Les auteurs tiennent à remercier Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) et Nathaniel Snyder (Université de Pennsylvanie) pour des discussions utiles sur l&#39;étalonnage de masse et le traitement des données. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre R00CA168997. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

1. Préparation de LC-MS réactifs, mise en place d&#39;une méthode de chromatographie, et mise en place de procédures opérationnelles instruments <ol><li> Préparation de solvants LC <ol><li> Préparer 500 ml phases mobiles. A est l&#39;acétate d&#39;ammonium 20 mM et 15 mM d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium à 3% d&#39;acétonitrile / eau, pH final de 9,0; et B est à 100% d&#39;acétonitrile. </li><li> Plafonner de manière lâche la bouteille, placez-le dans un bain sonique de l&#39;eau, et soniquer pendant 10 minutes sans chauffage d&#39;appoint. (Cette étape est de s&#39;assurer que tous les sels d&#39;ammonium se dissolvent complètement et qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air résiduelles.) </li><li> Transférer 250 ml de solvant dans un flacon de 250 ml en verre pour un usage LC-MS, et de garder le reste à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer la solution d&#39;étalonnage bas de gamme de masse. Il est important d&#39;utiliser un mélange d&#39;étalonnage de la gamme basse de masse sur mesure pour les applications métabolomique pour s&#39;assurer que les masses précises sont détectés à de faibles poids moléculaires. <ol><li> Peser 5 mg de deux Sodium fluoracétate et de l&#39;acide homovanillique et les dissoudre dans 5 ml d&#39;eau pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml. Dissoudre le diazinon dans du methanol pour obtenir une concentration finale de 10 mg / ml. </li><li> Pour préparer 1 ml de solution négative faible d&#39;étalonnage de masse, mélange 960 ml d&#39;une solution thermo négatif d&#39;étalonnage avec 20 ml d&#39;fluoroaceate de sodium et une solution d&#39;acide homovanillique. Pour faire 1 ml de solution positive d&#39;étalonnage de faible masse, mélanger 990 ml de solution d&#39;étalonnage thermique positif et 10 ml de solution de diazinon. (La solution d&#39;étalonnage de faible masse doit être conservé à 4 ° C et être préparée tous les 2 mois.) </li></ol></li><li> Calibration de QE-MS à une gamme basse de masse <ol><li> Avant d&#39;effectuer l&#39;étalonnage de gamme basse de masse, effectuer un étalonnage de masse standard (m / z, 150-2,000) dans les modes à la fois positifs et négatifs en fonction des instructions du fabricant. </li><li> Une fois qu&#39;un calibrage de masse régulier passe, réglez la plage de balayage de 60 à 900 m / z dans le panneau de contrôle de l&#39;instrumentet un CID de la source de 25 eV pour le mode positif et 35 eV pour le mode négatif est appliqué. (Cela donnera signaux robustes de la caféine et de l&#39;ion fragment de l&#39;ion sulfate. L&#39;intervalle de balayage est fixé ici, parce que la dernière m / z ne doit pas être plus grand que 15 fois de la m début / z) </li><li> Une fois que la source d&#39;ions est stable, alors effectuer l&#39;étalonnage sur mesure. Remarque: une source stable est définie comme étant inférieure à 10% de la variation de courant ionique totale en mode positif, et moins de 15% en mode négatif. Les ions d&#39;étalonnage et de mesure correspondant à m / z sont indiquées au tableau 1. </li></ol></li><li> Établir l&#39;instrumentation LC-MS pour l&#39;analyse des métabolites polaires. LC est couplé à un QE-MS pour la séparation et la détection de métabolites. <ol><li> Équiper le QE-MS avec une sonde d&#39;ionisation électrospray chauffée (H-ESI). Définissez les paramètres de réglage correspondant à la sonde comme indiqué: la température de chauffage, 120 ° C; gaz de gaine, 30; gaz auxiliaire, 10; balayer gaz, 3; pulvériser tension, 3,6 kV pourmode positif et 2,5 kV en mode négatif. Régler la température du capillaire à 320 ° C, et S-lentille à 55. </li><li> Construire une méthode analyse complète comme suit: Gamme complète de balayage: 60 à 900 (m / z); résolution: 70 000; temps d&#39;injection maximale: 200 ms avec un temps typique d&#39;injection autour de 50 ms; commande automatique de gain (AGC): 3000000 ions. Ces paramètres conduisent à un cycle de travail de l&#39;ordre de 550 ms pour effectuer des analyses en mode à la fois positif et négatif. </li><li> Établir la méthode de chromatographie. Employer une colonne amide (100 x 2.1 mm de diamètre, 3,5 mm) pour la séparation de composé à la température ambiante 13,15. La phase mobile A est tel que décrit ci-dessus, et la phase mobile B est de l&#39;acétonitrile. Utilisez un dégradé linéaire comme suit: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% de B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% de B, et de 20 min, 85% de B. Le débit est de 0,15 ml / min de 0 à 10 min et 15 à 20 min, et 0,3 ml / min 10,5 à 14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Pra séparation des échantillons de métabolites <ol><li> Préparer un solvant d&#39;extraction. Mélanger 40 ml de méthanol (LC-MS grade) et 10 ml d&#39;eau (LC-MS grade) dans un tube de 50 ml, et le garder en -80 ° C congélateur pendant au moins 1 heure avant de l&#39;utiliser. Remarque: Cette procédure et les étapes ci-dessous peuvent être modifiés pour l&#39;extraction des tissus biologiques et des échantillons de fluide. <ol><li> Culture côlon HCT cancer de huit cellules dans trois boîtes de 10 cm ou des plaques à 6 puits avec du milieu de croissance complet, RPMI 1640 additionné de 10% inactivé par la chaleur de sérum bovin fœtal et 100 000 unités / L de pénicilline et 100 mg / L de streptomycine. </li><li> Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, enlever rapidement le milieu, et placez le plat ou la plaque sur le dessus de 13,15 de la glace sèche. Ajouter 1 ml extraction par solvant immédiatement (80% de méthanol / eau), et transférer la plaque au congélateur à -80 ° C. Pour une boîte de 10 cm de côté, ajouter 3 ml de solvant d&#39;extraction dans chaque puits. (Essayez de retirer le milieu autant que possible pour éviter l&#39;effet de la suppression d&#39;ions due aux sels résiduels du milieu.)</li><li> Laisser la plaque pendant 15 min. Retirer du congélateur et gratter les cellules dans le solvant sur glace sèche. Transférer la solution dans 1,7 ml des tubes Eppendorf et centrifuger à la vitesse de 20 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. (Préparer métabolites cellulaires de trois plats séparés pour faire trois échantillons répétés. L&#39;objectif de maintenir deux tubes est d&#39;avoir un comme une sauvegarde.) </li><li> Transférer le surnageant dans deux nouveaux tubes Eppendorf, et les sécher dans un vide de vitesse. Cela prend environ 3-6 heures selon le vide de vitesse utilisée. (Les échantillons peuvent également être séchés pendant une nuit sous azote gazeux.) </li><li> Après séchage tubes, magasins de chaque échantillon dans le congélateur à -80 ° C. Lorsque vous êtes prêt, reconstituer un échantillon dans 20 ml d&#39;eau (LC-MS grade), et injecter 5 ml de LC-QE-MS pour l&#39;analyse. </li></ol></li></ol> 3. Configuration de la séquence de l&#39;échantillon <ol><li> Une fois le calibrage a été correctement effectuée sur le QE-MS, équilibrer la colonne LC pendant 5 min avec 85% Un à un débittaux de 0,15 ml / min, ce qui est la condition de départ du gradient de LC. </li><li> Mettre en place la séquence d&#39;échantillons dans un ordre aléatoire. Remarque: De cette manière, on répartit les variations introduites par la LC-MS pour chaque échantillon et assure une comparaison plus précise entre les différents échantillons. Tous les six échantillons, ajouter un cycle de lavage, qui partage la même méthode MS, à l&#39;exception du gradient de LC est de 95% de A pendant 10 min, suivie d&#39;une colonne d&#39;équilibrage de 5 min à 85% de A avec un débit de 0,15 ml / min. Ajouter échantillons blancs (100% d&#39;eau) après chaque cycle de lavage pour évaluer le fond du système et reporter les quantités. </li><li> Enregistrer la séquence et une fois la colonne LC indique la pression stable, autour de 400 psi, lancer le cycle de la séquence. S&#39;il n&#39;y a pas d&#39;autre échantillon est à courir après cette séquence, puis ajouter une course d&#39;arrêt à la fin de la séquence, qui a un débit de 0 ml / min à la fin de la pente et choisissez &quot;veille&quot; après avoir terminé la séquence. </li><li> Ré-exécuter le même échantillon mis 12 heures après l&#39;étalonnage. (I Cettes d&#39;évaluer la fluctuation d&#39;erreur de masse après le calibrage.) </li></ol> 4. Poster analyse Instrument de nettoyage et d&#39;entretien <ol><li> A la fin de la séquence, laver la colonne avec 95% A à un débit de 0,2 ml / min pendant 2 h de débit, et, si nécessaire, d&#39;inverser la colonne avant le lavage. </li><li> Supprimez la colonne LC et connecter directement la LC à la source d&#39;ions par un syndicat. Préparer un solvant de nettoyage, / méthanol eau / acide formique (v: v: v, 90:10:0.2), mis en MS en mode veille, et le système de lavage LC-MS à un taux de 0,1 flux ml / min pendant 1 heure pour éliminer le précipité résiduel sels ou d&#39;autres impuretés. Abaissez le débit si la pression du système trop. </li><li> Réglez la température capillaire à 50 ° C, et retirer la cage d&#39;ions. Prendre avec précaution le cône de balayage ionique et du tube de transfert d&#39;ions après que la température du capillaire chute à 50 ° C. Utiliser un maillage grossier, tel que du papier de verre, pour éliminer les impuretés laissées sur la surface du cône de balayage ionique. </li><li> Placer le transfert d&#39;ionstube dans un tube Falcon de 15 ml contenant 10 ml d&#39;eau à 90% / méthanol avec de l&#39;acide formique à 0,1%. Après sonication dans le tube un sonicateur à bain-marie pendant 20 min, décanter le solvant à l&#39;intérieur, le remplacer par 10 ml de méthanol pur et sonication pendant 20 minutes. (Le cas échéant, la sonication peut être effectuée à 40 ° C ou à une température encore plus élevée pour obtenir de meilleurs résultats de nettoyage.) </li></ol> 5. Analyse des données LC-MS <ol><li> Pour assurer la séquence d&#39;échantillons fonctionne bien, après avoir terminé les deux premiers échantillons de la séquence, consultez pics de métabolites inconnus. Utilisez un fichier csv Liste des noms de métabolites, formule chimique neutre et le mode de détection (positif ou négatif), que le fichier d&#39;entrée, et le fichier de sortie contient des pics extraits et erreur de masse en ppm. Si la forme du pic est anormal ou l&#39;erreur de masse est désactivée par plus de 5 ppm, puis le reste de la séquence doit être arrêté et le dépannage doit être fait. </li><li> Choisissez la méthode de &quot;l&#39;alignement de pointeet l&#39;extraction de cadre &quot;sur les logiciels disponibles dans le commerce. Sélectionnez les données brutes de LC-MS et les regrouper. Choisir des échantillons dans le milieu de la séquence d&#39;exécution comme échantillon de référence pour l&#39;alignement de la Chromatographie de crête. Envoyez une graine de cadre y compris les métabolites connus pour l&#39;analyse des métabolites ciblés avec des données collectées et la graine de trame correspondant. </li><li> Effectuer l&#39;analyse des données en mode positif et négatif séparément. Utilisez le paramètre par défaut pour les autres paramètres. Désactiver la fonction de recherche de base de données et exécuter le flux de travail. Exporter les données traitées comme une feuille Excel contenant l&#39;aire du pic de chaque image. Les premières séries de cadres correspondent aux métabolites dans la liste ciblée. Remarque: Pour une analyse de métabolite ciblée, on obtient les informations de métabolites sur la base des études antérieures 13,15. </li><li> Pour une analyse de métabolite non ciblée, choisir la méthode de &quot;l&#39;extraction de composants&quot;. Charger des échantillons vierges pour soustraction de fond. Réglez l&#39;intensité du pic seuil, unet 10 5, m / z largeur de 10 ppm et le rapport signal sur bruit de 3. </li><li> Utilisez la base de données métabolome humain pour l&#39;identification des composés inconnus. Utilisez un filtre de CV pour supprimer les composants avec de grandes CV dans des échantillons répétés. Aller manuellement dans chaque composant et choisir ceux avec un pic bien défini ou relativement grande différence dans différents types de la recherche de base de données des échantillons. Exporter des données avec succès dans la base de données. (Alignement de pointe pourrait être contournée si le score d&#39;alignement de pointe est trop faible.) </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Les étapes les plus importantes pour la réussite de profilage des métabolites dans les cellules à l&#39;aide de ce protocole sont: 1) le contrôle du milieu de croissance et l&#39;extraction minutieuse des cellules; 2) l&#39;ajustement de la méthode de LC basée sur MS méthode configuration pour s&#39;assurer qu&#39;il ya suffisamment (habituellement au moins 10) points de données à travers un pic pour la quantification; 3) faire un étalonnage de faible masse avant d&#39;exécuter les échantillons; 4) l&#39;in...

Métabolomique, définis comme une expérience qui mesure plusieurs métabolites simultanément, a été une zone d&#39;intérêt intense. Métabolomique fournit une lecture directe de la physiologie moléculaire et a donné un aperçu dans le développement et la maladie comme le cancer 1-4. Résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie-spectrométrie de masse gazeuse (GC-MS) sont parmi les instruments les plus couramment utilisés 5-9. RMN, en particulier a été utilisé pour des expériences de flux depuis composés marqués d&#39;isotopes lourds, tels que 13 métabolites C marqués, sont actif en RMN 10,11. Cependant, cette stratégie nécessite la pureté de l&#39;échantillon relativement élevée et grande quantité de l&#39;échantillon, ce qui limite ses applications en métabolomique. Pendant ce temps, les données recueillies à partir de l&#39;analyse des besoins RMN intensive et l&#39;attribution composé de spectres RMN complexe est difficile. GC-MS a été largement utilisé pour les métabolites polaires et des études de lipides, mais il faut compoun volatileds et donc souvent une dérivatisation de métabolites, ce qui implique parfois chimie complexe qui peut prendre beaucoup de temps et introduit du bruit expérimental. Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse quadripolaire triple utilise le premier quadrupôle pour la sélection des ions parents intacts, qui sont ensuite fragmentés dans le second quadripôle, tandis que le troisième quadripole est utilisé pour sélectionner des fragments caractéristiques ou des ions fils. Cette méthode, qui enregistre le passage de la ions parents à ions fils spécifiques, est appelé surveillance de réaction multiple (MRM). MRM est une méthode très sensible, spécifique et robuste à la fois petite molécule et la quantification des protéines 12-15,21. Cependant, MRM a ses limites. Pour obtenir une grande spécificité d&#39;une méthode MRM doit être construit pour chaque métabolite. Cette méthode consiste à identifier un fragment spécifique et l&#39;énergie de collision optimisées, ce qui nécessite une connaissance préalable de la prope correspondantles parties prenantes des métabolites d&#39;intérêt, tels que les informations de structure chimique. Par conséquent, à quelques exceptions impliquant la perte de neutre de fragments communs, il n&#39;est pas possible d&#39;identifier des metabolites inconnus avec cette méthode. Dans les dernières années, à haute résolution (spectrométrie de masse) HRMS instruments ont été libérés, tels que la série LTQ-Orbitrap et Exactive, la QuanTof, et TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS peuvent fournir un rapport masse sur charge (m / z) des ions intacts à l&#39;intérieur d&#39;une erreur de quelques ppm. Par conséquent, un instrument de gestion des ressources humaines exploité par la détection de tous les ions précurseurs (c&#39;est à dire en mode balayage complet) peut obtenir des informations structurales directe de la masse exacte et la composition élémentaire résultant de l&#39;analyte, et cette information peut être utilisée pour identifier des métabolites potentiels. En effet, toutes les informations sur un composé peut être obtenu avec une masse exacte, au niveau des isomères structuraux. En outre, un pleinméthode d&#39;analyse ne nécessite pas de connaissance préalable de métabolites et ne nécessite pas l&#39;optimisation des méthodes. En outre, étant donné que tous les ions avec m / z tomber dans la plage de balayage peuvent être analysés, HRMS a une capacité presque illimitée en termes de nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés en un seul passage par rapport à la méthode de MRM. HRMS est également comparable à un MRM quadripolaire triple de la capacité quantitative due au cycle de service de courte entraîne un certain nombre comparable de points de données qui peuvent être obtenus dans une analyse complète du MS. Par conséquent, HRMS fournit une approche alternative pour la métabolomique quantitative. Récemment, une version améliorée de gestion des ressources humaines appelé Q-Exactive spectrométrie de masse (QE-MS) peut être utilisé sous la commutation entre les modes positifs et négatifs avec des temps de cycle suffisamment rapide en une seule méthode, qui élargit la gamme de détection 19. Ici, nous décrivons notre stratégie de métabolomique utilisant le QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l&#39;étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Toutefois, les plates-formes actuelles ont des facteurs limitants, comme la main-d&#39;œuvre intensive préparation des échantillons, les limites de détection basses, la vitesse de balayage lent, méthode intensive optimisation pour chaque métabolite, et l&#39;incapacité de mesurer à la fois positivement et des ions chargés négativement dans des expériences simples. Par conséquent, un nouveau protocole de métabolomique pourrait faire progresser les études de métabolomique. Chromatographie hydrophile à base d&#39;amide permet l&#39;analyse des métabolites polaire sans dérivation chimique. SM à haute résolution à l&#39;aide du Q-Exactive (QE-MS) a amélioré optique ionique, l&#39;augmentation de la vitesse de balayage (256 ms avec une résolution de 70 000), et a la capacité d&#39;effectuer la commutation positive / négative. En utilisant une stratégie d&#39;extraction de méthanol froid, et le couplage d&#39;une colonne d&#39;amide avec QE-MS permet une détection robuste de 168 metabolites polaires ciblées et beaucoup d&#39;autres fonctions simultanément. Datun traitement est effectué avec le logiciel disponible dans le commerce d&#39;une manière très efficace, et des caractéristiques inconnues extraites à partir des spectres de masse peut être interrogé dans les bases de données.

L&#39;exactitude des données de métabolomique dépend fortement de la performance de l&#39;instrument LC-QE-MS. Afin de déterminer si l&#39;instrument fonctionne dans de bonnes conditions, et si la méthode appliquée est correcte, plusieurs pics LC de métabolites connus sont extraites à partir de la chromatographie ionique total (CIT), comme représenté sur la figure 1. Metabolites polaires, y compris des acides aminés, des produits intermédiaires de la glycolyse , intermédiaires de TCA, les n...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Métabolite profilage a été un atout précieux dans l&#39;étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.8K vues.  Cornell University.  Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grands écrans des banques métagénomiques

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Recherche

Biologie

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Une procédure ChIP-Seq semi-automatisée pour les études épigénétiques à grande échelle

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.