Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Les présentées Léo-workflows permettent l&#39;étiquetage des isotopes stables de protéines et de peptides synthétiques digère. Ces expériences suivies dans le temps (figure 1) sont applicables aux études comparatives et quantitatives protéomique ainsi que la recherche de protéase. Chaque flux de travail se compose de deux étapes expérimentales (figure 2): A) Le temps d&#39;échantillonnage résolu de l&#39;respectif 18 O-isotope stable codé réaction (protéase catalysée par clivage du peptide; protéase réaction catalysée par l&#39;échange d&#39;oxygène carboxyle; catalyse acide échange d&#39;oxygène carboxyle réaction) et B) l&#39;analyse par spectrométrie de masse et la représentation graphique de 18 O à la constitution cinétique. Les expériences TimeCourse A. I. paléo-TimeCourse: Protéase catalysée par l&#39;étiquetage des clivages protéolytiques <ol><li> (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM)dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C. </li><li> (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Selon la protéase d&#39;intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l&#39;agent d&#39;alkylation. Utilisez PepClean colonnes C-18 spin (Thermo) pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges (Sartorius) pour échanger les tampons pour les échantillons de protéines. </li><li> Redissoudre / peptides / protéines change dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Prélever un échantillon au temps zéro point avant l&#39;ajout de la protéase: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul alpha cyano-4-hydroxycinnamiqueacide matrice (10 mg / ml dans l&#39;acétonitrile 50%, TFA 0,1%). Place sur un échantillon Opti-TOF plaque 384 cible MALDI (AB SCIEX) et de laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu&#39;à sec (environ 5 min). </li><li> Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote va être mis à incuber avec la protéase d&#39;intérêt (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l&#39;enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira d&#39;échantillon témoin. La première aliquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-étiquetage et peut être utilisé pour l&#39;identification des peptides et des protéines, la détection des activités protéolytique et le suivi des réactions de clivage protéolytique. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est induite par la protéase, par conséquent, ni étiquetage ni clivage est prévu pour cet échantillon. </li><li> Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de les repérer comme described à l&#39;étape 5 à intervalles de temps qui lui semble approprie. Les conditions de réaction décrites ci-dessus sont utilisés pour surveiller une réaction protéolytique pour un maximum de quatre jours (environ 24 places). Commencer l&#39;échantillonnage toutes les 5 min jusqu&#39;à 30 min, puis repérer toutes les 30 minutes jusqu&#39;à 2 heures, puis toutes les heures jusqu&#39;à 8 heures et 8 heures, jusqu&#39;à ce que tous les 4 jours. Produits de clivage doit apparaître dans les premières 12 heures et le substrat doit être complètement hydrolysé après 24 heures. De longues périodes d&#39;incubation de réaction permettent de définir les produits de réaction stables qui sont discrets à partir d&#39;intermédiaires de réaction, qui sont ensuite transformés. Selon question de recherche et de données enzyme-substrat paires, les temps de repérage et de la température d&#39;incubation doivent être modulée pour assurer l&#39;échantillonnage de réaction optimale. </li><li> Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage, la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B). </li></ol> II. Paléo-TimeCourse: Postdigétiquetage estion des terminaisons protéolytiques <ol><li> (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C. </li><li> (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> En fonction de la protéase d&#39;intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l&#39;agent d&#39;alkylation. Utilisez les colonnes PepClean C-18 de spin pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges pour l&#39;échange de tampon protéique. </li><li> Redissoudre / échanger les produits nettoyé jusqu&#39;à peptides / protéines dans 20 ul de tampon de réaction de protéase (par exemple la trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) et digérer avec une protéase d&#39;intérêt à terme (par exemple la trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 h). </li><li> Produits de clivage de nettoyage avec des colonnes PepClean C-18 spin. Cette étape mettra fin aux activités de protéases résiduelles. </li><li> Redissoudre / échanger les produits peptidiques nettoyé dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O. </li><li> Prélever un échantillon au temps zéro point avant l&#39;addition d&#39;enzyme: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul matrice de l&#39;acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans 50% d&#39;acétonitrile, TFA à 0,1%). Tache d&#39;échantillon sur une plaque cible MALDI et laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu&#39;à sec (environ 5 min). </li><li> Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote seront incubées avec la protéase d&#39;intérêt (par exemple la trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l&#39;enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira de contrôle. La premièrealiquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-postdigestion étiquetage et peuvent être utilisées pour la quantification de protéines et peptides. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est catalysée par la protéase, par conséquent, aucun étiquetage n&#39;est prévu pour cet échantillon. </li><li> Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de repérer les comme décrit dans l&#39;étape 7.) À des intervalles de temps qui lui semble approprie. Par exemple, nous avons repéré un premier temps toutes les 5 min jusqu&#39;à 30 min toutes les 15 min et ensuite pour surveiller la réaction de l&#39;oxygène carboxyle échange catalysée par la trypsine. </li><li> Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage de la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B). </li></ol> III. Aleo-TimeCourse: acide catalysée par l&#39;étiquetage des groupes carboxyle <ol><li> Incuber peptides individuels (50 nm) avec 1:1 (v / v) 18 O-eau enrichie en til présence ou l&#39;absence (témoin) de 0,1% (v / v) d&#39;acide trifluoroacétique finale (volume total 30 pi). </li><li> Les produits de réaction d&#39;échantillon par jour pendant 48 jours par co-spotting une aliquote de 0,5 ul du mélange avec 0.5μl de matrice d&#39;acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans l&#39;acétonitrile 50%, TFA 0,1%) directement sur une cible MALDI plaque. </li><li> Entre les intervalles de repérage et après avoir repéré le point de temps de réaction finale soumettre plaque cible MALDI pour MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous à la section B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Acquisition et analyse des données <ol><li> Les spectres de masse sont acquis sur une 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Avant l&#39;analyse, l&#39;instrument est étalonné avec un mélange de normes peptidiques (Mass Kit normes pour l&#39;étalonnage d&#39;AB SCIEX TOF / TOF instruments) avec une tolérance d&#39;erreur maximale de mesure de masse de ± 50 ppm et un nombre minimal de six sommets de match. </li><li> Spectres SM (gamme de masse400 - 4.000 m / z) sont acquises en triple en utilisant le mode ions positifs, avec une intensité laser réglable (3.400 - 3.800; taille de pas de 50) avec une plage d&#39;intensité de crête de base acceptable de 2.000 - 45.000. Plans simples sont acquis pour les sous-spectres, avec 400 coups total / spectre, arrêtez conditions entreront en vigueur après 800 sous-spectres sont acquis (réussite ou échec) ou 400 sous-spectres critères d&#39;acceptation de passe. Dans le cas d&#39;échantillons à faible abondance ou en présence de complexes de milieux biologiques de l&#39;extrémité inférieure de la plage de détection MS doit être porté à 800 m / z. En outre, il peut être nécessaire d&#39;enlever le sel et d&#39;autres composés qui interfèrent avec une étape de nettoyage échantillon comme décrit plus haut ou par séparation LC. </li><li> MS fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir du logiciel 4000 Series Explorateur d&#39;acquisition de données et importés dans notre propre système d&#39;information de laboratoire, qui utilise le logiciel Distiller MASCOT (Matrix Science) pour le traitement spectrale et la détection de pointe. Enveloppes isotopiquessont déconvolué et 18 O à la constitution des ratios déterminés automatiquement par un algorithme similaire à celle décrite par Mason et al. 12 et adapté par notre groupe 9. Alternativement, des outils logiciels tels que ZoomQuant 13 et Viper 14, ainsi que logiciels commerciaux tels comme BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) et Mascot Distiller quantification Boîte à outils (Matrix Science) peut déconvoluer 18 O des données de type 15,16. 18 O à la constitution ratios sont exprimés en des contributions relatives des différentes espèces isotopiques peptidiques (par exemple, des peptides, contenant 16 O, 18 O 18 O ou 1 2) à l&#39;ensemble de l&#39;enveloppe isotopique. </li><li> Pour chaque expérience TimeCourse, les masses moléculaires ([M + H] +) pour toutes les espèces de peptides détectés sont extraites à partir des fichiers de données associés MS et les valeurs mis en cellule à une largeur de 100 ppm en masse. </li><li> Au moins trois [M + H] + sont configurés pour être tenus de remplir un bac. Dans le cas de substrats connus, la liste bin filtré est comparé à une liste de produits de clivage protéolytique prédite à partir de la séquence du peptide substrat en utilisant l&#39;outil ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) et un 200 ppm en masse acceptation tolérance aux erreurs. </li><li> Spectres MS / MS sont acquis pour toutes les valeurs de masse de produits de coupure par l&#39;outil prédites et des valeurs FindPept bin qui ont 18 O-incorporations qui leur sont associés. MS / MS sont acquises sur le 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer dans le réflecteur d&#39;ions 1kV mode positif, avec une intensité laser fixe de 4200 et CID-gaz en mode hors tension. 50 tirs sont acquis selon un schéma randomisé par sous-spectres pour un total de 40 sous-spectres par endroit (ce qui donne un total de 2.000 coups / place). </li><li> MS / MS des fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir de l&#39;Explo 4000 Seriesrer le logiciel d&#39;acquisition de données et importés dans notre propre système d&#39;information de laboratoire, les pics sont détectés et MS / MS listes de pics sont associés avec les données correspondantes MS regroupées par casiers. </li><li> Pour l&#39;identification des peptides, MS / MS listes de pointe lancer une recherche dans la base de données SwissProt en utilisant le moteur de recherche MASCOT avec les paramètres de recherche suivants: pas de spécificité de l&#39;enzyme, 150 ppm ion précurseur et 0,2 Da tolérances de fragments d&#39;ions de masse. </li><li> Identifications peptidiques peuvent en outre être validée à l&#39;aide du logiciel Data Explorer (AB SCIEX) en confirmant les 18 caractéristiques O-incorporation tendances entre ions fragments série Y telle que décrite par Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Préparation du Temps spectrale et 18 O à la constitution Parcelles Parcelles de temps spectrales: MS fichiers de données (. T2D fichiers) pour chaque point de temps de réaction sont exportés à partir du logiciel Data Explorer en mode ASCII des fichiers en utilisant unmacro importés dans une analyse de données et un logiciel graphique (par exemple, en OriginLab origine) et affichés sous forme de tracés cascade (figure 3). 18 O à la constitution des parcelles: Pour chaque produit clivage du peptide mis en cellule, les contributions relatives des différentes espèces isotopiques (16 O peptidiques, 18 ou 18 O 1 O 2) sont extraits dans tous les points dans le temps de réaction et en fonction du temps (figure 4).

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	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. 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C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. 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J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En combinant l&#39;étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du matériau </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Colonnes PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF plaque 384 cible MALDI </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Matériaux <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-hydroxycinnamique </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacétamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endothéline-1 converting enzyme (CEE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Or la trypsine </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Eau-18 O, 97% atomique 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Kit de masse pour l&#39;étalonnage des normes AB SCIEX TOF / TOF instruments </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l&#39;avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l&#39;incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d&#39;oxygène de l&#39;eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d&#39;expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d&#39;un maximum de deux atomes d&#39;oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 </sup&gt;. La réaction de marquage peut être subdivisé en deux processus indépendants, le clivage liaison peptidique et la réaction de l&#39;oxygène carboxyle échange 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l&#39;eau enrichie) l&#39;adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l&#39;eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l&#39;essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l&#39;analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d&#39;identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d&#39;identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l&#39;incorporation d&#39;un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage&quot; enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d&#39;échange d&#39;oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s&#39;étend étiquetage employant 18 O de l&#39;eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.

Nous avons utilisé le flux de travail paléo-TimeCourse de surveiller dynamiquement l&#39;incorporation de 18 S-isotopes stables dans les produits de clivage de peptides générés par des enzymes protéolytiques. L&#39;approche présentée est un outil polyvalent pour étudier les voies relativement traitement protéolytique de substrat différent et les combinaisons de protéase. En échantillonnant les réactions protéolytiques à plusieurs reprises au cours de la réaction, l&#39;expérience paléo-Time...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable workflows marquage isotopique qui emploient<sup&gt; 18</sup&gt; O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo),<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d&#39;échange d&#39;oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail,<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par échange d&#39;oxygène carboxyle à faible pH.

Flux de travail d&#39;étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche<sup&gt; 18</sup&gt; O enrichi en eau

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

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Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K vues.  Boston Biomedical Research Institute. Stable workflows marquage isotopique qui emploient 18 O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo), 18 Atomes d'oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d'échange d'oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail, 18 Atomes...

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Recherche

Biologie

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Expérience Morris Water Maze

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
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Sigma&#039;s Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marquage fluorescent Drosophile</emOuvrages d&#39;art> Coeur

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC basé sur la détection de l&#39;acétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flux de travail TEM, analyse des résultats et gestion des données à l’aide d’une approche de vision industrielle

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Pleins feux sur l’auteur : Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données