This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Préparation de la migration Chambers <ol><li> Préparer une gelée de paraffine / pétrole (1: 1) mélanger et chauffer jusqu&#39;à ce que le mélange soit fondu. Utilisation d&#39;un pinceau et tirer 2-3 couches de la gelée de paraffine / éther de pétrole (1: 1) mélanger dans le milieu de la lame de verre, conformément aux figures 1B-1D. NOTE: Nous utilisons des lames de verre communes (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (L / P / H)) </li><li> Appliquer le mélange de gelée de paraffine / pétrole fondu rapidement sur la lame de verre pour éviter la solidification pendant le dessin. S&#39;assurer que la couche de gelée de paraffine / pétrole est d&#39;environ 2-2,5 cm de long et 0,3-0,5 cm de largeur. L&#39;épaisseur de la couche de gelée de paraffine / pétrole doit être d&#39;environ 0,1 à 0,15 cm. </li><li> Ajouter une lamelle à la cire de paraffine solidifiée / mélange de gelée de pétrole et sceller de deux à trois couches de paraffine mélange de gelée cire / de pétrole (figures 1E, 1F). Utilisez 4-8 chambres de migration pour une expérience de la migration cellulaire commun. Lieu migration chambres iN en position verticale dans un rack. </li></ol> 2 Préparation de la suspension cellulaire de collagène Mix <ol><li> Récolte (par exemple, avec 0,25% de trypsine / EDTA) et compter les cellules d&#39;intérêt. Remettre en suspension les cellules dans du milieu complet contenant du sérum de veau foetal (SVF), les antibiotiques et les suppléments recommandé. Préparation 8.4 1,5 ml et les tubes de réaction de 20 ul de suspension de cellules contenant de 4 à 6 x 10 4 cellules (le nombre total de cellules dépend du type de cellules à analyser) et remplir à 50 ul avec du milieu complet. REMARQUE: Des composés supplémentaires (par exemple, facteurs de croissance, des chimiokines, des inhibiteurs, etc) sont ajoutés à la suspension cellulaire. Utilisation des solutions mères appropriés, tels que le volume final de la suspension cellulaire ne dépasse pas 50 pi. </li><li> Préparer un montant total de 452 ul finale suspension de collagène pour quatre expériences de migration cellulaire. Ajouter 50 ul de MEM 10 x (pH 5.1 à 5.5) et 27 ul d&#39;une solution de bicarbonate de sodium à 7,5% (pH 9,0 à 9,5) Dans un tube de réaction de 1,5 ml et mélanger soigneusement. Observez la solution couleur tour du jaune-orangé au violet intense (pH 9,0-9,5). Ajouter suspension de collagène 375 pi liquide à l&#39;/ solution de bicarbonate de sodium 10x MEM et bien mélanger. Le pH de la suspension de collagène finale doit être d&#39;environ 7,5 (indiqué par une couleur violet clair). REMARQUE: Vérifiez le pH de la solution de bicarbonate de sodium à 7,5%. Si le pH est d&#39;environ 7,5 au lieu de la solution de bicarbonate de sodium avec un couvercle ouvert dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) d&#39;être saturé en CO 2 et d&#39;augmenter le pH (environ 9,0 à 9,5). Le pH de la suspension de collagène cellule de mélange est essentiel pour la stabilité du réseau de collagène. Si elle est trop faible, le réseau de collagène se replier lors de l&#39;expérience de la migration cellulaire. NOTE: Pour ce protocole, utilisez collagène liquide (pH 1,9-2,2) depuis l&#39;arrière bovine (2.9 à 3.3 mg / ml de collagène; 95% de collagène de type I, 5% du collagène de type IV). Des exemples de protocoles de préparation de treillis plus de collagène à l&#39;aidecollagène de type I provenant d&#39;autres sources, telles que porcine ou rat, sont donnés en 32,33. Ne pas modifier les volumes des solutions utilisées que ceci modifie la concentration finale de collagène de 1,67 mg / ml de la maille. Une concentration de collagène plus ou moins élevée a un impact sur ​​la densité des fibres de collagène et la distance moyenne entre les concomitante avec les cellules de comportement migratoire 34. </li><li> Ajouter 100 ul de la suspension finale de collagène à 50 ul de suspension cellulaire et mélanger thoroughly.The suspension finale de collagène (1,67 mg / ml de collagène) est légèrement visqueux. Pour transférer le montant exact (100 pi), la pipette la solution finale de collagène, une fois de haut en bas avant de le transférer à la suspension de cellules. Remarque: Une fois que le mélange de cellules en suspension de collagène est combiné avec la solution de bicarbonate / sodium 10x MEM et la valeur de pH de 7,5 a changé les fibres de collagène commencent immédiatement à polymériser. </li><li> Transférer la dernière cellule mélange collagène de suspension de eréaction tubes e aux chambres de migration. Tapoter doucement la chambre de migration à répartir équitablement la cellule mélange collagène de suspension sur le fond de la chambre de migration (Figure 1H). Placer les chambres de migration dans une position verticale dans un bâti et incuber pendant environ 30 minutes (37 ° C, 5% CO 2) pour permettre la polymérisation des fibres de collagène. </li><li> Notez que le réseau de collagène polymérisé est légèrement trouble, mais toujours en étant léger couleur pourpre. Remplir les chambres de migration avec un milieu complet ou un milieu complet avec des suppléments d&#39;intérêt et sceller la chambre de migration avec de la gelée de paraffine / pétrole mélange (figures 1I, 1J). </li></ol> 3. enregistrement et l&#39;analyse de la migration cellulaire Cette section décrit l&#39;enregistrement de la migration cellulaire par time-lapse vidéo microscopie et analyse de la migration cellulaire par un suivi manuel de la cellule. <ol><li> Allumez le microscope et la HEA platine du microscopeter. Ajuster la température à 37 ° C. Utilisez un objectif 10X. Passer chambre de migration sous un microscope et concentrer à environ 50 cellules ou plus dans le champ de vision. </li><li> La migration des cellules d&#39;enregistrement en mode time-lapse en utilisant un logiciel de surveillance vidéo multi-caméras. Enregistrer des films de la migration des cellules dans un format approprié, par exemple, &quot;* avi» ou «* mov&quot;. Lier les fichiers vidéo de la migration des cellules à une base de données contenant des informations à l&#39;appui, comme le type de cellule et des conditions expérimentales. NOTE: Nous enregistrons les lymphocytes et les HSPCs jusqu&#39;à 2 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1:80, ce qui signifie que 0,75 s en time-lapse est égal à 1 min en temps réel. Les cellules tumorales sont des cellules lents et sont ainsi enregistrées pendant au moins 16 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1: 1800 (0,5 s en time-lapse est égale à 15 min en temps réel). </li><li> Analyser films de migration cellulaire en utilisant un logiciel de suivi de la cellule appropriée, comme les greffons logiciels ImageJ(Un aperçu est donné dans 18). Pour une analyse impartiale, il est d&#39;une importance cruciale que les cellules seront choisis au hasard à l&#39;insu si les cellules sont actives ou non migrateurs. NOTE: Nous utilisons un logiciel auto-développé pour suivre manuellement les chemins d&#39;au moins 30 cellules par expérience en suivant les cellules se déplacent avec précision le curseur de la souris (qui est positionné pour le noyau). Bien que le suivi, les coordonnées xy des cellules chenilles sont automatiquement déterminés conformément au mode time-lapse utilisé. Pour les lymphocytes / HSPCs coordonnées xy sont déterminées chaque 0,75 s (égale à 1 min en temps réel), alors que pour les cellules tumorales les coordonnées xy sont déterminées chacune 0,5 s (égale à 15 minutes en temps réel). </li><li> Déterminer un total de 60 coordonnées xy par cellule pour une expérience de la migration cellulaire typique. Elle est égale à 1 heure en temps réel pour les lymphocytes / HSPCs et 15 heures en temps réel pour les cellules tumorales. A &quot;,&quot; indique que la cellule n&#39;a pas bougé entre two points dans le temps, alors qu&#39;un &quot;valeur numérique&quot; indique la distance en &quot;pixels&quot; d&#39;une cellule est déplacé entre deux points dans le temps (figure 2A). REMARQUE: suivi manuel de cellules requiert de l&#39;expérience. Particulièrement cellules migrantes rapide sont difficiles à suivre et chaque pièce de type de cellule un comportement migratoire distincte qui pourrait être déclenchée par des facteurs complétées. Dans le cas de la division cellulaire tout en suivant, choisissez au hasard une cellule fille pour le suivi continue. Les cellules qui migrent hors du champ de vue ou meurent tandis que le suivi ne sont pas négligés, mais sont pris en compte pour l&#39;analyse. </li></ol> Analyse 4. données <ol><li> Analyser les données de suivi de la cellule en utilisant un logiciel approprié, par exemple, un tableur. <ol><li> Analyser les données de suivi de la cellule en copiant le suivi des données brutes (figure 2A) cellule, dans un modèle de feuille de calcul auto-conçu. Multipliez somme des «valeurs numériques», représentantla distance totale d&#39;une cellule a migré avec un facteur de correction pour convertir &quot;pixel&quot; en &quot;um&quot;. </li><li> Déterminer deux paramètres de migration cellulaire: activité locomotrice (ce qui équivaut à un taux de migration) et le temps de déplacement actif (figures 2C, 2D). </li><li> Identifier les cellules qui ont migré inférieure à 25 um (niveau de seuil pour réduire le nombre de cellules faussement positives) en tant que cellules non en mouvement. Remplacer &quot;valeurs numériques» de ces cellules avec &quot;,&quot;. REMARQUE: Le paramètre &quot;activité locomotrice» (ou taux de migration) représente le pourcentage de cellules de la population cellulaire suivis qui ont déménagé entre deux points dans le temps (figure 2D). Une &quot;valeur numérique&quot; est définie comme une cellule mobile, tandis que &quot;,&quot; est définie comme une cellule non en mouvement. Le paramètre &quot;temps de déplacement actif» (active) représente le pourcentage du temps total d&#39;une cellule a migré en relation de la trame de temps de la période d&#39;observation (Figure 2C). Une &quot;valeur numérique&quot; indique que la cellule a été déplacé, tandis que &quot;,&quot; indique que la cellule n&#39;a pas bougé. Ce paramètre est en outre utilisé pour déterminer le nombre de cellules qui ne s&#39;est pas déplacé. </li></ol></li><li> Calculer la signification statistique et les données de migration de cellules d&#39;affichage. <ol><li> Calculer la signification statistique de l&#39;activité locomotrice moyenne de la cellules (taux de migration) en utilisant le test de Mann-Whitney. Considérons p-value &lt;0,05 comme significative. </li><li> Afficher l&#39;activité locomotrice moyen de cellules que xy-diagramme, BoxPlot schéma, ou comme un diagramme de graphique à barres. Afficher des données simples à base de cellules, telles que le temps de mouvement actif ou la vitesse, comme un diagramme de graphique à barres ou sous forme d&#39;histogramme. REMARQUE: Si le logiciel de feuille de calcul choisi ne contient pas un outil graphique ou histogramme BoxPlot une recherche en ligne doit être effectuée pour la recherche de tu adaptétorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La capacité de migrer est une caractéristique des cellules tumorales 4. Sans la capacité de se détacher de la tumeur primaire et la migration des cellules tumorales à travers les tissus conjonctifs environnants ne sera pas capable de semer des lésions secondaires, qui sont la cause principale de la mort de presque tous les patients atteints de cancer. En raison de cette relation de nombreuses études se concentrent sur la migration des cellules cancéreuses. Le but de ces études est l&#39;identificatio...

Comme la fusion cellulaire (pour un aperçu, voir 1,2) la migration cellulaire est un autre phénomène biologique qui est impliqué dans une multitude de processus physiologiques tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires (pour revue, voir 3). Cependant, la capacité de migrer est également une condition préalable pour les cellules tumorales à métastaser (pour revue, voir 3,4). La migration cellulaire est un complexe, pas procédé encore entièrement compris qui est dirigée par l&#39;interaction de plusieurs voies de transduction du signal initié par divers ligand (par exemple, des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance, les hormones, les composants de la matrice extracellulaire) récepteur (par exemple, les kinases de tyrosine du récepteur, récepteurs de chimiokines, intégrines) 5 interactions provoquant finalement la réorganisation du cytosquelette d&#39;actine concomitante ment et le remontage des complexes d&#39;adhésion focale et l&#39;intégrine-médiation de signalisation 6. in vitro et in vivo de la migration des cellules ont été développés au cours des dernières décennies, y compris le test Boyden chambre / transwell 7, zéro dosage / cicatrisation dosage 8-10, en trois dimensions ( 3D) matrice de collagène migration dosage 11 ainsi que intravital imagerie / microscopie (pour revue, voir 12). Chacun de ces essais de migration cellulaire a des avantages et des inconvénients, par exemple, concernant les coûts et les besoins de l&#39;équipement, de la manutention ou de la fiabilité des données obtenues. Tant la chambre / test transwell Boyden et le / la cicatrisation dosage dosage de zéro sont, à faible coût et facile dosages bien développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro 7-10. Dans la chambre de Boyden / cellules transwell d&#39;analyse sont ensemencées sur un insert contenant des pores (environ 8 m de diamètre) - le compartiment supérieur 7 soi-disant. En option, l&#39;insert peut être revêtu de m extracellulaireAtrix composants, par exemple, la fibronectine, le collagène, etc, afin d&#39;imiter un environnement plus physiologique. De même, les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur le dessus de l&#39;insert, imitant ainsi une barrière de cellules endotheliales 13. Les cellules qui sont passées à travers les pores pendant un intervalle de temps défini dans le compartiment inférieur hébergeant médias et les suppléments, tels que des facteurs de croissance et des chimiokines, sont utilisées comme une sortie de lecture quantifier la migration des cellules (ou extravasation). Dans le test de rayure / cellules d&#39;essai de cicatrisation sont ensemencées dans des plaques et sont cultivées jusqu&#39;à confluence 10. En fonction des plaques de montage expérimental peut être pré-revêtu avec des composants de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine. Après avoir créé une égratignure / plaies par grattage des cellules individuelles de monocouches de cellules de chaque côté de la rayure / blessure peut migrer dans l&#39;espace, remplissant ainsi / guérissant 10. La distance entre les deux côtés de la rayure / blessures est déterminéeen fonction du temps et est utilisé comme une sortie de lecture pour l&#39;activité de migration des cellules 10. Cependant, faire la distinction entre la prolifération cellulaire (ce qui pourrait également entraîner de remplissage / la guérison de la rayure / blessure) et la migration cellulaire, il est recommandé de combiner le dosage avec time-lapse microscopie vidéo et une seule cellule de suivi 10. Toutefois, la chambre de Boyden / test transwell et zéro dosage / cicatrisation dosage, sont assez imparfaite concernant un environnement cellulaire physiologique comme. Dans la chambre de Boyden / cellules d&#39;essai transwell ont à migrer à travers un pore plastique, tandis que dans le test de zéro / de cicatrisation des cellules d&#39;essai sont ensemencées sur une plaque de matière plastique pré-revêtu à deux dimensions. De même, il est bien connu que le comportement migratoire diffère sensiblement entre un environnement en deux dimensions et 3D 3. Par exemple, les adhérences tridimensionnel matrice de fibroblastes diffèrent des adhésions focales et sur deux fibrillaires caractérisésubstrats de dimension de leur contenu et de α5β1 intégrine avß3, la paxilline, d&#39;autres composants du cytosquelette, et phosphorylation de la tyrosine kinase d&#39;adhérence focale 14. De même, les cellules intégrées dans un environnement 3D s&#39;affichent également un comportement migratoire modifié 15. Ainsi, pour analyser la migration des cellules avec plus de précision un dosage de migration est recommandé permettant de mesurer la migration de cellules individuelles au sein d&#39;un milieu physiologique ou physiologique analogue à 3D. Intravitale imagerie / microscopie est l&#39;étalon-or pour mesurer la migration des cellules dans un contexte physiologique 3D. Cela ne fait pas partie des interactions matrice de cellules extracellulaires, mais aussi aux interactions entre les différents types de cellules, comme les cellules tumorales et les cellules endothéliales lors de l&#39;extravasation 16 ou le trafic des lymphocytes à l&#39;intérieur du ganglion lymphatique 17, qui, à ce jour, est possible grâce à l&#39;amélioration des techniques de microscopie par fluorescence, tels que le 2-photonmicroscopie confocale à balayage laser, l&#39;utilisation de colorants fluorescents vitaux et les souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dérivées 12,16,17. En outre, l&#39;imagerie intravitale / microscopie peut être combiné avec le suivi de la cellule manuelle et automatique 18. Toutefois, en raison de la nécessité d&#39;un 2-photon microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les animaux (et les modèles animaux transgéniques appropriés) intravitale imagerie / microscopie est une technique plutôt de coûteux. Pour surmonter les limitations de la chambre / essai transwell Boyden et l&#39;essai de cicatrisation dosage zéro / de la plaie et à analyser la migration de différents types de cellules dans un environnement 3D la détermination de la migration de la matrice de collagène 3D est développé 11,19. De ce fait, la migration des cellules sont incorporées dans un réseau de fibres de collagène en 3D, qui ressemble plus à la situation in vivo. Conjointement, en raison de time-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la déternation de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes et les leucocytes 11,20 souches hématopoïétiques, des cellules progénitrices / 21 à 24, et les cellules tumorales 5,25-29. En plus des cellules seule cellule également grappes ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l&#39;analyse de l&#39;émigration des cellules individuelles de l&#39;amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène 30,31. Ce protocole donne un aperçu d&#39;une technique simple, mais puissant pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules dans un environnement 3D - une méthode in vitro donnant des résultats qui sont proches de la situation in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

La capacité de migrer est une caractéristique de divers types de cellules et joue un rôle crucial dans plusieurs processus physiologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, et les réponses immunitaires. Cependant, la migration cellulaire est également un mécanisme clé dans l&#39;activation de ces cancers des cellules cancéreuses à se détacher de la tumeur primaire pour commencer la dissémination métastatique. Dans les dernières années, différents essais de migration cellulaire ont été développées pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules. Parce que le comportement locomoteur des cellules diffère nettement entre une à deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) l&#39;environnement, il peut être supposé que l&#39;analyse de la migration des cellules qui sont incorporées dans un environnement 3D donnerait à la migration cellulaire plus importante données. L&#39;avantage de l&#39;essai décrit à la migration de la matrice de collagène 3D est que les cellules sont incorporées dans un réseau 3D physiologique des fibres de collagène qui représentent la composante majeure de la matrice extracellulaire. Grâce àtime-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la détermination de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes / leucocytes, des cellules souches et des cellules tumorales. De même, aussi des amas de cellules ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l&#39;analyse de l&#39;émigration des cellules individuelles de l&#39;amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène. Nous concluons que le dosage de migration 3D de la matrice de collagène est un procédé polyvalent pour analyser la migration des cellules au sein d&#39;un environnement 3D physiologique analogue.

La détermination de la migration matrice 3D-collagène utilisé combiné avec time-lapse vidéo-microscopie et le suivi de la cellule assistée par ordinateur permet la détermination des différents paramètres de la migration des cellules, y compris les deux paramètres sur la population (par exemple, signifier activité locomotrice) et les paramètres à base de cellules individuelles (par exemple, le temps de déplacement actif, la vitesse, la distance migré). Un exemple des ensembles de données...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l&#39;intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K vues.  Witten/Herdecke University.  La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à...

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Recherche

Bio-ingénierie

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l&#39;écoulement des fluides interstitiels sur l&#39;invasion tumorale

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Préparation et analyse des<em&gt; In vitro</em&gt; Trois Breast Dimensional Carcinome Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.