Bu çalışma Bilimsel Arabirimi (ARD), NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Yüksek Lisans Bursu (ASA de Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklenmiştir ) ve Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü Younger predoctoral Bursu (JC). Yazarlar mikroskopi ekipman loaning James Spudich teşekkür ederim.

1. Akış Hücre Hazırlık <ol><li> Lamelleri (# 1.5, 22x22 mm ve 22x40 mm, VWR) sonication kullanılarak temizlenir. <ol><li> Lamelleri tutarak ve (bkz: adım 2) sonikatör uyum gösterme yeteneğine sahip küçük bir cam kaba lamelleri ekleyin. </li><li> Izopropanol ile kabın doldurmak ve 20 dakika boyunca bir banyo içinde sonikatör ses dalgalarına maruz. </li><li> Izopropanol atın ve bir Barnsted MilliQ aparatı veya benzer bir cihaz tarafından üretilen deiyonize bol su ile lamelleri durulayın. Su kabı doldurun ve 20 dakika boyunca ses dalgalarına maruz. </li><li> Sonikasyon sonra, filtrelenmiş ve tozsuz bir hava akımı içinde lamelleri kurutun. (Yani hiçbir leke) temiz görünen sadece lamelleri kullanın. </li><li> Yavaşça alev birkaç saniye lamelleri kalan toz ve nem onları temizlemek için: aşırı ısı nedeniyle coverslip çarpıtmak için özen, bir Bunsen beki ile üretilen bir gaz alevi ile lamelleri geçmektedir. Bu adım artık yüzeyi temizlerkirleticiler. </li></ol></li><li> Çift taraflı seloteyip kullanarak, iki arada lamelleri takın. Bantı kesiniz ~ uzunluğu 3 cm, genişliği 0,3 cm. Ortasında 1.6 cm kanalı terk 22x40 mm coverslip üzerindeki bandı takın. Yavaşça bant yapıştırılır düzgün emin olmak için coverslip basmaya bir pipet kullanın. </li></ol> 2. Manyetik Cımbızlar Kurulum ve Kalibrasyon <ol><li> Manyetik cımbız 10,12 önceden açıklandığı gibi kalıcı nadir toprak mıknatıslar kullanarak kurulum vardı. Bir alüminyum L-braketi, 1 mm çapında iğne deliği ile inşa ve dik bir z-çevirmen (Thorlabs) cımbız yüksekliği modüle etmek için monte edildi. İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar manyetik tuzak (Şekil 1) oluşturmak için iğne deliği her iki tarafında üzerinde dirsek bağlanmıştır. </li><li> DNA hazırlığı: 5 &#39;ve 3&#39; olarak etiketlenmiş lambda faj DNA biotin ve digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) ile bitiyorsa, mag kalibre etmek için kullanılanmanyetik cımbız. <ol><li> 10 dakika boyunca 60 ° konjuge oligonükleotid ve ısı ° C biyotin 40 nM olan, 2 ul 4 nM λ-DNA 50 uL karıştırılır. 1 saatten fazla oda sıcaklığında Sonra yavaş yavaş serin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA ligazı ekleyin ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında ligate. </li><li> 45 dakika boyunca oda sıcaklığında 400 nM digoxigenin konjuge oligonükleotid ve inkübe 2 uL ekleyin. </li><li> 10 mM ATP 1,5 uL ekleyin ve 3 saat boyunca λ-DNA digoxigenin konjuge oligonükleotid ligasyonu devam etmektedir. </li><li> 100 kDa dönüş filtreleri (Microcon UltraCell YM-100) ile aşırı oligonükleotidler ve DNA ligaz çıkarın. TE tamponunda 1000 kat tampon değişimi toplam aşırı oligos kaldırmak için yeterlidir. Not: DNA kesme yol açacaktır çünkü dönüş hızları&gt; 500xG kullanmak önemlidir. </li><li> Bu DNA i sağlamak için bir% 0.7 agaroz jel üzerinde elektroforez yoluyla DNA&#39;nın bir numune incelemeks doğallığından veya makaslanmış değil. </li><li> DNA konsantrasyonu ölçün. Uygun numune hacmi çok küçük olabilir, çünkü bir Nanodrop UV-Vis spektrometre (Thermo Scientific) kullanılması önerilir. </li></ol></li><li> 1. bölümde tarif edildiği gibi akış hücreleri hazırla. </li><li> Akış hücresi için DNA eki için, anti-digoxigenin antikor ekleyin (koyun IgG; 1 mg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Almanya) ve 15 dakika boyunca cam yüzeye yapışma sağlar. </li><li> 1x PBS içinde 2 mL -1 mg BSA,% 0.1 Tween-20 ekleyerek DNA spesifik olmayan yapışmasını önlemek için akış hücresi yüzeyinde dinginleştirmek. 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Adım 2.5 tekrarlayın. </li><li> Λ-DNA fuctionalized 50 pM ekleyin ve 15 dakika coverslip eklemek için izin verir. </li><li> 1x PBS ile aşırı DNA silsin. </li><li> 2,8 um boncuklar = 20 ug mL -1; streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik (1 um boncuklar = 2 ug mL -1 ekleme </skadar&gt;) ve onlara 15 dakika boyunca hareketsiz DNA eklemek için izin verir. </li><li> 1x PBS ile aşırı boncuk silsin. </li><li> Manyetik Cımbızlar Kalibrasyon <ol><li> Uzağa Örnek yüzey (&gt; 15 mm) olduğu bir konuma hareket ettirmek daimi mıknatıslar. </li><li> Mikroskopta hazırlanan akış hücresi yerleştirin. </li><li> Akış hücresi üzerindeki pozisyona daimi mıknatıslar taşıyın. </li><li> Uzaklıkta cam yüzeyler hem boncuklar odaklanarak λ DNA fonksiyonlandırılmış boncuk odak düzlemi seçin. Doğru odak düzlemine istenilen boncuk parlak bir merkeze sahip olduğu biridir. </li><li> 500 kare için 80 Hz veya daha az boncuk hareket bir video çekin. </li><li> Yakın Örnek yüzeyine mıknatıs hareket eder. 5 mm aşan mesafeler için 1 mm artışlarla taşımak. 1 ve 5 mm arasındaki mesafeler için 0.5 mm artışlarla taşımak. 1 mm&#39;den daha az mesafeler için 0,25 mm artışlarla taşımak. </li><li> Her yeni cazibe konumunda adımları 2.11.5 ve 2.11.6 tekrarlayın. </li><li> Her bir veri içinayarlamak, 2B Gauss uyum kullanarak boncuk merkezi izleyebilirsiniz. </li><li> Kullanarak Brownian dalgalanmalar yoluyla gücü hesaplayın: </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> k B T Boltzmann termal enerji burada, L λ-DNA&#39;nın uzunluğu, &lt;X 2&gt; sentroid pozisyonu içinde varyans. <ol start="10"><li> Rolloff frekansını bulmak için bir güç spektrumu Lorentz oturması ile kuvvet hesabı kontrol ederek güçleri doğruluğunu onaylayın. Uygulanan kuvvet ile ilişkili rolloff frekansı ile ilgilidir: </li></ol><img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> F 0 rolloff frekansı olduğu, bir boncuk yarıçapı, ve μ akışkan viskozitesi 12&#39;dir. </li></ol> 3. Akış Hücreler Kolajen Peptid Eklenti Bizim metodoloji uygulanması için somut bir örnek vermek için, biz bir trimeric kollajen modeli peptid proteoliz karakterize laboratuvarımızda son çalışmalarını açıklamak. Biz bu genel yaklaşımın genel olarak diğer proteinlerin ve polinükleotidler uygulanabilir tahmin ediyoruz. <ol><li> Kollajen modeli peptid üçlü sarmal oluşumunu zorlamak için 10 5x myc etiketi, (GPP), kollajen takip arınma, bir N-terminal 6x His-tag oluşur oluşturan α1 artıkları 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), MMP- 1 tanıma sitesinin, foldon sekansı (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ve bir C-terminali KKCK biyotin-maleimid ile etiketlenmesi kolaylaştırmak için. Foldon T4 faj protein fibritin türemiştir ve N ya da erimiş zaman kolajen modeli trimerler stabilize - ya da C-terminali 13,14. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 4,15 kolajen peptid ve MMP-1 proteinleri ifade edilmiş ve saflaştırılmış edildi. &lt;/ Li&gt; <li> Anti-myc akış hücresi yüzeyinde bağlanmasını sağlamak için anti-myc (15 ug mL -1) 20 dakika oda sıcaklığında inkübe akış hücresi ve eklemek. </li><li> Adım 2,5 tarif edildiği gibi aynı şekilde 5 mg mL -1 BSA kullanılarak proteinlerin spesifik olmayan bağlanma önlemek için akış hücresi dinginleştirmek. </li><li> 150 pM kolajen peptid ekleyin ve 45 dakika myc etiketi aracılığıyla antikor eklemek için izin verir. </li><li> PBS tamponu kullanarak fazla kolajen silsin. </li><li> Streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuk (1 mikron boncuklar = 2 mg mL-1 ve 2.8 mikron boncuk = 20 mg mL-1) ve onlara 45 dakika boyunca kollajen moleküllerine eklemek izin. Ekle 1 um boncuklar PBS içinde istenen konsantrasyonuna seyreltildi edilmelidir. 3 um Boncuklar daha sonra PBS ile resolubilized kuvvetli mıknatıslar, kullanarak çözeltisi ayrılmalıdır. Bu süreç, 3 defa tekrarlanır edilmelidir. Biz bu adımı ge için gerekli olduğunu farkt 3 um boncuklar yüzeyi-immobilize kolajen peptit bağlamak. </li></ol> 4. Kuvvet Proteoliz Assay <ol><li> Bir kez akış hücresi düşük, ~ 1 pN kuvvet altında manyetik tuzak görüntü akış hücresi, kolajen peptit ve manyetik boncuklar ile monte edilir. Deneyimlerimize göre, boncuklar bir alt bazen zayıf bir non-spesifik şekilde yüzeye yapıştırılır. Mütevazı kuvvetin uygulanması bu boncuklara kurtarılmış olmasını sağlar. </li><li> Akış hücresi için aktif enzim ekleyin. Bu durumda, MMP-1 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric asetat) ilave edildi ve 3 saat için 37 ° C&#39;de inkübe tarafından önceden aktive edildi. Aktivasyon SDS-PAGE kullanılarak teyit edildi. </li><li> Yakında akış hücresi manyetik cımbız cihazın içine yeniden tanıtıldı olarak, genellikle birkaç yüz ekli boncuk veren, bakış birkaç alanları kapsayan bir video kaydedebilirsiniz. Bu, t = 0 olacaktır. </li><li> T dönerken görünümü çeşitli alanlarda kayıt aynı işlemi (tekrarlayınTüm ayırmak boncuk veya başka proteoliz ayırt oluncaya kadar, normal süre noktalarda aynı görüş alanı) o. </li><li> Kinetik veri analizi <ol><li> Farklı zaman noktalarında görüş çeşitli alanlarda boncuk saymak ve onları giriyoruz. T = 0 boncuklar sayısına göre, her bir zaman noktasında boncuklar ortalama sayısına bölünmesiyle boncuklar numarası normalize. Bu boncuk mutlak sayısı deneyden deney farklı olacaktır, çünkü biz, farklı deneyler proteolizin fiyatlarını karşılaştırın sağlar. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak oranı çizilir. Bu durumda, bir üstel bozulma artı bir sabit onu donatılmış. </li></ol><img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> f (t) (ya da kollajen molekülleri unproteolyzed) eklenmiş boncuklar oranı olduğu, t zaman, bir kollajen bir kemer tutturulmuştur boncuklar fraksiyonu, b bozunma oranı sabit olduğu ve Cnon-spesifik bağlı boncuk bölümüdür. <ol start="3"><li> Aynı deney MMP-1 kollajen proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini aydınlatmak için kuvvet ve MMP-1 biyokatalist tekrarlanır. </li></ol></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Yukarıda protokolü enzimatik proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini incelemek için manyetik cımbızları (Şekil 1) arasında yeni bir kullanımını açıklar. Biz gözlenen Brownian dalgalanmaların büyüklüğü ve değişen mıknatıs pozisyonlar (Şekil 2) roll-off frekansı hesabı her ikisini de kullanarak 1 mikron ve 3 mikron boncuk için cımbız kalibre. Kuvveti proteoliz deneylerde, kurulum DNA kolajen (Şekiller 3, 4) ile değiştirilir olması dışında benzer. Kalan boncuk normalleştirilmiş sayı proteoliz oranları (Şekil 5) bulmak için zamanın fonksiyonu olarak çizilebilir ve bu süreç olabilirenzim konsantrasyonu ve güçleri değişen tekrarlandı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> Şekil 1. Manyetik tuzak kalibrasyon işlemini şematik (ölçekli değil). İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar süperparamanyetik boncuk çeker bir manyetik alan oluşturur. Yukarı ve aşağı mıknatıs Tercüme uygulanan kuvvet ayarlar. Boncuklar iki mıknatıs arasındaki bir iğne deliğinden geçen ışık ile geleneksel parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi işlemidir Ankastre:. Image 40x hava amacı ile çekilen. Keskin, yuvarlak lekeler coverslip yüzeyine yapışan boncuk karşılık gelir. Out-of-focus nesneleri müstakil boncuk vardır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> Şekil 2. 1 mikron (solda) ve 2.8 mikron (sağda) boncuk için numune yüzeyinden mıknatıs uzaklığın bir fonksiyonu olarak kalibre kuvvet Arsalars. Veri ampirik fonksiyonu için uygun bulundular <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> , Burada x mıknatıs mesafedir. A = 31.8, b = 5.61, ve c 1 mikron boncuk ve için = 4.39 a = 140, b 3 mikron boncuk = 3.10 ve c = 1.86. Bu değerler, belirli bir cihaz ve deneysel bir geometri özgü olan ve her bir cihazın tek tek kalibre edilmesi gerekir. Her noktada hata çubukları boncuk boyutu değişkenliği nedeniyle boncuk bazında bir kordonu üzerine uygulanan kuvvet bir ~% 10 değişkenlik göstermektedir. Uygulanan kuvvet boncuklar hacmi ile orantılıdır ve boncuk hacmi (üretici özelliklerine göre) ortalama üzerinde ~% 9 değişir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> Şekil 3. Kuvvetleri proteoliz assay kurulum (Not ölçekli). Kollajen modeli trimer m yoluyla lameller yüzeyine yapışık olduğuSK / anti-myc konjugasyon. Streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik bir biyotin-streptavidin bağı ile kolajen trimerler bağlıdırlar. Aktif MMP-1 kesim zamanla kolajen, boncuklar yüzeyden ayırmak ve odak düzlemi uzaklaşmaya neden olur. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> Şekil 4. Zamanın bir fonksiyonu olarak proteoliz şematik çizgi. Karikatür proteoliz zamanla görüş örnek bir alan oluşur gösterir. Zamanla, MMP-1 keser kolajen ve boncuk ayırmak ve manyetik alan etkisi altında odak düzlemi uzaklaşın. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> Şekil 5. Proteoliz oranları uygulanan kuvvet 16 bağlıdır. , 6.2 pN (3 uM MMP-1, kırmızı) ve 13 pN (0.2 uM MMP-1; mage; Gösterildi 1.0 pN (siyah 3 uM MMP-1) toplanan verilerNTA). Proteolizin oranları (uyum parametreleri) şunlardır: 0.22 ± 0.02 dk -1 (1 pN), 0.46 ± 0.09 dk -1 (6.2 pN) ve 2.08 ± 0.18 dk -1 (13 pN). Uzun süre puan (&gt; 15 dakika) unproteolyzed boncuk fraksiyonu farklı deneyler arasında ~ 0.25 yaklaşık sabit kalır. Hata çubukları her noktada gözlem sayısı yansıtan Poisson istatistikleri karşılık gelir. N boncuklar için her bir zaman noktasında hata n, 1/2 &#39;dir. Ekli boncuklar fraksiyonunda hata propagation.1 um boncuklar 1,0 pN ve 6,2 pN deneyler ve 2,8 um boncuklar 13 pN deneyler için kullanıldı için kullanıldı hata hesaplandı.

<ol>
	<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment.">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li><li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li><li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+structure+and+wound+healing.">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li><li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1.">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li><li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+collagen/enzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic,+enzyme-induced+creep.">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li><li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation.">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li><li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin.">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+determination+of+unbinding+force,+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction.">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers+in+cell+biology.">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering.">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li><li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+stabilization+at+atomic+level:+crystal+structure+of+designed+(GlyProPro)10foldon.">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li><li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis.">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li><li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells.">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li><li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers.">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li><li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor.">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li><li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li><li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding.">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, klasik bir tek bir molekül tekniği için yeni bir kullanımını açıklar. Manyetik cımbız, bir maliyet-etkin şekilde yüksek verimli tek bir molekül testleri orta sağlar. Ancak, tüm deneysel teknikler gibi zorluklar ve potansiyel tuzaklar vardır. Manyetik cımbız Sınırlamalar Optik bir tuzak ile karşılaştırıldığında MT aygıtının mekansal ve zamansal çözünürlüğü düşük. Bundan başka, burada açıklanan basit MT tarafın...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligaz </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Antikor </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-Aminophenylmercuric asetat </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotin-maleimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Biotin oligo etiketli </td><td> IDT DNA </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> Digoxigenin oligo etiketli </td><td> IDT DNA </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> Kollajenpeptid gen </td><td> DNA 2.0 </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard Plazmid Veritabanı </td><td></td></tr><tr><td> z-çevirmen </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Çevirmen için servo kontrol </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

Mekanik güçlerin üretme ve algılama kanser metastazı 1, aterogenez 2 ve 3 yara iyileşmesi ile doğrudan ilgili olan, hücre fizyolojisi her yerde görülen bir yönüdür. Bu örneklerin her birinde, hücreler çevreleri üzerinde kuvvet uygularlar ve aynı enzimatik remodel ekstraselüler matriks (ECM) hem de. ECM kuvvetlerin etkisi böylece 4-7 büyük olasılıkla onun biyolojik ve tıbbi önemi nedeniyle önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir. Gibi optik tuzaklama 8, atomik kuvvet mikroskobu 9, ve manyetik cımbız 10,11 olarak tek bir molekülün teknikleri araştırmacılar bireysel proteinler üzerinde kuvvetleri uygulayarak moleküler düzeyde enzim fonksiyonu soruşturma için izin. Bu tekniklerin, manyetik cımbız (MT) Düşük maliyet ve yüksek verimlilik için dikkat çekicidir. MT ~ 1-100 pN aralığında kuvvetleri uygulamak ve milisaniye zamansal çözünürlük sağlayabilir,ayrıca tek moleküllü seviyesi 12 az enzim mekanizmasının çalışma eşleştirilir nitelikleri. Burada tek bir protein moleküllerinin proteoliz tarihinde yürürlüğe etkisini incelemek için son derece parallelizable MT tahlil raporu. Bu matris metalloproteinaz 1 (MMP-1) tarafından bir trimeric kolajen peptid proteolizin spesifik bir örnek sunmak; Bununla birlikte, bu tahlilde kolayca diğer substratlar ve proteazlar incelemek için adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers at JoVE.com

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K Görüntüleme.  Stanford University. Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Video: Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biyomühendislik

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...