Nous remercions le Dr Grant Sumida pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de jeune chercheur Beckman (SY), une famille Hellman Faculté nouveau prix (SY), un EUREKA NIH, l&#39;Université de Californie recherche sur le cancer comité de coordination.

1. Génération d&#39;une lignée cellulaire stable (par exemple des cellules MDCK) <ol><li> Cellules de la plaque à 80-90% de confluence dans un plat à p35. Ne laissez pas les cellules sous forme de 100% monocouche confluente, ce qui réduira l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Transfecter les cellules avec le plasmide d&#39;intérêt en utilisant Lipofectamine 2000. Optimiser les conditions de transfection utilisant le protocole du fabricant. </li><li> Le lendemain, le passage des cellules dans deux boîtes de Pétri p150. Le grand plat est recommandé pour permettre à l&#39;espacement suffisant entre les colonies stables. </li><li> Le lendemain, changer les médias et ajouter 500 pg / ml de G418 à chaque plat. La concentration du G418 devrait être optimisé pour les lignées de cellules individuelles. </li><li> Changer les médias chaque jour pendant environ 2 semaines. Après 2 semaines, G418 colonies résistantes devraient commencer à se former, et sera visible à l&#39;œil nu. </li><li> En utilisant un microscope inversé fluorescentes, identifier les colonies GFP-positives. Marquer ces colonies sur la plaque à l&#39;aide d&#39;un stylo Sharpie. </li><li> Pour sélectivement trypsiniser les colonies de la plaque de culture de tissus, aspirer à la presse, et laver les cellules deux fois avec du PBS ou solution de trypsine. Sur le second lavage, ne pas aspirer à toute la solution. Laisser une mince couche de liquide sur le fond de l&#39;assiette pour empêcher les cellules de séchage. </li><li> Pour chaque colonie a marqué: utilisez un coton-tige stérile pour essuyer le plus proche possible sur le pourtour de la colonie. Cela va créer une île de la zone humide contenant de la colonie de cellules. Pipeter 10 pl de la trypsine sur la colonie. Répétez l&#39;opération pour chaque colonie, et de procéder rapidement pour éviter le séchage. Un chercheur expérimenté peut généralement prendre ~ 12 colonies par p150 assiette. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5-10 minutes jusqu&#39;à ce cellules se détachent de la plaque et paraître rond. </li><li> Pour chaque colonie: pipette 10 ul de la trypsine sur la colonie, et la pipette monter et descendre une ou deux fois pour détacher les cellules de la plaque. Puis la pipette toutes les cellules de la colonie en un seul puits dans un plat à 24 puits. </li> &lt;li&gt; Après colonies stables ont augmenté, l&#39;expression des protéines de chaque colonie est analysée en utilisant la norme western blot et immunofluorescence. Développer ces lignées de cellules pour une analyse ultérieure. </li></ol> 2. Modification de la surface du plat à fond de verre pour la liaison de collagène optimale (facultatif) <ol><li> Pour silaniser le verre, pipette 300 pi de 2% 3-aminopropyltriméthoxysilane solution sur la partie vitrée de chaque plat p35 avec une ouverture de 10 mm. Voir Figure 1 pour la silanisation et réticulation schématique. 3-aminopropyltriméthoxysilane est dilué dans de l&#39;eau filtrée. </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution 3-aminopropyltriméthoxysilane et laver avec de l&#39;eau filtrée trois fois pour 10 minutes chacune. </li><li> Aspirer les plats d&#39;eau et placer sur une plaque chaude réglé à 50 ° C pendant 1,5 heures. Lieu de sommets plats légèrement du plat afin que l&#39;humidité dans le plat ne peut échapper. </li><li> Retirez les plats du feu et laisser à gazouillerl. </li><li> Pipeter 300 pi de solution de glutaraldéhyde à 2% sur la partie en verre de chaque plat. Le glutaraldéhyde est dilué dans du PBS. </li><li> Incuber pendant 1 heure. </li><li> Aspirer la solution de glutaraldéhyde et laver la vaisselle avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes chacun. </li><li> Stériliser les plats par une exposition aux rayons UV pendant 1 heure. Les plats silanisé peut être conservée à température ambiante. </li></ol> 3. Préparation du gel de collagène 3D avec des particules traceurs <ol><li> Laver les particules traceur fluorescent en faisant tourner en baisse de 100 ul de particules traceurs de stock (10 10 particules / ml) dans une centrifugeuse à 15 000 rpm pendant 5 minutes, aspirer le liquide, et ajouter 500 ul de médias. Répéter 5 fois. Après dernier lavage, les particules de remettre en suspension dans 30 pl de médias. </li><li> Trypsiniser cellules GFP exprimer comme d&#39;habitude. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire d&#39;environ 2 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Pipeter 240 ul de milieu de croissance dans un tube Eppendorf. </li><li> Ajouter 12,6 ul d&#39;HEPES 1M, 20 pl d&#39;eau filtrée, 50 pl de solution de la cellule, puis 10 ul de particules fluorescentes. </li><li> Enfin, ajouter 167 l de collagène du derme bovin J&#39;ai solution (pour obtenir une concentration de travail de 1 mg / ml). </li><li> Mélanger une solution à fond, puis la pipette 80 ul de la solution sur la partie en verre du plat à fond de verre silanisé. </li><li> Vaisselle Placer dans l&#39;incubateur et permettre au gel de polymériser à 37 ° C pendant 30 minutes. Voir Figure 1A pour le gel de collagène dans un plat typique de p35 à fond de verre. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de croissance avec soin pour chaque plat. </li></ol> 4. Procédure à suivre pour l&#39;acquisition d&#39;image time-lapse <ol><li> Allumez le contrôle de la température de l&#39;enceinte de microscope et de laisser la chambre de la portée s&#39;équilibrer à une température état d&#39;équilibre à 37 ° C. Voir Figure 2 pour un exemple de système d&#39;imagerie des cellules vivantes. </li><li> Changer les médias aux nouveaux médias complété avec 25 mM de HEPES à maintenir un pH neutre. PourDIC imagerie, de l&#39;échange au sommet de la parabole avec un qui a un dessus en verre. En utilisant une mince bande de parafilm, couvrir le côté du plat pour éviter l&#39;évaporation des médias. </li><li> Pour un objectif à immersion d&#39;huile, déposer une goutte de liquide d&#39;immersion sur l&#39;objectif. </li><li> Placer le gel de collagène contenant plat sur la platine du microscope, et assurez le plat en contact avec le liquide d&#39;immersion. </li><li> Axer la recherche d&#39;échantillon et les cellules d&#39;intérêt pour l&#39;image. Pour minimiser la dérive scène, permettent de régler plat pendant environ 45 minutes avant de commencer une capture longtemps. </li><li> Spécifiez les paramètres d&#39;acquisition des images. Minimiser l&#39;exposition au laser, ce qui pourrait endommager les cellules, en modulant la puissance du laser, le temps d&#39;exposition, la fréquence et la durée du temps de capture. Les paramètres réels varient avec le système de microscope et le type de cellule. </li><li> Lors de l&#39;acquisition time-lapse, un inhibiteur peut être ajouté. Pour l&#39;expérience de plus inhibiteur, ne pas sceller le plat avec du parafilm. <ol><li> Préparationsont complétées Hepes médias avec la drogue, à une concentration de travail désirée. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à ajouter des médicaments aux médias, mettre en pause la capture d&#39;image, et enlever soigneusement le dessus plat sans déranger le plat. </li><li> Aspirer à la presse dans le plat, et une pipette contenant le médicament des médias dans le plat. Puis, soigneusement remplacer le dessus plat. </li><li> L&#39;échantillon peut être hors-de-foyer à cause de l&#39;ajout de nouveaux médias, réajuster la mise au point. </li><li> Redémarrez la capture, puis de surveiller les captures pour les 30 prochaines minutes, et réajuster la mise au point si nécessaire. Voir Figure 4 pour un exemple de l&#39;expérience de plus de drogue. </li></ol></li></ol> 5. Procédure de FRAP et de l&#39;analyse <ol><li> La configuration du PAF varie entre les systèmes, suivre les instructions du fabricant. </li><li> Mettre en place des paramètres pour imagerie des cellules vivantes. </li><li> Mettre en place des paramètres pour photoblanchiment. Utilisez la puissance du laser suffit à photobleach le signal fluorescent sans endommager les cellules. Testez ces nominaleameters sur les cellules pratique. </li><li> Démarrer la capture d&#39;image, et attendre au moins 5 images de la capture d&#39;image avant photoblanchiment la région d&#39;intérêt. </li><li> Continuer la capture, et le temps de récupération devrait être suffisant pour capturer le plein rétablissement de fluorescence. Voir Figure 5 pour un exemple de l&#39;expérience de FRAP. </li><li> Analyser la récupération de fluorescence en mesurant l&#39;intensité moyenne de fluorescence de la zone photobleached (avant et après photoblanchiment) au cours du temps. L&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;analyse statistique (Excel par exemple), l&#39;ajustement de la courbe de récupération de l&#39;équation exponentielle: I = f (1-e-kt), où I est l&#39;intensité, je f est l&#39;intensité finale, t le temps, et τ ½ est le temps qu&#39;il faut pour l&#39;intensité pour atteindre la moitié de la valeur finale: τ ½ = ln (2) / k. La mi-temps est une mesure du taux de mobilité de la protéine. </li><li> Obtenir les paramètres, à mi-temps et l&#39;intensité finale de la courbe exponentielle ajustement. Calculer ee fraction mobile en prenant le rapport de la finale à la première intensités de fluorescence. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules épithéliales saines au sein de la matrice est montré dans la figure 3. Les cellules saines présentent une surface lisse, membrane continue, et noyau distinct, tandis que les cellules malsaines ont souvent une membrane perturbé, et un nombre excessif de vacuoles. Dans une matrice 3D, seule la migration des cellules épithéliales 1, et au cours de plusieurs jours, les cellules épithéliales forme tridimensionnelle, sphérique, multi-cellulaire des kystes au sein de la matrice 2. Les cellules sont également très dynamiques, et de migrer dans le kyste (figure 3). La déformation de matrice à la suite des forces de traction exercée par les cellules migrent sont analysées par le déplacement de particules traçantes noyées dans la matrice environnante (figure 4). Les mouvements des particules traceurs sont affichés comme une image de projection maximale de varierpoints de temps différentes, et chaque moment est une pseudo-couleur pour indiquer le temps (figure 4B). Sinon, les images d&#39;une particule traceur individuels sont affichées comme un montage pour montrer le mouvement de la particule traceur au cours du temps (figure 4C). Toutes analyse d&#39;image a été réalisée en utilisant ImageJ. Ces évaluations qualitatives de la déformation matrice, et donc les forces exercées par les cellules migrent, sont utiles en première approximation de la répartition de la force de traction. L&#39;estimation quantitative des forces de traction exercée par les cellules migrent en 3D est au-delà de la portée de ce protocole et est décrit ailleurs 3,4. Une reprise typique de fluorescence après photoblanchiment expérience est montré dans la figure 5. La région d&#39;intérêt doivent être photobleached utilisant des paramètres laser optimisés de sorte que l&#39;intensité de fluorescence est visiblement diminué par rapport aux niveaux de fond (pour maximiser signal-bruit), tout en préservant les cellules saines et en bon état. Le réglage optimal doit be déterminée empiriquement que chaque configuration est différente FRAP (par exemple, le FRAP en utilisant le système de balayage laser confocal). L&#39;exposition et intervalle de temps d&#39;acquisition des images post-FRAP doit être soigneusement contrôlée pour éviter photoblanchiment fond. L&#39;utilisation de faible puissance laser, temps d&#39;exposition court, et l&#39;utilisation de la caméra sensible et optique haute efficacité sont essentiels pour une qualité d&#39;image haute FRAP. Si la fluorescence de blanchiment lors de l&#39;acquisition d&#39;image est importante, ce fondu de fond doivent être quantifiés et normalisés de la reprise de l&#39;intensité de fluorescence observée. En raison de la nature 3D de l&#39;environnement, la composante z de la reprise d&#39;intensité de fluorescence peuvent devenir importants. Par conséquent, il est important de définir un volume photobleached en prenant pré-et post-stack images 3D de la région de photobleached. Une analyse plus poussée et la modélisation de la récupération de fluorescence est discutée ailleurs 5,6. La combinaison unique d&#39;imagerie des cellules vivantes techniques: GFP de suivre la dynamique des protéines du cytosquelette, la fluorescence rouge particules traceur pour surveiller la déformation de matrice, et l&#39;addition d&#39;inhibiteurs, peuvent être utilisés simultanément pour l&#39;analyse de la dynamique des protéines, la force de traction et de voies moléculaires. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figure 1. Préparation du gel de collagène. A) la matrice de collagène polymérisé sur un plat à fond de verre. La couleur rose du gel est due à des particules fluorescentes intégré. B) Procédure pour traiter les plats à fond de verre pour réticuler le gel de collagène à la surface du verre. Tout d&#39;abord, le plat à fond de verre est traitée avec 3-aminopropyltriméthoxysilane solution, une solution de glutaraldéhyde alors que la matrice de collagène réticule sur le verre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de configuration microscope confocal / FRAP. Le confocalemicroscope est basé sur un AxioObserver Zeiss avec une caméra CCD Coolsnap HQ II et complètement automatisé par Slidebook logiciels (Intelligent innovations en imagerie). L&#39;unité est conçue sur mesure confocale et basé sur l&#39;unité Yokogawa disque rotatif CSU10 et deux lasers à état solide (488 nm à 50 mW et 561 nm avec 40 mW) avec acousto-optique à filtre accordable (AOTF) pour permettre la commutation entre deux millisecondes lasers. Les filtres d&#39;émission sont nm 525/50 et 620/60 nm (# 118661 et # 118085, technologie Chroma) et miroir dichroïque est Brightline 488-568 bi-bande (Semrock). Les objectifs sont une longue distance de travail 40x C-Apochromat objectif avec NA 1.1 et distance de travail de 0,62 mm, et un 63x Plan-Apochromat objectif avec NA 1,4 et une distance de travail de 0,19 mm. Le microscope comprend également un système de photoablation FRAP qui se compose d&#39;une fibre laser à colorant pompé optiquement, une position du faisceau contrôlé par ordinateur et d&#39;intensité, et une taille de tache de diffraction limitée. Par ailleurs, le microscope est équipéune platine XY motorisée, qui comprend 0,1 microns encodeurs linéaires sur chaque axe. Au cours de l&#39;imagerie time-lapse, la température ambiante est maintenue par une chambre du microscope conçu sur mesure et un appareil de chauffage avec un contrôle de température retour. Pour isoler le bruit et les vibrations, le système de microscope entier est sur une table de vibrations. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figure 3. Direct imagerie cellulaire de cellules épithéliales exprimant la GFP-actine. Ces cellules forment un kyste au bout de 4 jours de culture dans une matrice de collagène 3D. Certaines cellules se déplacent le long de la surface du kyste (flèche jaune), tandis que d&#39;autres migrent à l&#39;intérieur de kystes (rouge pointe de flèche). La barre d&#39;échelle 10 microns, le temps en heures. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;effet de l&#39;inhibition de la Rho-kinase sur la force de traction. A) l&#39;image DIC d&#39;une cellule de migration MDCK exprimant GFP taggés marqueur nucléaire. L&#39;image a été prise immédiatement avant le traitement de l&#39;inhibiteur de la Rho-kinase Y-27632. La barre d&#39;échelle 10 microns. B) Le déplacement des particules résultant de l&#39;addition de Y-27632. Les positions des particules à différents temps (0 - 52 min) ont été pseudo-colorée en fonction de l&#39;échelle d&#39;intensité, puis projetée sur une seule image. La zone blanche est le noyau GFP-positives dans les cellules en migration. La barre d&#39;échelle 10 microns. Temps en minutes. C) Le mouvement des particules sur le bord de fuite de la cellule (voir flèche en B). Astérisque indique la dernière image capturée avant Y-27632 plus. La particule traceur déplacé vers et loin du bord de fuite de la cellule migration avant et après l&#39;ajout de Y-27632, respectivement. Échelle barre de 1 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figure 5. Analyse du PAF de GFP-actine exprimer la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Images Timelapse A) de la GFPactine cellule exprimant des avant et après le photoblanchiment. Une petite région de la GFP-actine accumulée à l&#39;arrière des cellules a été photobleached (rouge pointe de flèche) au point de temps 0. Temps en secondes, barre d&#39;échelle 5 um. B) L&#39;intensité moyenne de fluorescence de la région photobleached (ligne continue), et l&#39;ajustement exponentiel de la reprise de fluorescence (cercles) en fonction au cours du temps. L&#39;intensité de fluorescence a été normalisée à la valeur initiale avant photoblanchiment.

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l&#39;obtention de &quot;bons&quot; clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d&#39;excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Collagène, bovins, de type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock est d&#39;environ 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriméthoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluer dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> glutaraldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluer dans du PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrène Fluospheres microsphères 1 pm, fluorescence rouge (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Généticine (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Culture composantes médias: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Toutefois, au cours des processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, et les métastases du cancer, les cellules doivent naviguer à travers complexe, en trois dimensions du tissu extracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière ces processus biologiques, il est important d&#39;examiner les rôles des protéines responsables de la conduite de migration cellulaire. Ici, nous présentons un protocole d&#39;étudier les mécanismes de la migration cellulaire en utilisant la lignée cellulaire épithéliale (MDCK), et un en trois dimensions, fibreuse, autopolymérisant matrice comme un système modèle. Cette matrice extracellulaire est optiquement clair facilement s&#39;adapter à des études d&#39;imagerie des cellules vivantes et mieux imite le physiologiques, l&#39;environnement des tissus mous. Ce rapport démontre une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique, et la déformation de la entourant matrice tridimensionnelle. Exammination de la localisation des protéines et la dynamique des processus cellulaires au cours donne un aperçu de la clé dans les fonctions des protéines. Génétiquement codés étiquettes fluorescentes offrent une méthode unique pour l&#39;observation de la localisation des protéines et de dynamique. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l&#39;accumulation intracellulaire de la clé, la force génératrice de composants du cytosquelette en temps réel que les manœuvres des cellules à travers la matrice. De plus, en utilisant de multiples balises fluorescentes avec différentes longueurs d&#39;onde, nous pouvons examiner la localisation de protéines multiples simultanément, nous permettant ainsi de tester, par exemple, si différentes protéines ont des rôles similaires ou divergents. Par ailleurs, la dynamique des protéines par fluorescence marqués peuvent être quantifiés à l&#39;aide de récupération fluorescent après photoblanchiment (FRAP) analyse. Cette mesure de la mobilité des dosages des protéines et comment stablement lié les protéines sont sur le réseau du cytosquelette. En combinant imagerie des cellules vivantes avec le traitement des inhibiteurs de la fonction des protéines,nous pouvons examiner en temps réel l&#39;évolution de la répartition des protéines et la morphologie des cellules migrantes. Par ailleurs, nous aussi combiner imagerie des cellules vivantes avec l&#39;utilisation de particules de traceur fluorescent incorporé dans la matrice pour visualiser la déformation de matrice lors de la migration cellulaire. Ainsi, nous pouvons visualiser comment une cellule migration distribue la force génératrice de protéines, et où les forces de traction sont exercées à la matrice environnante. Grâce à ces techniques, nous pouvons avoir un aperçu précieux sur les rôles des protéines spécifiques et de leurs contributions aux mécanismes de la migration cellulaire.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l&#39;analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K vues.  University of California, Davis. Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l'analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Vidéo: Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Recherche

Bio-ingénierie

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d&#39;imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...