélation du signal peut être équipé d&#39;une fonction de décroissance exponentielle simple de donner la constante de temps des fluctuations,. Τ z </li><li> Le coefficient de frottement hydrodynamique ζ, de la microsphère peut être corrigée pour la proximité microsphères à un 5,10 en surface. La rigidité de la trappe d&#39;étalonnage est alors donnée par κ z = ζ / z (τ matériaux supplémentaires voir A et B). </li><li> Connaissant la raideur de la trappe d&#39;étalonnage permet de convertir les déplacements axiaux précédemment mesurées dans une population ƒ z = κ z AX intégration de this courbe donne une cartographie spatiale du potentiel axiale optique du faisceau de manipulation (voir Fig. 4). </li></ol> 4. L&#39;étirement d&#39;un échantillon d&#39;ADN <ol><li> Monter la chambre 9 contenant des molécules d&#39;ADN de surface asservies (&lt;1 kpb) et, tout en observant l&#39;image à fond clair, de placer le foyer du faisceau légèrement supérieure à la manipulation non étiré microsphères en ajustant le télescope. Puis ajuster la position de la platine jusqu&#39;à ce que l&#39;un des microsphères est piégé. </li><li> Positionner grossièrement la microsphère au centre du plan XY du piège optique. Générer une série d&#39;ondes carrées dans LabView et les envoyer à l&#39;AOD de façon répétitive tourner le faisceau laser sur et en dehors. Soigneusement contrôler l&#39;intensité du laser et la durée de l&#39;état d&#39;empêcher le chauffage de la chambre de mesure. En règle générale, l&#39;utilisation d&#39;environ 2 mW de puissance laser (mesurée à l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif) et envoyer des impulsions de 200 ms (marche) et 500 ms (éteinte). L&#39;amplitude de la place wave envoyé à l&#39;AOD devrait être d&#39;environ 0,5 V. </li><li> Regarder la microsphère que le piège est sans cesse sous tension et hors tension et noter si le laser induit une direction préférentielle au mouvement de la microsphère. Tout en réglant la position de manière itérative à la fois dans la microsphère directions X et Y, en contrôlant le piezostage, le mouvement aléatoire de la microsphère doit devenir isotrope dans le plan XY, mais sensiblement limité lorsque le laser est en marche. </li><li> Ensuite, aligner le bourrelet dans la direction Z. Nouveau pulser le faisceau laser sur et hors tout, cette fois, à mesurer simultanément le déplacement axial des microsphères en temps réel. Centre de la scène à l&#39;intérieur de la région linéaire, qui est le point où le déplacement Z est le plus grand. </li><li> Après un alignement soigneux dans la direction Z, il est impératif de vérifier que le piège est toujours centrée dans le plan XY. Si l&#39;alignement XY a changé, à la fois l&#39;alignement XY et Z doit être répété jusqu&#39;à ce que la microsphère est bien centré sur les troisaxes. </li><li> Pour l&#39;étirage de l&#39;ADN, la rampe de l&#39;intensité du laser par l&#39;envoi d&#39;un signal de tension à l&#39;OD, de 0 V à 0,5 V par pas de 0,025 V. Dans chaque étape, record 400 trames à 100 images par seconde et les moyens pour obtenir le déplacement axial. </li><li> Les courbes de force d&#39;extension peuvent maintenant être tracée et s&#39;adapter à un modèle modifié de WLC 11 (voir Matériel supplémentaire B). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Nous présentons des courbes de vulgarisation de force pour deux séquences d&#39;ADN: un pb 1298 et une séquence de 247 pb, cette dernière étant la plus courte séquence, nous avons été en mesure d&#39;étirer de manière reproductible. Pour de courts tronçons de l&#39;ADN, le classique Worm-Like Chain (WLC) modèle n&#39;explique pas entièrement la relation d&#39;extension vigueur parce que, à ces échelles de longueur, il faut tenir compte des effets de taille finie et de vulgarisation force nulle résultant de contraintes de limitation. Les mesures d&#39;extension de force, doivent donc être ajusté en utilisant un modèle modifié WLC qui a une effive longueur de persistance et d&#39;une extension vigueur zéro comme paramètres d&#39;ajustement, décrits plus loin dans les documents supplémentaires. Pour des longueurs de contour de grandes ADNdb, la longueur de persistance efficace est tout simplement la longueur de persistance nominale (~ 50 nm) et l&#39;extension vigueur zéro peut être négligée. Cependant, comme la longueur du contour devient plus courte est la longueur de persistance effective diminue bien en dessous de 50 nm et l&#39;ADN, même sous la force de zéro, montre une extension significative. Les données et les ajustements correspondants des courbes d&#39;extension de force sont présentés sur la Fig. 5 pour les deux séquences. De la WLC modification s&#39;inscrit, nous avons déterminé les longueurs de persistance efficaces à 35 nm pour l&#39;ADN 1298 bp et 25 nm à 247 pb d&#39;ADN. À titre d&#39;illustration, nous présentons des mesures individuelles des courbes de force d&#39;extension pour chaque séquence. Dans la pratique, on pourrait répéter les mesures plusieurs fois et d&#39;obtenir les résultats moyens ainsi que les erreurs-types. Il faut aussi noter that après l&#39;obtention de chaque courbe, il est impératif de s&#39;assurer que la microsphère reste piégé et correctement positionné dans la région linéaire, sinon la microsphère doit être réaligné comme décrit précédemment dans le protocole. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> Figure 1: Principe de axiales pinces optiques. (Gauche) conventionnel piège pinces optiques au voisinage du foyer. La perle est ensuite déplacé latéralement à la lamelle d&#39;exercer une tension. (À droite) en axiales pinces optiques, une microsphère est piégé loin de la mise au point, dans la région linéaire du potentiel optique. Dans cette configuration, le polymère est maintenu sous tension constante pour une gamme d&#39;extensions. En outre, l&#39;augmentation de l&#39;intensité du laser se déplace la microsphère dans la direction axiale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> Représentation schématique de la figure 2Axiales pinces optiques de lumière laser (1064 nm Nd: YVO 4). Est divisé en deux faisceaux en passant à travers un séparateur de faisceau polarisant (PBS). La manipulation de faisceau, passe à travers un déflecteur acousto-optique (OD) et le faisceau d&#39;étalonnage peut être réglé indépendamment en utilisant des lentilles télescopiques. Les deux faisceaux sont ensuite recombinés en utilisant un autre PBS et focalisé sur l&#39;échantillon par un objectif de haute NA. Simultanément, en fond clair d&#39;éclairage utilisé pour suivre la microsphère, traverse l&#39;échantillon, est infrarouge (IR) et est ensuite filtré imagée par deux caméras CCD, dont l&#39;une prend les mesures tandis que l&#39;autre dans le cadre d&#39;un système de commande à rétroaction. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> La figure 3 étalonnage position axiale. Pour étalonner la position axiale, on acquiert des images défocalisées d&#39;un cordon collé à la chambre de lamelle à différentes positions axiales de la scène. La taille de la microsphère est donnée par la distance entre son centre et la position de l&#39;intensité du pic de l&#39;anneau lumineux formé autour de l&#39;image de la microsphère. L&#39;insert présente la répartition d&#39;intensité radiale qui donne la taille de la perle. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> La figure 4 principe de cartographie du potentiel optique. Pour tracer la force optique du faisceau de manipulation, le déplacement axial qu&#39;il induit sur ​​une microsphère piégé dans un faisceau d&#39;étalonnage est beaucoup plus forte mesurée. Le centre de la région linéaire, où ce déplacement est maximum est situé. Le Groupe optique vs courbe de position axiale peut être intégrée à trouver le potentiel optique. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Figure 5 Courbe Extension de la Force. Données sont communiquées pour 1298 un hasard pb et 247 pb (en médaillon) Segment d&#39;ADN double brin tendu par axiales pinces optiques. Les points de données ont été ajustées au modèle WLC modification de l&#39;équation. 3 (trait plein) et a donné la persistance des longueurs effectives de 34 nm et 25 nm respectivement pour le 1298bp et 247bp.

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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l&#39;extension de l&#39;échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d&#39;une protéine à l&#39;ADN ou l&#39;intensification rapide d&#39;un moteur moléculaire le long d&#39;un filament. Diverses méthodes passives d&#39;application...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto-optique déflecteur </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif Microscope </td><td> Olympe </td><td> Planapo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Stade Piezo </td><td> Mad Labs Ville </td><td> Nano-LP100 </td><td> Platine XYZ </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> PixeLINK </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodétecteur </td><td> Électro-Optique Technologie </td><td> HE-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Perles de polystyrène </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800 nm, la streptavidine recouvert </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Du mouton </td></tr><tr><td> Amorces </td><td> MWG opéron </td><td> Oligos personnalisés </td><td> Une amorce: la biotine Autres: digoxigénine </td></tr><tr><td> Réactifs de PCR </td><td> Nouvelle-Angleterre Biolabs </td><td> Taq polymérase, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Lamelle </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> D&#39;autres produits chimiques pour tampon </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Documents complémentaires Coefficient de frottement hydrodynamique A. Pour la détermination du coefficient de frottement hydrodynamique de la microsphère près de la surface, on peut utiliser les 5,10 extension suivants: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où le raccourci suivant hcomme cela a été mis en place: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Équation 2" /> Le coefficient de frottement est définie en termes de la viscosité du fluide η et le rayon de la microsphère, la microsphère avec le centre, situé η une distance au-dessus de la surface. La somme converge assez bien quand il est étendu à une dizaine de termes. B. Influence de la position axiale sur l&#39;étalonnage Raideur L&#39;étalonnage de la rigidité piège implique un compromis entre la précision de l&#39;étalonnage, ce qui augmente avec la distance à partir de la surface, et la position axiale réelle lorsque le piège est utilisé expérimentalement. En général, le piège est calibré à environ 800-1000 nm de la surface, qui est supérieure à l&#39;état réel expérimentale. C. Mise à jour Worm-Like Chain (WLC) Modèle Les courbes de vulgarisation de force peut être adapté à une modification WLC modèle qui tient compte des effets d&#39;exclusion de volume à la force optique zéro comme suit: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="L&#39;équation 3" /> où F est la force opt optique, x o est un paramètre propre à l&#39;extension de la force de zéro, x opt est l&#39;extension sous effort, l est la longueur du contour de l&#39;ADN, et l * p est un paramètre de forme pour une seconde efficace &quot; longueur de persistance &quot;. wlc F est donnée par le modèle habituel WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="L&#39;équation 4" /> où ε est l&#39;extension de l&#39;ADN par rapport.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Une seule molécule d&#39;ADN techniques d&#39;étirement des longueurs de contour moins d&#39;un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d&#39;ADN 1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l&#39;ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l&#39;empaquetage de l&#39;ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine 3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l&#39;ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l&#39;ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases. Le principal obstacle à étirer courts segments d&#39;ADN, c&#39;est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l&#39;étape 5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l&#39;angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l&#39;ADN est attaché, est très raide pour l&#39;ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l&#39;extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l&#39;asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l&#39;extension. D&#39;autres méthodes de l&#39;ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l&#39;étirement d&#39;ADN d&#39;environ une longueur d&#39;onde, au cours de laquelle les effets d&#39;interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l&#39;un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l&#39;on peut utiliser directement le potentiel axiale d&#39;étirer l&#39;ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces. Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l&#39;ADN loin de la lamelle à l&#39;aide d&#39;une force axiale constante de pinces optiques 7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l&#39;intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l&#39;ADN qui s&#39;étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d&#39;une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d&#39;observation pratiquement illimitées.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Nous illustrons l&#39;utilisation d&#39;une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d&#39;ADN courts. En étirant l&#39;ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d&#39;étudier les molécules d&#39;ADN plus court ~ 100 nm.

S&#39;étendant de courtes séquences d&#39;ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

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Bioengineering

13.0K vues.  University of Michigan. Nous illustrons l'utilisation d'une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d'ADN courts. En étirant l'ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d'étudier les molécules d'ADN plus court ~ 100 nm.

Vidéo: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Recherche

Bio-ingénierie

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantification de l’organisation du collagène fibrillar avec des outils curvelet à base de transformation

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...