Este trabalho foi financiado pelo Prémio Carreira Burroughs Wellcome na Interface Científica (ARD), o Instituto Nacional de Saúde através do Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award 1-DP2-OD007078 (ARD), o William Jr. Bowes Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e do Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Younger predoctoral (JC). Os autores agradecem James Spudich para emprestar equipamentos de microscopia.

1. Preparação célula de fluxo <ol><li> Lamelas (# 1.5, 22x22 mm e 22x40, VWR) são limpos usando sonicação. <ol><li> Adicionar as lamelas de um pequeno recipiente de vidro capaz de manter lamelas e encaixando no sonicador (ver passo 2). </li><li> Encher o recipiente com isopropanol e sonicar num sonicador de banho durante 20 minutos. </li><li> Descartar o isopropanol e enxaguar as lamelas com quantidades copiosas de água desionizada produzido por um aparelho de MilliQ Barnsted ou dispositivo semelhante. Encher o recipiente com água e sonicar durante 20 minutos. </li><li> Após sonicação, secar as lamelas em uma corrente de filtrado, o ar livre de poeira. Use apenas lamelas que aparecem limpos (sem manchas). </li><li> Gentilmente chama as lamelas por alguns segundos para limpá-los de qualquer poeira restante, e umidade: passar as lamelas através de uma chama de gás produzido com um bico de Bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamela devido ao excesso de calor. Este passo remove superfície residualcontaminantes. </li></ol></li><li> Usando dupla face fita adesiva, prenda as duas lamelas juntos. Cortar a fita ~ 3 cm de comprimento e 0,3 cm de largura. Coloque a fita sobre lamínula 22x40 milímetros deixando um canal de 1,6 centímetros no meio. Usar uma ponta de pipeta suavemente para pressionar para baixo sobre a lamela para assegurar que a fita tem adequadamente aderido. </li></ol> 2. Configuração Pinças magnética e Calibração <ol><li> Pinças magnéticas foram configurados usando permanentes de terras raras ímãs, como descrito anteriormente 10,12. Um alumínio suporte em L foi construído com um furo de diâmetro 1 mm e montado sobre uma vertical z-tradutor (Thorlabs) para modular a altura da pinça. Dois permanentes de terras raras ímans foram ligados ao suporte em ambos os lados do orifício para criar a armadilha magnética (Figura 1). </li><li> Preparação de ADN: DNA de fago lambda rotulado a sua 5 &#39;e 3&#39; termina com biotina e digoxigenina (IDT DNA, San Diego, CA) foi utilizado para calibrar o magpinças magnéticos. <ol><li> Misturar 50 uL de 4 nM λ-DNA com 2 ul de 40 nM de biotina conjugado oligonucleótido e aquecer a 60 ° C durante 10 minutos. Em seguida, arrefecer lentamente à temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Adicionar ligase de DNA de acordo com as especificações do fabricante e ligar à temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Adicionar 2 uL de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incube à temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Adicionar 1,5 uL de 10 mM ATP e continuar a ligadura do oligonucleótido digoxigenina conjugado com o λ-DNA durante 3 horas. </li><li> Remover os oligonucleótidos em excesso eo usando DNA-ligase de 100 kDa filtros de spin (Microcon Ultracell YM-100). Um total de 1000 vezes troca de tampão em tampão TE é adequado para eliminar os oligos em excesso. Nota: É importante não utilizar velocidades de rotação&gt; 500xG porque irá conduzir à ruptura do ADN. </li><li> Examinar uma amostra do ADN através de electroforese num gel de agarose a 0,7% para assegurar que o DNA inão é desnaturado ou cortado. </li><li> Medir a concentração de DNA. A utilização de um espectrómetro de UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific) é recomendado porque o volume de amostra disponível pode ser muito pequena. </li></ol></li><li> Prepare-se células de fluxo, tal como descrito na seção 1. </li><li> Para a fixação do DNA para a célula de fluxo, adicionar o anticorpo anti-digoxigenina (ovinos IgG; 1 ug mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Alemanha) e permitir que ele adere à superfície do vidro durante 15 minutos. </li><li> Passivar a superfície da célula de fluxo para evitar colagem não-específica do DNA por adição de 2 mg mL -1 de BSA, 0,1% de Tween-20 em 1x PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Repita o passo 2.5. </li><li> Adicionar 50 pM de fuctionalized λ-DNA e permitir que a associar à lamela durante 15 minutos. </li><li> Lava-DNA em excesso com 1x PBS. </li><li> Adicionar grânulos revestidos estreptavidina-superparamagnéticas (1 grânulos iM = 2 ug mL -1, 2,8 grânulos iM = 20 ug mL -1 </sup&gt;) e permitir que eles atribuem ao DNA imobilizado por 15 minutos. </li><li> Lavar o excesso de grânulos com 1x PBS. </li><li> Calibração Pinça Magnética <ol><li> Mova os ímãs permanentes para uma posição que está longe da superfície da amostra (&gt; 15 mm). </li><li> Coloque a célula de fluxo preparado no microscópio. </li><li> Mova os ímãs permanentes para a posição acima da célula de fluxo. </li><li> Escolha o plano focal da λ-DNA contas funcionalizados, concentrando-se nas contas de distância de ambas as superfícies de vidro. O plano focal correcta é aquele em que os grânulos têm um centro desejados brilhante. </li><li> Faça um vídeo de movimento talão de 80 Hz ou superior a 500 frames. </li><li> Mova o íman mais perto da superfície da amostra. Para distâncias superiores a 5 mm, se mover em incrementos de 1 mm. Para distâncias entre 1 mm e 5, mover-se em incrementos de 0,5 mm. Para distâncias inferiores a 1 mm, mover-se em incrementos de 0,25 mm. </li><li> Repita os passos 2.11.5 e 2.11.6 em cada posição novo ímã. </li><li> Para cada dadodefinido, controlar o centro dos grânulos utilizando um ajuste gaussiano 2D. </li><li> Calcule a força através de flutuações browniano por meio de: </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> onde k B T é a energia térmica Boltzmann, L é o comprimento de λ-DNA, e &lt;x 2&gt; é a variância na posição centróide. <ol start="10"><li> Confirmar a exatidão das forças verificando o cálculo da força através de um ajuste de energia do espectro Lorentzian a fim de encontrar a freqüência rolloff. Força aplicada é relacionada com a frequência rolloff pela relação: </li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> Onde 0 f é a frequência rolloff, a é o raio do grânulo, e μ é a viscosidade do fluido 12. </li></ol> 3. Collagen Peptide anexo para as células de fluxo A fim de proporcionar um exemplo concreto para a aplicação da nossa metodologia, descrevemos trabalho recente no nosso laboratório, que caracteriza a proteólise de um péptido trimérico colagénio modelo. Prevemos que esta abordagem geral pode ser amplamente aplicado a outras proteínas e polinucleótidos. <ol><li> O péptido modelo de colagénio consiste de um N-terminal His-6x para a purificação, seguido por uma etiqueta de 5x myc, (GPP) 10 para aplicar a formação de hélice tripla, o colagénio a1 resíduos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que formam a MMP- 1 local de reconhecimento, a sequência de foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), e uma KKCK C-terminal para facilitar a marcação com biotina-maleimida. Foldon deriva do fibritin proteína T4-fago, e estabiliza trímeros modelo de colagénio quando fundido em uma ou outra a N - ou C-terminal 13,14. </li><li> O péptido de colagénio e MMP-1 proteínas foram expressas e purificada como descrito anteriormente 4,15. &lt;/ Li&gt; <li> Adicionar anti-myc (15 ug ml -1) para a célula de fluxo e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que o anti-myc para anexar à superfície da célula de fluxo. </li><li> Passivar a célula de fluxo para evitar ligação não específica de proteínas utilizando 5 mg mL -1 BSA da mesma forma como descrito no passo 2.5. </li><li> Adicionar 150 pM péptido de colagénio e permitir que ele para anexar o anticorpo através da marca de myc durante 45 minutos. </li><li> Lave o colágeno em excesso com tampão PBS. </li><li> Adicionar contas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina (1 contas mM = 2 mg mL -1 e 2,8 mM contas = 20 mg mL -1) e permitir que eles atribuem às moléculas de colágeno por 45 minutos. As pérolas de 1 uM deve ser diluído até à concentração desejada em PBS. As pérolas de 3 uM deve ser separado da solução usando ímans fortes, em seguida, resolubilized em PBS. Este processo deve ser repetido 3 vezes. Percebemos que este passo é essencial para a get as pérolas de 3 uM de se ligar a superfície imobilizada péptido de colagénio. </li></ol> 4. Ensaio Proteólise Força <ol><li> Uma vez que a célula de fluxo é montado com o péptido de colagénio e as esferas magnéticas, a imagem da célula de fluxo na armadilha magnético sob baixa, ~ força pN 1. Na nossa experiência, uma subpopulação das pérolas é por vezes fracamente aderida à superfície de uma forma não específica. A aplicação de força modesto assegura que estas pérolas são libertados. </li><li> Adicionar enzima activada para a célula de fluxo. Neste caso a MMP-1 foi pré-activado por adição de 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubados a 37 ° C durante 3 horas. A ativação foi verificada utilizando SDS-PAGE. </li><li> Logo que a célula de fluxo é re-introduzido no aparelho pinças magnético, gravar um vídeo spanning alguns campos de visão, tipicamente rendendo várias centenas de pérolas anexas. Este será t = 0. </li><li> Repita o mesmo processo de gravação de vários campos de vista (quando regressava to o mesmo campo de visão) em pontos regulares de tempo, até que todas as esferas de separar ou não proteólise ainda é perceptível. </li><li> A análise dos dados cinéticos <ol><li> Conte com as contas em vários campos de vista em diferentes momentos e média-los. Normalizar o número de esferas, dividindo o número médio de grânulos em cada ponto de tempo pelo número de pérolas em t = 0. Isso garante que podemos comparar as taxas de proteólise de experiências diferentes, porque o número absoluto de contas será diferente de experimento para experimento. </li><li> Traça-se a razão como uma função do tempo. Neste caso, equipado-lo para um decaimento exponencial mais uma constante. </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> onde f (t) é a razão entre as esferas associadas (ou moléculas de colagénio unproteolyzed), t é o tempo, uma é a fracção de grânulos ligados por um tirante de colagénio, b é a taxa de decaimento constante, e cé a fracção de grânulos que estão ligados não especificamente. <ol start="3"><li> A mesma experiência é repetida em diferentes força e MMP-1 concentrações para elucidar o efeito da força sobre a proteólise de colagénio por MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Os resultados representativos O protocolo acima descreve uma nova utilização de uma pinça magnética (Figura 1) para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática. Nós calibrado as pinças para 1 mícron e 3 uM grânulos utilizando tanto a magnitude das oscilações observadas brownianos e cálculo da frequência roll-off em posições diferentes de íman (Figura 2). Nas experiências de proteólise de força, a configuração é semelhante, excepto que o ADN é substituído com colagénio (Figuras 3, 4). O número normalizado de pérolas restantes podem ser traçados em função do tempo para encontrar as taxas de proteólise (Figura 5), e este processo pode serrepetido para várias concentrações de enzimas e de forças. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do processo magnético armadilha de calibração (não à escala). Dois permanentes imans de terras raras criar um campo magnético que puxa a superparamagnético grânulo. Traduzir o íman cima e para baixo ajusta a força aplicada. As contas são fotografada utilizando um microscópio de campo brilhante convencional com a luz que passa através de um orifício entre os dois imans Inset:. Imagem tirada com um objectivo de ar de 40x. Os afiadas, pontos redondos correspondem aos grânulos que aderem à superfície lamela. Os objetos fora de foco são esferas separadas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> Figura 2. A representação gráfica da força calibrado como uma função da distância a partir do magneto superfície da amostra durante 1 mM (esquerda) e 2,8 mM (direita) do grânulos. Os dados estavam aptos para a função empírica <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> , Onde x é a distância entre o íman. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 para os grânulos de 1 pm e uma = 140, b = 3,10 e c = 1,86 para os 3 grânulos uM. Estes valores são específicos para o nosso instrumento específico e geometria experimental, e cada instrumento deve ser calibrado individualmente. As barras de erro em cada ponto representa uma variabilidade ~ 10% em força aplicada sobre um grânulo de base do grânulo, devido à variabilidade no tamanho do grânulo. A força aplicada é proporcional ao volume dos grânulos, e que o volume do grânulo varia ~ 9% sobre a média (de acordo com as especificações do fabricante). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> Figura 3. Força configuração ensaio proteólise (não à escala). O trímero modelo de colagénio está ligado à superfície do lamela via myc / anti-myc conjugação. As pérolas revestidas de estreptavidina-superparamagnéticas estão ligados a os trímeros de colagénio através de uma ligação biotina-estreptavidina. Activada MMP-1 cortes do colagénio ao longo do tempo, causando as pérolas para separar a partir da superfície e afastar-se do plano focal. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> Figura 4. Dos desenhos esquemático de proteólise como uma função do tempo. O desenho mostra um campo de vista da amostra ao longo do tempo como proteólise ocorre. Ao longo do tempo, a MMP-1 cortes o colagénio e as contas de vidro separar e afastar-se do plano focal sob a influência do campo magnético. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> As taxas de proteólise Figura 5. Dependem força aplicada 16. São mostrados os dados coligidos a 1,0 pN (3 uM MMP-1; preto), 6,2 pN (3 uM MMP-1; vermelho) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magonta). As taxas de proteólise (parâmetros de ajuste) são: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN), e 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). A fracção de grânulos unproteolyzed em pontos de tempo longo (&gt; 15 minutos) permanece aproximadamente constante em toda a ~ 0,25 experiências diferentes. As barras de erro correspondem ao estatísticas Poisson reflectindo o número de observações em cada ponto de tempo. O erro em cada ponto de tempo para as esferas n é n 1/2. O erro na fracção de grânulos ligados foi calculada por erro propagation.1 grânulos mM foram usados ​​para 1,0 pN e experiências 6.2 pN e 2,8 uM grânulos foram utilizados para experiências de 13 pN.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve uma nova utilização para uma técnica clássica molécula única. Pinças magnéticas permitir médio e alto rendimento ensaios única molécula de uma forma custo-eficiente. No entanto, como todas as técnicas experimentais que existem desafios e armadilhas potenciais. Limitações de pinças magnéticas Em comparação com uma armadilha óptica a resolução espacial e temporal de um aparelho de MT é baixa. Além disso, as forças gerada...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Micro tampa de vidro # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro tampa de vidro # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Anticorpo </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-Aminophenylmercuric Acetato </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marcado com biotina oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> Digoxigenina marcada oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> Colágenogene peptídeo </td><td> DNA 2.0 </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> MMP-1 ADNc </td><td> Harvard Banco de Dados Plasmid </td><td></td></tr><tr><td> z-tradutor </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Controlador de Servo para tradutor </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

A geração e detecção de forças mecânicas é um aspecto onipresente de fisiologia celular, com relevância direta para câncer de metástase 1, 2 e aterogênese cicatrização 3. Em cada um destes exemplos, as células tanto exercer força sobre os seus arredores e, simultaneamente, remodelação enzimaticamente a matriz extracelular (ECM). O efeito das forças sobre ECM tornou-se assim uma área de grande interesse devido à sua provável importância biológica e médica 4-7. Técnicas única molécula, como a captura óptica 8, microscopia de força atômica 9, e pinças magnéticas 10,11 permitir aos pesquisadores sondar a função de enzimas em um nível molecular, exercendo forças em proteínas individuais. Destas técnicas, pinças magnéticas (MT) são notáveis ​​pelo seu baixo custo e alto rendimento. MT exercem forças na gama de 1-100 ~ pN e pode fornecer milissegundo resolução temporal,qualidades que são bem adaptado para o estudo do mecanismo de enzima no nível molécula única 12. Relatamos aqui um ensaio de MT altamente paralelizável para estudar o efeito da força sobre a proteólise das moléculas de proteína única. Apresentamos o exemplo específico da proteólise de um péptido de colagénio trimérico por metaloproteinase de matriz 1 (MMP-1), no entanto, este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outros substratos e proteases.

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

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11.5K visualizações.  Stanford University. Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.