Les auteurs remercient W. Sun et K. Jansen pour les discussions critiques, et reconnaissent le soutien du laboratoire de biomécanique Nano à l&#39;Université nationale de Singapour. NAK reconnaît support par une bourse Marie Curie IIF.

1. Cellule récolte <ol><li> Obtenir MD-MBA-231 cellules provenant de la 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Détacher les cellules de tissus plaque de culture à l&#39;aide de 0,5% de solution de trypsine-EDTA. Utiliser 1 ml de solution de trypsine-EDTA pour la cellule en culture dans un flacon T25. </li><li> cellules de granules dans un tube de 15 ml conique par centrifugation à 200 g pendant 4 min, aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 5 ml de milieu de culture. </li><li> Compter densité cellulaire, ρ, en utilisant un hémocytomètre. Remarque: Pour préparer le gel interne cellule graines, la suspension cellulaire sera par la suite être dilué 10 fois pour atteindre la densité finale de l&#39;ensemencement des cellules. Par conséquent, 10 × concentré suspension de cellules est nécessaire. </li><li> Calculer le volume de milieu nécessaire pour obtenir une concentration de 10 × portable: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Remarque: Une densité finale de l&#39;ensemencement des cellules, c finale, d&#39;environ 215; 10 6 cellules / ml est recommandée pour les MD-MBA-231 cellules et sont utilisées dans ce protocole. Autres densités de semis peuvent également être explorées pour d&#39;autres types de cellules. </li><li> Pellet cellules une plus de temps dans un tube de 15 ml conique par centrifugation à 200 g pendant 4 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans la quantité requise (milieu de V calculées à l&#39;étape 1.3) de milieu de culture cellulaire exempt de sérum soigneusement afin de minimiser l&#39;agglutination des cellules. Remarque: Le rouge de phénol est auto-fluorescent, et peut interférer avec l&#39;imagerie de fluorescence / réflectance. Utilisation d&#39;un milieu dépourvu de rouge de phénol peut être envisagée pour obtenir la meilleure qualité d&#39;image. </li></ol> 2. Préparation des solutions de collagène <ol><li> Obtenir la solution mère de collagène, tampon de 10 × PBS, Milli-Q H 2 O, NaOH 0,1 M, et plusieurs microtubes. Conservez tous sur la glace pour empêcher la polymérisation prématurée de collagène, et de maintenir l&#39;état stérile. </li><li> Equilibrer une verrerie stérileplat de fond en chauffant dans la 37 ° C incubateur. Remarque: Tous les volumes de ce protocole ont été optimisés pour un plat à fond de verre de 12 mm ainsi. Si un autre type de plat est utilisé, ajuster les volumes en conséquence. </li><li> Calculer le volume requis nécessaire pour préparer 50 pi de 2,4 mg / ml de solution de collagène pour le gel interne (solution I) en fonction de la concentration du collagène de stock. Note: D&#39;autres concentrations de collagène pour le gel interne peut également être utilisé. </li><li> Dans un environnement stérile (typiquement une hotte de biosécurité), ajouter lentement 5 ul de 10 x tampon PBS à la quantité nécessaire de solution de collagène de stock (calculée à l&#39;étape 2.3) remuer doucement. Prenez soin d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Ajuster le pH du mélange à 7,4 en utilisant du NaOH 0,1 M à l&#39;aide pH-mètre étalonné. A titre indicatif, environ 5 pi utiliser pour amener le pH proche de 7,4 (le montant varie en fonction de la concentration en stock et pH). Remarque: Notez que les volumes impliqués dans ceétape est trop petite pour l&#39;utilisation de pH-mètre standard. Utilisez l&#39;une des astuces suivantes: <ol><li> Préparer des solutions de collagène pour des échantillons multiples. Ajuster le pH en vrac utilisant pH-mètre standard et distribuer les solutions de collagène dans les échantillons. </li><li> En variante, ajuster le pH d&#39;une solution de collagène en grand volume (i. E., Volume qui permettent l&#39;utilisation de pH-mètre standard). Notez la quantité de NaOH nécessaire pour amener le pH au pH final. Réduire les volumes et utiliser la quantité appropriée de NaOH pour l&#39;expérience. Confirmer la valeur du pH en utilisant du papier tournesol. </li><li> Sinon, utilisez un micro électrode de pH pour ajuster avec plus de précision le pH de petites quantités. </li></ol></li><li> Porter la solution à un volume de 45 ul en utilisant H 2 O. Effectuez toutes les étapes sur la glace pour empêcher la polymérisation prématurée de collagène. </li></ol> 3. Formation de Concentric Gel Culture <ol><li> Sortez le plat à fond de verre préchauffé (voir l&#39;étape 2.2) à partir de ee incubateur. </li><li> Ajouter 5 ul de la suspension cellulaire concentrée 10 x (préparé à l&#39;étape 1.5) de solution I. Remettre en suspension soigneusement. Prenez soin d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air. Le mélange a maintenant un volume de 50 ul et contient la concentration finale de collagène (2,4 mg / ml) et la densité cellulaire (c finale = 2 × 10 6 cellules / ml). </li><li> Ajouter 20 ul de la solution contenant les cellules I lentement vers le centre du puits, de manière à former une gouttelette en forme de dôme (figure 1A). Prenez soin d&#39;éviter la formation de bulles à cette étape. Si une bulle se forme, avec soin, mais rapidement essayer de rompre soit ou sucer à l&#39;aide d&#39;une pipette. Placez délicatement le plat dans l&#39;incubateur de laisser le gel interne polymériser pendant 45 min. </li><li> Préparer la solution O (pour le gel de collagène extérieur, acellulaire) environ 15 min avant la fin de cette étape d&#39;incubation. Remarque: La condition de gel extérieure peut varier en termes de concentration de collagène et la polymérisation à pHobtenir des réseaux avec 10 différentes microstructures. Dans ce protocole, se concentrer sur un 1,5 - / gel de collagène ml 4,0 mg polymérisé à un pH de 7,4. <ol><li> Basé sur la concentration de collagène boursier, calculer le volume requis nécessaire pour préparer 200 pi de collagène solution O à la concentration finale. </li></ol></li><li> Ajouter 20 ul de 10 x tampon PBS lentement à la quantité requise de solution de collagène de stock (calculée à l&#39;étape 3.4) remuer doucement. Ajuster le pH du mélange à la pH final en utilisant du NaOH 0,1 M à l&#39;utilisation de pH-mètre étalonné. Voir la note à l&#39;étape 2.5 concernant l&#39;ajustement du pH. </li><li> Porter la solution à un volume final de 200 ul en utilisant H 2 O. Effectuez toutes les étapes sur la glace pour empêcher la polymérisation prématurée de collagène. </li><li> Sortez le plat de l&#39;incubateur après 45 min polymérisation du gel interne (voir l&#39;étape 3.3). Ajouter doucement 180 ul de solution S sur le dessus du gel interne, de sorte que la solution couvre complètement la intérieuregélifier et remplit le puits (figure 1B). <ol><li> Effectuez attentivement cette étape sans agitation de la solution, qui peut conduire à des orientations de fibres non-uniformes dans le gel extérieure. Prenez soin d&#39;éviter de toucher le gel intérieure avec une pointe de pipette, et d&#39;éviter la formation de bulles ou de poches d&#39;air. Si une bulle se forme, avec soin, mais rapidement essayer de rompre soit ou sucer à l&#39;aide d&#39;une pipette. Placez délicatement le plat dans l&#39;incubateur de laisser le polymériser de gel extérieure. </li></ol></li><li> Sortez le plat de l&#39;incubateur après 45 min de polymérisation. Le gel doit être déjà assez solidifié à ce point, mais il peut encore se détacher de la surface inférieure se il est manipulé environ. <ol><li> Verser doucement 2 ml de réchauffé milieu de culture de cellules à l&#39;antenne (figure 1C). Assurez-vous que le gel est complètement immergé dans le milieu. Actualiser le milieu tous les 2-3 jours pendant la durée de la culture. </li></ol></li></ol> 4. Imagerie des cellules vivantes <ol><li> Effectuer imagerie utilisant un microscope confocal inversé équipé capacité d&#39;imagerie live-cellulaire à long terme. Inclure un haut-chambre d&#39;incubation avec une température (37 ° C) et CO 2 (5%) de contrôle. Allumez le microscope et réchauffer la scène au moins une heure avant de commencer l&#39;expérience. Remarque: Utilisez objectif à longue distance de travail pour optimiser l&#39;observation et la localisation des cellules dans les gels 3D. </li><li> Incuber le gel dans un milieu contenant 5 ul de colorant fluorescent d&#39;analyse de cellule pendant 30 min pour permettre une localisation précise des cellules dans le système 3D. Par la suite, retirer le colorant non lié par lavage trois fois avec 1 × PBS. Ensuite, ajouter du milieu de culture de cellules à l&#39;antenne. </li><li> Sortez le plat de l&#39;incubateur et le placer sur la platine du microscope (figure 1D). Remarque: l&#39;imagerie cellulaire Live peut commencer, en principe, juste après la polymérisation du gel extérieure. Toutefois, à ce stade, les cellules in Le gel internes ne ont pas encore se propager. Pour examiner la migration des premières cellules qui ont envahi le gel externe, l&#39;imagerie des cellules vivantes peut commencer à 24 heures (en fonction du type de cellule) après le début de la culture. A titre indicatif, environ 12 à 14 jours de culture sont nécessaires pour la plupart des cellules dans le gel intérieur pour pénétrer dans le gel extérieure. </li><li> Sélectionner les volumes de vue (de VoV) dans les régions dans le gel externe entourant le gel interne. Après 24 heures d&#39;incubation, la population de cellules se sont propagées, traversé l&#39;interface entre les gels intérieures et extérieures, et a commencé à envahir le gel extérieure. <ol><li> Pour la VoV&#39;S, inclure les régions de gel immédiatement à côté de l&#39;interface de gel, les régions intermédiaires, et les régions à proximité de la périphérie extérieure du gel 7. Exclure des régions plus proches de 50 um à partir des surfaces inférieure et latérales, ainsi que par le haut du gel, pour éviter d&#39;éventuels effets de bord. Chaque VoV mesure typiquement 647 × 647 × 100 um 3 (en x, y et z, respectivement), avec intervalle de 5 um dans le z -stack. </li></ol></li><li> Assurer modes d&#39;imagerie, les canaux / filtres, temps d&#39;exposition, et des résolutions d&#39;images sont correctement sélectionnés. Pour l&#39;imagerie sans étiquette du réseau de collagène, utiliser la microscopie confocale de réflectance simultanément pendant le time-lapse imagerie des cellules vivantes. </li><li> Prenez des exemples d&#39;images, tracer les histogrammes d&#39;intensité, et ajuster les gains et les décalages pour observer un signal suffisamment et éviter la saturation en se assurant que l&#39;histogramme se situe entre zéro et l&#39;intensité maximale. Ne pas modifier ces paramètres plus pendant toute la durée de l&#39;expérience. </li><li> Prenez des photos de time-lapse de la VOV de sélectionnés, avec un intervalle de temps, Δ t, de 10 min pour 8 heures (ou plus si nécessaire). </li></ol> 5. Suivi cellulaire et l&#39;analyse des données <ol><li> Effectuer l&#39;image quantitative de post-traitement des images -stack z en utilisant appropriée.Boîte<html> te logiciel de traitement d&#39;image. <ol><li> Segmenter les images time-lapse pour sélectionner automatiquement les positions de cellules en 3D dans (x, y, z, t). </li><li> Pour chaque image, vérifier manuellement la précision de la localisation et de supprimer des faux positifs dus à des débris cellulaires et des saillies cellulaires qui peuvent avoir été pris pour cellules. Éliminer les cellules prolifératives de l&#39;analyse et des cellules qui se chevauchent ou connectés divisés en objets distincts. </li></ol></li><li> Générer des pistes en 3D de cellules laps de temps à partir des coordonnées de la cellule (x, y, z, t) obtenue à l&#39;étape précédente en reliant l&#39;emplacement de chaque cellule dans la séquence de temps. </li><li> Éliminer le bruit aléatoire et le système en supprimant les pistes plus courtes que la longueur seuil de piste (généralement de 20 min). </li><li> Corriger la dérive de l&#39;échantillon en soustrayant les déplacements nets globaux des pistes si nécessaire. </li><li> Calculer le déplacement de la cellule,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, et la distance de la migration cellulaire, <img alt="Équation 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , À partir des trajectoires de cellules observées, où est un vecteur représentant la position 3D d&#39;une cellule à une fois et est le nombre total de points dans le temps. <ol><li> Calculer la vitesse de la cellule en tant que S = d / (n • Δ t), où Δ t est l&#39;intervalle de temps entre les trames. Calculer la directionnalité de la migration cellulaire (ou la persistance) en utilisant P = Dd / j. Cette simple mesure de la persistance implique que pour P = 0, le déplacement net est nul et P = 1 la trajectoire est une ligne directionnelle droite. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. 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H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

Migration de cellules joue un rôle clé dans diverses réponses physiologiques tels que le développement embryonnaire, l&#39;hémostase et la réponse immunitaire ainsi que dans les processus pathologiques tels que les maladies vasculaires, l&#39;inflammation et le cancer 1. Disséquer les facteurs biochimiques et biophysiques sous-jacentes migration cellulaire est donc fondamentalement important non seulement de comprendre les principes de base des fonctions cellulaires, mais aussi pour faire avancer diverses applications biomédicales, comme dans l&#39;ingénierie tissulaire, anti-métastases et le développement médicament anti-inflammatoire. Depuis l&#39;observation in vivo est techniquement difficile, beaucoup d&#39;efforts ont été concentrés sur la récapitulation in vitro de migration cellulaire. Les méthodes in vitro pour étudier la migration cellulaire ont été largement conçu pour des essais sur deux (2D) des surfaces tridimensionnelles, notamment la rayure ou de cicatrisation dosage 2. Ces essais offrent dispositif expérimental simple, facile bétailimagerie cellulaire, et de fournir des indications utiles sur divers mécanismes biochimiques sous-jacents migration cellulaire. Cependant, ces essais ne représentent pas la matrice (ECM), l&#39;architecture et le remodelage extracellulaire, qui sont des aspects critiques dans la compréhension de la migration in vivo. Récemment, il a été de plus en plus apprécié qu&#39;un modèle de culture 3D, souvent dans des matrices à base de collagène 3, fournit une plate-forme qui ressemble davantage à la situation in vivo. En effet, les cellules présentent dynamiques migratoires qui sont distincts de ceux sur les surfaces 2D, en particulier en raison de la dimension différente de l&#39;environnement 4. En outre, les propriétés biophysiques et mécaniques de la matrice de sensibilité affectent la migration des cellules 5, notamment dans le contexte de l&#39;invasion des cellules tumorales 6. Ici, nous présentons une méthode pour étudier 3D comportement de migration cellulaire dans ECM avec des propriétés biophysiques qui peuvent être facilement varié avec des conditions de préparation. Les cellules sontensemencées dans un &quot;gel interne» et sont autorisés à se échapper dans et envahir le &quot;gel externe&quot; initialement acellulaire. La méthode repose sur la capacité de reconnaître la présence de, et la propension de la cellule à migrer dans, les régions exemptes de cellules dans le gel externe, qui est étroitement liée à la cellule mechanosensing 7. Dans cette étude, nous employons des réseaux de collagène que les ECM envahies par les cellules du cancer du sein très envahissante, MD-MBA-231. Les propriétés mécaniques et la microstructure à la fois des gels intérieure et extérieure peuvent être réglés 8 et 9 caractérisé pour obtenir des conditions physiologiquement pertinentes. La reconstruction et l&#39;analyse des pistes cellulaires permettent Examen quantitative détaillée du comportement de migration spatio-temporelle, tant au niveau de la population et le niveau de la cellule individuelle. Fait important, le programme d&#39;installation du système de gel concentrique vivo imite la topologie du tissu en face de la migration des cellules, en particulier d&#39;invasion des cellules cancéreuses, offrant ainsi des informations importantes endes mécanismes physiques de la migration cellulaire et la métastase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

La capacité des cellules à migrer est crucial dans une grande variété de fonctions cellulaires long de la vie de développement embryonnaire et la cicatrisation des plaies de la tumeur et les métastases du cancer. Malgré les efforts de recherche intenses, les principes biochimiques et biophysiques de base de la migration des cellules ne sont pas encore entièrement compris, en particulier dans les micro-environnements (3D) en trois dimensions physiologiquement pertinents. Ici, nous décrivons un essai in vitro destiné à permettre l&#39;examen quantitatif de 3D ​​comportements de migration cellulaire. Le procédé exploite la capacité et mechanosensing propension de la cellule à migrer dans la matrice extracellulaire précédemment inoccupé (ECM). Nous utilisons l&#39;invasion des cellules cancéreuses du sein hautement invasives, MDA-MB-231, dans des gels de collagène en tant que système modèle. La propagation de la population de cellules et de la dynamique de migration des cellules individuelles pendant des semaines de la culture peuvent être surveillés en utilisant l&#39;imagerie des cellules vivantes et analysées pour extraire des données spatio-temporellement résolues. En outre, La méthode est facilement adaptable pour diverses matrices extracellulaires, offrant ainsi un moyen simple mais puissant pour étudier le rôle de facteurs biophysiques dans le microenvironnement sur la migration cellulaire.

L&#39;analyse sur gel concentrique présenté ici a été réalisée en utilisant des cellules de cancer du sein hautement invasives, MDA-MB-231, avec 2,4 mg / ml de gel de collagène interne et une densité d&#39;ensemencement de cellules de = 2 × 10 6 cellules / ml, par exemple. Comme le montre la figure 2, généralement après quelques jours de culture, les cellules ont violé l&#39;interface de gel interne-externe et ont commencé à envahir le gel extérieure. La population de cellules...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Les propriétés mécaniques et la microstructure de la matrice extracellulaire affectent fortement la migration de cellules 3D. Une méthode in vitro pour étudier le comportement de migration cellulaire spatio-temporelle dans des environnements biophysique variables, à des niveaux de cellules individuelles à la fois la population et, est décrit.

Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K vues.  FOM Institute AMOLF.  Les propriétés mécaniques et la microstructure de la matrice extracellulaire affectent fortement la migration de cellules 3D. Une méthode in vitro pour étudier le comportement de migration cellulaire spatio-temporelle dans des environnements biophysique variables, à des niveaux de cellules individuelles à la fois la population et, est décrit. 

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Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Recherche

Bio-ingénierie

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Mesure des métalloprotéinases de la matrice cellulaire Global et l’activité métabolique des Hydrogels 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Support composite à matrice microgel-extracellulaire pour l’impression 3D intégrée de constructions neuronales humaines

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

Utilisation de réseaux de nanofibres de carbone pour une livraison efficace de biomolécules et de colorants aux plantes

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Pleins feux sur l’auteur : Libérer la transformation des usines en innovant avec des réseaux de nanofibres de carbone 

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

Utilisation de réseaux de nanofibres de carbone alignés verticalement sur des substrats rigides ou flexibles pour l’administration de biomolécules et de colorants aux plantes

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...