Les auteurs remercient le financement de l&#39;Australian Research Council et la Santé nationale et du Medical Research Council de l&#39;Australie et également à remercier l&#39; Facilité de fabrication australienne nationale pour la SU-8 maître pour l&#39;impression par microcontact. SHN est soutenu par le Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Malaisie Universiti Sains Malaysia.

1. Passivation de Lamelles de verre avec PLL-PEG-biotine Cette étape est destinée à passiver la surface de sorte que les cellules adhèrent et migrent vers des régions spécifiques sur la lamelle de verre qui sont créés avec l&#39;impression microcontract (Étape 2-3a) ou par immersion lithographie stylo (étape 3b). Pour la passivation, un copolymère de poly-L-lysine (PLL) et de polyéthylène glycol (PEG), qui est utilisé dans 20% des molécules de PEG sont greffés à la biotine (PLL-PEG-biotine). <ol><li> Pour nettoyer des lamelles de verre (18 mm x 18 mm), les plonger dans un rack dans l&#39;éthanol à 100% et placer le support dans un bain de sonication pendant 30 min. Sécher les lamelles de verre dans l&#39;air ou dans un courant d&#39;azote. </li><li> Ensuite, soniquer les lamelles de verre pendant 30 min dans 1 M NaOH. Ensuite rincer les surfaces en verre trempé avec soin par le rack dans un bécher rempli avec 1,5 L Milli-Q H 2 O. Répétez le processus de rinçage à trois reprises avec frais Milli-Q H 2 O à chaque fois. Sécher les lamelles de verre dansun four à 60 ° C. </li><li> Placer la moitié du verre propre des lamelles de individuellement dans une chambre humide, qui est constitué d&#39;une plaque de 24 puits partiellement rempli d&#39;H 2 O. Déposer 15 ul de PLL-PEG-biotine (1 mg / ml) dans du PBS sur chaque lamelle de verre. Prenez l&#39;autre moitié des lamelles de verre qui restent propres et soigneusement sandwich à la solution de PEG. Laissez les lamelles pendant 1 heure dans la chambre humide. Faites glisser les lamelles en sandwich doucement les uns des autres sans racler la surface PEG-couché et les rincer à l&#39;eau Milli-Q H 2 O. L&#39;eau devrait glisser facilement sur le côté PEG-traitée. Si nécessaire, sécher à l&#39;air les lamelles de verre sur une serviette en papier avec la surface traitée vers le haut. Rangez les lamelles dans un dessiccateur sous vide jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol> 2. Fabrication des timbres pour l&#39;impression par microcontact Nous décrivons deux processus aux pistes de streptavidine motif sur les lamelles de verre passivé. Le premier, d&#39;un microimpression rocontact, nécessite généralement la fabrication d &#39;un maître silicium à partir duquel un timbre PDMS est jeté. Dans notre cas, le motif du timbre de PDMS sont de 100 um à l&#39;échelle lignes qui sont espacés de 290 um de centre à centre avec une hauteur caractéristique de 25 microns. Ci-dessous, nous décrivons brièvement comment fabriquer un maître silicium approprié (étape 2.1-2.3) et le timbre de PDMS (étape 2.4). Toutefois, il existe de nombreux protocoles pour l&#39;impression par microcontact décrits dans la littérature 19-23, qui sont appropriées pour l&#39;impression de motifs protéiques sur des lamelles de verre. Masters peuvent également être faits sur mesure et achetés auprès de sources commerciales. <ol><li> Tout d&#39;abord, nettoyer la tranche de silicium (4 &quot;de diamètre) en le incubation dans une solution piranha (3:1 v: v d&#39;acide sulfurique et de peroxyde d&#39;hydrogène à 30%). Pendant 20 min Rincer à fond la plaquette 10 fois avec MilliQ H 2 O. Sécher la plaque dans un four à 150 ° CO / N. </li><li> Rincer la plaquette de silicium propre et sec avec de l&#39;acétone à 100%, suivie de l&#39;alcool isopropylique à 100%. Suivantspin-couche 2 ml de GM1070 SU-8 de photorésist (Gersteltec Sarl) sur la plaquette à 3.100 tours par minute pendant 40 secondes pour créer une couche de 25 microns d&#39;épaisseur. L&#39;échantillon est ensuite cuit sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 5 min, puis encore 5 min à 95 ° C. </li><li> Exposer la résine photosensible SU-8 à la lumière UV pendant 60 secondes sous un photomasque avec le motif désiré (par exemple en utilisant un masque Quintel Q6000 alignement) et répétez le processus de cuisson décrire en 2.2. Puis l&#39;échantillon est mis au point en immergeant la plaquette dans SU-8 de révélateur (Gersteltec Sarl) pendant 4 minutes, on rince à l&#39;alcool isopropylique 100% et séché sous courant d&#39;azote. La superficie de la résine photosensible SU-8 qui n&#39;a pas été exposée à la lumière UV est ainsi éliminé, en créant le modèle inverse du timbre en PDMS. </li><li> L&#39;étape suivante consiste à jeter un timbre de PDMS par le maître de silicium. Tout d&#39;abord, bien mélanger 1 partie (en poids / poids) de l&#39;agent de durcissement avec 10 parties de prépolymère élastomère (Sylgard 184). Pour enlever les bulles d&#39;air, dégazer le mélange dans un dessiccateur attaché à une ligne de vidependant 1 heure. Ensuite, versez l&#39;élastomère PDMS sur le maître silicium dans une boîte de Pétri à environ 1 cm de hauteur et de durcir le mélange maître et PDMS dans une étuve à 70 ° C pendant 1 heure. Enfin, le cachet de PDMS est retiré du maître de silicium et coupé à la taille. </li></ol> 3. Streptavidine ou de motifs Cues adhésives sur des lamelles de verre passivés Après passivation des lamelles de verre, des motifs protéiques sont imprimés avec l&#39;impression par microcontact (étape 3a) ou lithographie dip-pen (Step 3b). Dans notre cas, la streptavidine est imprimé sous forme de lignes, qui forment la base pour des gradients de RGD (étape 4). La même procédure peut également être utilisée pour l&#39;impression de protéines de la matrice pour créer des motifs d&#39;adhésif. Une méthode alternative pour l&#39;impression par microcontact pour la structuration de biomolécules sur des surfaces est creux lithographie stylo. En plongeon lithographie stylo, un porte à faux est utilisé pour transférer un petit volume de solution sur la surface. La taille des cantilevers, viscosity de la solution, le temps de contact de la poutre sur la surface, hydrophobicité de la surface et de l&#39;humidité dans la chambre de déterminer la taille d&#39;impression des éléments imprimés. L&#39;avantage de cette méthode est que différents modèles peuvent être imprimés pour chaque expérience, car il n&#39;est pas nécessaire de fabriquer des maîtres et des timbres. L&#39;inconvénient est que cela prend plus de temps pour imprimer un motif donné et qui ont un pendage lithographie stylo nécessite un instrument spécialisé qui peut ne pas être disponible dans de nombreux laboratoires. L&#39;instrument lithographie dip stylo que nous avons utilisé était le NanoeNabler de Bioforce Nanosciences. Ici, nous avons imprimé des petits points qui étaient &lt;10 um de diamètre, pour lequel nous avons utilisé SPT10 cantilevers. 3a. Impression par microcontact (μCP) Technique <ol><li> Pour nettoyer et faire le tampon de PDMS plus hydrophile, traiter le côté motifs des timbres de PDMS dans une UV et à l&#39;ozone (par exemple, Procleaner Ozone UV Bioforce Nanosciences) pendant 1,5 heure. Vous pouvez également utiliser un plasmapropre pour un temps plus court dans le même but. Ce processus crée une surface 24 PDMS oxydé, ce qui améliore le processus d&#39;impression. </li><li> Immédiatement après le traitement à l&#39;ozone ou le plasma, le lieu et la propagation 10 pi de streptavidine (1 mg / ml dans du PBS) sur les timbres PDMS et laisser reposer pendant 1 heure dans une chambre humide (comme un partiellement rempli à 6 puits plaque, voir étape 1.3) . Si les pistes doivent être visibles au microscope fluorescent, utilisez la streptavidine qui est conjugué à un fluorophore tel que la streptavidine-AlexaFluor350. </li><li> Enlever l&#39;excès de streptavidine le tampon de papier de soie et de l&#39;air sec du tampon pendant environ 1 min. Appuyez légèrement sur le timbre sur la lamelle de verre PLL-PEG-biotine-enduit. </li><li> Si fluorescente streptavidine a été utilisé dans 3.A2 étape, examiner le motif à l&#39;aide en vertu d&#39;un microscope à épifluorescence. Conservez les surfaces imprimées dans un dessiccateur. </li></ol> 3b. Dip Pen Lithographie <ol><li> Tout d&#39;abord, mélanger 1 partie de 1 mg / ml de streptavidine ou streptavidin-AlexaFluor350 avec 10 parties de glycérol (v / v) et de charger 5 ul du mélange sur la console. Ensuite, commencer le processus d&#39;impression comme décrit dans le manuel d&#39;utilisation de l&#39;instrument lithographie dip stylo. Pour réduire la taille du point à environ 5 um, régler la vitesse d&#39;impression, le temps de contact du levier sur la distance de la surface verticale ou de la porte à faux à la surface. Dans l&#39;exemple illustré à la figure 2c, des points ont été imprimés, en ligne avec la ligne et la colonne de séparation mis à 10-15 um. Cette distance est suffisante pour éviter les points de fusion dans l&#39;autre, mais permet la visualisation de points multiples dans un seul champ de vue avec la plupart des paramètres du microscope. </li><li> Conservez les surfaces imprimées dans un dessiccateur. </li></ol> 4. Création de dégradés adhésif sur la streptavidine-modèle Surfaces On crée des gradients d&#39;adhérence de la biotine-RGD sur des lamelles de verre qui sont revêtues de streptavidine (figure 3) ou de contain modèles streptavidine sur des lamelles de verre passivé (figure 5). Pour créer un gradient de surface, nous avons utilisé un dispositif microfluidique disponible dans le commerce (appelé sticky-Slide chimiotactisme 3D à partir de Ibidi) qui crée un gradient de solution stable par diffusion passive. Pour en compétition pour les sites de liaison streptavidine, nous avons utilisé deux gradients opposés de la biotine et la biotine-RGD qui n&#39;était pas conjugué à RGD (voir Figure 1). <ol><li> Respecter les lamelles de verre recouvertes de streptavidine ou à motifs sur le côté collant du dispositif chimiotactisme collant-Slide 3D. Faire en sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuite pendant plusieurs heures, les bords du dispositif sont fermées par une fine couche de vaseline chauffée et d&#39;une seconde couche d&#39;un mélange de 1 partie de la vaseline à 1 partie de cire de paraffine (p / p). </li><li> Remplissez le canal de l&#39;appareil avec 6 pi de PBS dans le canal. Ensuite, remplissez les deux réservoirs avec 70 ul de 0,03 pg / pl biotine-4-fluorescéine dans du PBS et 70 m &amp;u; l de 0,03 pg / pl biotine-RGD dans du PBS, respectivement. Incuber les échantillons à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 1 heure. </li><li> Retirer les solutions biotine et rincer soigneusement la surface tout en restant attaché au dispositif microfluidique deux fois avec du PBS. Repérer le sens de la pente adhésif et, si nécessaire, stockez pas l&#39;appareil rempli de PBS à 4 ° C pendant mais s&#39;assurer que l&#39;appareil ne se dessèche pas. Si nécessaire, d&#39;analyser le gradient de colle avec un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Étiquetage des cellules avec des fluorophores pour l&#39;imagerie des cellules vivantes Les cellules sont marquées avec des colorants fluorescents qui aident le suivi de cellules au microscope fluorescent. Sondes fluorescentes marqueurs communs sont des organelles, comme Syto 64 rouges, qui marque le noyau de la cellule. Pour ce faire, les cellules sont d&#39;abord lavées trois fois avec du PBS, puis incubées avec 1 uM Syto 64 Rouge dans un milieu de culture pendant 45 min et enfin lavé à trois reprises avec du PBS. S&#39;il vous plaît noter que les cellules ne doivent pas êtreconservés dans du PBS pendant de longues périodes de temps. Colorants alternatifs pour le suivi de la cellule sont des séries CellTracker cette tache le cytoplasme et sont conservés pendant la migration et la division cellulaire. La transfection de cellules avec la protéine de fusion fluorescente est particulièrement utile pour enregistrer les distributions subcellulaires d&#39;une protéine d&#39;intérêt lors de la migration. Cependant, les protéines fluorescentes photo-blanchiment généralement plus rapides que les colorants organiques de sorte que les observations à long terme peut ne pas être possible. 6. Chargement de cellules avec un dégradé Soluble dans le dispositif microfluidique <ol><li> Compter les cellules marquées par fluorescence et fendus en deux tubes du nombre de cellules égales. Lavez et remettre un tube de cellules avec un milieu contenant le facteur chimiotactique, comme moyen de modification de glucose bas Dulbecco Eagle (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Lavez et remettre l&#39;autre tube de cellules dans un milieu sans chimiotactique, c&#39;est à dire DMEM avec 0% de FBS. La concentration finaledes cellules dans chaque tube doit être de 5 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Retirez toutes les solutions du dispositif microfluidique (de l&#39;étape 4.3) et le placer sur la platine du microscope (voir l&#39;étape 7). Chargez 70 ul de cellules (5 x 10 5 cellules / ml dans du DMEM 0% FBS) dans un réservoir et 70 ul de cellules HeLa (5 x 10 5 cellules / ml dans 10% de FBS DMEM) dans un autre. Librement placer un ruban adhésif sur les réservoirs pour éviter l&#39;évaporation. Si les cellules à la surface sont pré-incubés avant l&#39;imagerie, il est souhaitable que les cellules sont chargées dans l&#39;appareil dans un milieu de croissance sans gradient. Le dispositif est ensuite placé sur la platine du microscope et les médias remplacée par gradient médias DMEM sans SVF soit dans un réservoir et du DMEM avec 10% de FBS dans l&#39;autre. </li></ol> 7. Vivez imagerie cellulaire et analyse des données <ol><li> Allumer le microscope (Nikon Ti-E) et faire chauffer le stade au moins 1 heure avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Assurez-vous que le canal de la microfluidic dispositif est dans le champ de vision et les cellules sont au point. Sélectionner le paramètre d&#39;acquisition d&#39;image tels que les temps d&#39;exposition et les filtres fluorescentes, séquence d&#39;images de fond clair et fluorescence qui capture les cellules et les pistes ainsi que des points de temps et durée d&#39;enregistrement (par exemple toutes les 15 minutes pendant 16 heures). </li><li> Analyser les données avec des logiciels appropriés tels que ImageJ Manuel de suivi ou Ibidi chimiotactisme et de l&#39;outil de migration. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template.">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li></ol>

Nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts commerciaux à divulguer.

Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif microfluidique disponible dans le commerce (sticky-Slide chimiotactisme 3D à partir de Ibidi) pour étudier les effets des surfaces chimiquement modifiées et les gradients chimiotactiques sur la migration des cellules. Cette configuration ne nécessite pas de microfluidique écoulement car le gradient est établi par diffusion le long de la longueur du canal. Ceci est important parce que la circulation pourrait affecter différemment les cellules migrent ...

La migration cellulaire dirigée est une propriété fondamentale de nombreuses cellules et est un aspect clé de nombreux processus physiologiques normaux, y compris le développement embryonnaire, de la défense contre l&#39;infection et la cicatrisation. En outre, la migration cellulaire joue également un rôle important dans de nombreuses maladies telles que les maladies vasculaires, métastase des cellules tumorales et de 1,2 inflammation chronique. Alors que les états classiques de la migration cellulaire - polarisation, de vulgarisation, de formation saillie de l&#39;adhérence, la force et la rétraction arrière - sont généralement acceptés 3,4, l&#39;élucidation des mécanismes par lesquels l&#39;intégration spatio-temporelle du signal est coordonné a été plus difficile. La matrice extracellulaire (MEC) sert de substrat pour l&#39;adhésion cellulaire, et par l&#39;intermédiaire chimique et physique inhérente 5 6 diversité, fournit des signaux de direction pour la navigation cellule 7,8. En plus de ces indices adhésives 9, les facteurs solubles 10-12 &lt;/ Sup&gt; tels que les chimiokines et des facteurs de croissance peut induire la migration cellulaire dirigée par les récepteurs chimiotactiques et de leur signalisation en aval motogenic. À l&#39;heure actuelle, on ne sait pas si l&#39;engagement et de la signalisation par les récepteurs d&#39;adhésion (intégrines par exemple) ou des récepteurs chimiotactiques tels que récepteur tyrosine kinase (RTK), sont dominants. Il n&#39;est pas connu si les hiérarchies de systèmes de récepteurs sont spécifiques de type cellulaire. Microscopie de cellules vivantes donne une foule d&#39;informations qui n&#39;est pas accessible dans des essais en vrac et peuvent être combinés avec des dispositifs microfluidiques pour générer des gradients de 13,14 immobilisés indices et solubles 15 16. La méthode décrite ici utilise une série d&#39;étapes simples et établies pour la modification de surface en conjonction avec une chambre de disponible dans le commerce microfluidique pour créer un test d&#39;imagerie pour la migration des cellules qui peuvent être facilement mises en œuvre dans un laboratoire de biologie cellulaire (Figure 1). L&#39;assemblagedispositif microfluidique a des qualités optiques comparables à verre 17 et les gradients de molécules diffusibles sont stables pendant au moins 16 h. Le système peut être utilisé pour des techniques de microscopie à épifluorescence et avancé. Contrairement à d&#39;autres configurations de chimiotaxie 18, ce système est idéal pour enregistrer lentement migrateurs, les cellules adhérentes. Surtout, le système est modulaire et permet facilement la mise en place de l&#39;adhésif de remplacement ou des indices de migration solubles et l&#39;examen des différents types cellulaires.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Cellules peut détecter et à migrer vers des concentrations plus élevées de signaux adhésives telles que les glycoprotéines de la matrice extracellulaire et des signaux solubles tels que les facteurs de croissance. Ici, nous décrivons une méthode pour créer des gradients opposés de repères adhésifs et soluble dans une chambre microfluidique, qui est compatible avec l&#39;imagerie de cellules vivantes. Un copolymère de poly-L-lysine et de polyéthylène glycol (PEG-PLL) est employée pour passiver des lamelles de verre et empêcher l&#39;adsorption non spécifique de biomolécules et de cellules. Suivant l&#39;impression par microcontact, ou immersion lithographie stylo sont utilisés pour créer des voies de la streptavidine sur les surfaces passivées à servir de points d&#39;ancrage pour le peptide biotinylé arginine-glycine-acide aspartique (RGD) comme le repère adhésif. Un dispositif microfluidique est placé sur la surface modifiée et utilisée pour créer le gradient de signaux adhésives (100% RGD RGD à 0%) sur les pistes de streptavidine. Enfin, le dispositif microfluidique même est utilisé pour créer un dégradé de succès chimiotactiqueh comme sérum de veau foetal (FBS), que le signal soluble dans le sens inverse du gradient d&#39;indices adhésives.

Pour comprendre comment les cellules intègrent les signaux migratoires 25, nous avons développé une méthode pour imager des cellules par microscopie de fluorescence qui migrent dans un environnement avec des gradients concurrents adhésives et soluble (figure 1). Pistes adhésives qui contiennent streptavidine fluorescente et RGD biotinylé a été créé avec des pistes microcontacts imprimés et trempette lithographie stylo (figure 2). L&#39;impression par microcontact ...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Une méthode pour l&#39;assemblage des gradients adhésives et soluble dans une chambre microscopique direct des études sur la migration des cellules est décrite. L&#39;environnement technique combine des surfaces adhésives anti-salissures et les pistes de solutions avec des dégradés et permet donc de déterminer l&#39;importance relative des signaux de guidage.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vues.  The University of New South Wales. Une méthode pour l'assemblage des gradients adhésives et soluble dans une chambre microscopique direct des études sur la migration des cellules est décrite. L'environnement technique combine des surfaces adhésives anti-salissures et les pistes de solutions avec des dégradés et permet donc de déterminer l'importance relative des signaux de guidage.

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Insertion de flexible Neural sondes utilisant renforts rigides attachés avec Biodissolvable adhésif

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...