Ce travail est soutenu par NHMRC Programme de subventions # 568969 (PSS) et de la Faculté de médecine, Université de New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).

Toutes les procédures ci-dessous sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques à l&#39;intérieur d&#39;un cabinet de classe II prévention des risques biotechnologiques. Réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans les tableaux ci-dessous. 1. Préparation d&#39;alginate 1,1% (p / v) <ol><li> Ajouter 0,275 g de l&#39;alginate de sodium purifié (haute teneur en acide glucuronique ≥ 60%, la viscosité&gt; 200 mPa.s, et l&#39;endotoxine ≤ 100 UE / g) dans un tube stérile de 50 ml et ajouter 25 ml de solution stérile 0,1% de gélatine préparée plus tôt (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H 2 O et dissous par autoclavage). </li><li> Vortexer le tube pendant environ 30 secondes pour dissoudre partiellement la poudre d&#39;alginate, puis placer le tube sur un mélangeur orbital à 10 xg pendant la nuit (température ambiante). </li><li> Ajouter 2,778 ml de NaCl 9% stérile (4,5 g de NaCl/50 ml milli-Q H 2 O) à 25 ml de solution d&#39;alginate. Vortexer le tube pendant environ 30 secondes suivi par centrifugation à 95 xg pendant 5 min. </li><li> Conserver la solution d&#39;alginate à 4 °; C pour stockage à court terme (1-2 mois) ou à -20 ° C pour stockage à long terme (environ un an). </li></ol> 2. Préparation de Bath CaCl Précipitations 2 <ol><li> Dissoudre 14,7 g de CaCl 2. 2H 2 O et 2,38 g d&#39;HEPES dans 1 litre d&#39;eau Milli-Q H 2 O. </li><li> Réglez le niveau de pH à 7,4. </li><li> Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 um. </li><li> Bain de précipitation peut être conservé à température ambiante (6-12 mois). </li></ol> 3. Préparation de désencapsulation solution <ol><li> Dans 500 ml de phosphate de Dulbecco Buffered Saline (D-PBS), ajouter 50 ml d&#39;EDTA 0,5 M et 5 ml de HEPES 1M. </li><li> Stériliser l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um ou autoclave à 121 ° C pendant 20 min. </li><li> Conserver la solution décapsuler à la température ambiante (6-12 mois). </li></ol> 4. Préparation du remplacement (SR) milieu sans sérum <ol><li> Avant d&#39;encapsulation, préparer le milieu SR à l&#39;avance que dedécrit dans le tableau des réactifs spécifiques et des équipements. </li></ol> 5. Préparation de l&#39;inhibiteur de ROCK (Y-27632) <ol><li> Diluer Y-27632 poudre dans 0,1% sérum-albumine humaine (SAH) en D-PBS pour faire une solution à 5 mM. </li></ol> 6. Préparation des CSEh pour l&#39;encapsulation <ol><li> Pré-traiter les cellules avec les médias de culture supplémenté avec 10 uM de l&#39;inhibiteur de ROCK (RI) pendant deux heures à 37 ° C (abri de la lumière). </li><li> Après le traitement RI, laver les cellules avec du D-PBS deux fois et déloger les cellules de plaques de culture par voie enzymatique avec accutase pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Gratter doucement les cellules avec une raclette de pipette ou de la cellule et recueillir dans un tube de 15 ml. Neutraliser le accutase avec le milieu de SR dans le rapport 1:1. </li><li> Pour préparer une suspension cellulaire unique, filtrer les cellules neutralisé à l&#39;aide d&#39;un filtre 40 um et de recueillir dans un endroit frais tube de 50 ml centrifugeuse. </li><li> Calculer le nombre total de cellules dans la solution en utilisant un hématimètre. </li&gt; <li> Centrifuger la suspension cellulaire 95 xg pendant 5 min et soigneusement éliminer le surnageant par la suite. Laver les cellules avec préchauffé 0,9% de NaCl. Centrifuger 95 xg pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li></ol> 7. L&#39;encapsulation des cellules <ol><li> Préparer une seringue de 1 ml attaché à un tube en plastique souple de 14G x 2 &quot;cathéter IV. Il est utilisé pour aspirer la suspension cellulaire à être chargés sur le pousse-seringue comme le montre la figure 1. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec une solution d&#39;alginate de pré-chauffée à une densité de 1,25 millions de cellules ou d&#39;alginate ml. Mélanger doucement avec la seringue et éviter de créer des bulles. </li><li> Mettre en place le générateur de perles, pompe à seringue et le débitmètre d&#39;air comme le montre la figure 1. Plus de détails de ces dispositifs sont répertoriés dans le tableau des réactifs spécifiques et des équipements. </li><li> Avec les cellules aspirées dans la seringue, jeter le tube de plastique du cathéter IV et fixer la seringue à la machine d&#39;encapsulation. Assurez-vous que il ya un écart de 10 cm sera<html> interpolation de la fin de la machine d&#39;encapsulation et le point de collecte comme le montre la figure 1. </li><li> Encapsuler les cellules en définissant la pompe à seringue à 20 ml / h, le débit d&#39;air à 8 l / min et une pression de 100 kPa (de la taille de capsules peut être changé en modifiant le débit d&#39;air). </li><li> Recueillir les cellules encapsulées dans une boîte de Pétri (100 x 15 mm) remplie avec 20 ml de bain de précipitation préchauffé pendant 7 min pour stabiliser les capsules. </li><li> Transférer les cellules encapsulées par aspiration douce en 50 tubes à centrifuger ml remplie avec 20 ml de NaCl 0,9%. </li><li> Autoriser les capsules à s&#39;installer dans la partie inférieure du tube, puis doucement éliminer le surnageant. Répétez le processus de lavage avec NaCl 0,9%. </li><li> Remettre en suspension les cellules encapsulées dans un milieu de culture pré-chauffée complétée par RI (10 uM), le transfert dans un flacon de culture et incubées à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> 8. Différenciation des CSEh encapsulé à DA neurones ve_content &quot;&gt; Le CSEh encapsulé sont traités avec RI pendant 3 jours avant leur différenciation. <ol><li> Graine de la lignée cellulaire stromale souris, PA6 cellules à une densité de 1,0 x 10 4 par cm 2 dans 0,1% de gélatine revêtu T75 flacon et l&#39;état des cellules dans un milieu PA6 DA différenciation neuronale (Tableau Matériaux) 24 heures avant la différenciation. </li><li> Transférer les capsules dans un tube à centrifuger de 50 ml et de leur permettre de s&#39;installer dans la partie inférieure du tube. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les capsules en PA6 cellule-milieu conditionné DA différenciation neurale. </li><li> Culture du CSEh encapsulé avec la monocouche cellulaire PA6 (9 x 10 6 CSEh par 7,5 x 10 5 cellules PA6) pendant 28 jours avec un changement de support sur ​​les 4 jours et chaque autre jour par la suite (ne changer que la moitié de la moyenne à chaque fois). </li><li> Après 3 semaines de culture avec des cellules PA6, de compléter le milieu de différenciation neurale DA avec 100 ng / ml SHH et 100 ng / ml FGF8a pour la semaine restante. </li&gt; </ol> 9. Décapsulation des CSEh encapsulé <ol><li> Aspirer les capsules dans un tube de centrifugation de 15 ml et de leur permettre de se déposer au fond du tube. Puis jetez le surnageant avec précaution. </li><li> Laver les capsules avec D-PBS deux fois. Laisser les capsules se déposent au fond du tube, puis retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de solution décapsuler les capsules. Mélanger soigneusement la suspension par aspiration avant l&#39;incubation à température ambiante pendant 4-5 min. </li><li> Centrifuger les cellules décapsulé à 95 xg pendant 3 min et éliminer le surnageant. </li><li> Laver la cellule avec le D-PBS culot suivie d&#39;une centrifugation à 95 xg pendant 3 min. Répéter. </li><li> Les cellules décapsulé peut encore être cultivés en monocouche ou utilisé pour l&#39;analyse en aval. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Le diamètre de microcapsules d&#39;alginate est um 400-500. Le nombre de cellules au sein de la capsule était estimated en calculant le nombre total de cellules divisé par le nombre total de capsules par course. Par conséquent, environ 5,0 x 10 4 cellules par capsule a été estimée. De cela, nous supposons que le nombre maximal de cellules de la capsule peut contenir est d&#39;environ 1,0 x 10 5. La viabilité des CSEh encapsulé est&gt; 80% (figure 2) telle que déterminée en utilisant l&#39;aide diacétate de carboxyfluorescéine succinimidly ester (CFDA) / iodure de propidium (PI) de dosage. Nous avons optimisé les conditions de l&#39;encapsulation sur les CSEh en diminuant la concentration d&#39;alginate de 2,2% à 1,1% et en changeant le bain de précipitation du chlorure de baryum au chlorure de calcium. A partir de ces conditions, nous avons montré que seules les cellules qui ont été encapsulés avec de l&#39;alginate de calcium 1,1% pourraient survivre, proliférer et à former EB in vitro 1. Pour optimiser encore davantage la condition, les effets de milieux de culture et RI, Y-27632 ont été étudiés. Les données présentées dans la figure 2 et 3 montrent que prévente RId dissociation induite par apoptose et maintenu la viabilité cellulaire et la formation de grappes promu 1,6. En outre, la viabilité des CSEh encapsulé cultivées dans HFF-CM RI + était significativement plus élevé que les autres groupes sans supplémentation RI, mais ce n&#39;était pas significativement différente de CSEh encapsulé cultivées en SR + RI. De même, la prolifération cellulaire à l&#39;aide de dosage BrdU a augmenté de 25% à 75% des cellules individuelles développés en grappes (figure 3). Dosage apoptose par TUNEL a révélé que les cellules individuelles dans des microcapsules cultivées dans un milieu SR étaient apoptotique (données non présentées), alors que les grappes extraites de la CPCL-CM étaient pour la plupart négatifs pour TUNEL. Dans une certaine mesure, HFF-CM complétées par bFGF a également favorisé la survie et la prolifération des CSEh encapsulés en l&#39;absence de Y-27632. Toutefois, le traitement par Y-27632 avant (2 heures) et après encapsulation (pendant 4 jours supplémentaires) la viabilité nettement accrue, la prolifération et la formation de grappes de CSEh encapsulédans 1,1% des microcapsules d&#39;alginate de calcium. Auparavant nous avons démontré que les CSEh peuvent être encapsulés avec succès différenciés pour endoderme définitif 1. Ici, nous avons examiné l&#39;application de l&#39;encapsulation cellulaire comme une plate-forme 3D pour différencier les CSEh encapsulé dans les neurones dopaminergiques. CSEh, qui a formé des corps embryoïdes (EB) en capsules ont été directement différenciée et sur décapsulation dans les conditions décrites ont montré une morphologie neuronale progressive (figure 4) après 2-3 jours de culture avec plus de 90% de viabilité. Analyse de l&#39;expression génique ont montré une régulation à la baisse du marqueur pluripotent, OCT4 tout marqueur neuroprogenitor, PAX6 et DA marqueur neuronal, TH étaient régulés à la hausse après 7 jours de différenciation (figure 5A). La coloration par immunofluorescence a révélé que les CSEh différenciées étaient PAX6-positif (&gt; 80%), mais OCT4 négatif au jour 7. En outre CSEh différenciées montré TH-positifs (&gt; 90%) des neurones après 21 jours (figure 5B). Analyse par Western blot a également montréune régulation positive d&#39;expression TH de 14 jours (figure 5C), tandis que PAX6 expression était régulée à la baisse après 21 jours. En comparaison, les cellules cultivées dans un environnement à deux dimensions (2D) dans des conditions similaires (par exemple RI pré-traitement pendant 2 heures et le RI de post-traitement pendant 3 jours avant la différenciation) a maintenu un pourcentage élevé de cellules PAX6-positifs (&gt; 80 %) tout au long de la période de différenciation et n&#39;étaient pas aussi efficaces dans la différenciation de cellules TH-positifs (&lt;60%) que dans un environnement 3D fournies par encapsulation (figure 5A et C).

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	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Plusieurs études utilisant des cellules souches embryonnaires de souris et de CSEh ont démontré les avantages de système de culture 3D dans les biomatériaux et ingénierie tissulaire 2,3. Nous avons utilisé des microcapsules d&#39;alginate de calcium en tant que plate-forme appropriée pour étudier la propagation 3D et la différenciation des CSEh en comparaison à l&#39;alginate de baryum depuis CSEh ont montré significativement plus élevé lorsque la viabilité encapsulé dans de l&#39;alginate de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> Alginate (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> haute teneur en acide glucuronique ≥ 60%, une viscosité&gt; 200 mPa.s, et l&#39;endotoxine &lt;100 UE / g </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> NaCl à 0,9% </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Type de J1 bourrelet générateur </td><td> Nisco Engineering Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe à seringue multi-Phaser </td><td> New Era Pump Systems Inc </td><td> Modèle NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow Débitmètre médicale </td><td> Systèmes Gascon</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique humaine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;cathéter IV </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Pour SR moyenne (de base) </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Pour SR moyennes (2 mM) </td></tr><tr><td> Remplacement Knockout Sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Pour SR moyenne (20%) </td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Pour SR moyenne (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insulin-transferrine-Sélénium (SON) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Pour SR moyenne (1x) </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Pour SR moyenne (0,1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Pour SR moyenne (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow Milieu Essentiel Minimum </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Pour le milieu DA différenciation neurale (basale) </td></tr><tr><td> Remplacement Knockout Sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Pour le milieu DA différenciation neurale (10%) </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Pour le milieu DA différenciation neurale (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Pour DA nmilieu de différenciation EURAL (0,1 mM) </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Pour le milieu DA différenciation neurale (0,1 mM) </td></tr><tr><td> Sonic hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Pour DA différenciation neurale (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Pour DA différenciation neurale (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont en train de devenir une source alternative intéressante pour la thérapie de remplacement cellulaire, car elles peuvent être multipliées en culture indéfiniment et différencié à tous les types de cellules dans le corps. Différents types de biomatériaux ont également été utilisés dans les cultures de cellules souches pour fournir un microenvironnement imitant la niche de cellules souches 1-3. Le dernier point est important pour la promotion de la cellule à cellule d&#39;interaction, la prolifération cellulaire et la différenciation en lignées spécifiques ainsi que l&#39;organisation des tissus en fournissant un en trois dimensions (3D) environnement 4 tel que l&#39;encapsulation. Le principe d&#39;encapsulation cellulaire implique le piégeage de cellules vivantes dans les limites de membranes semi-perméables dans des cultures 3D 2. Ces membranes de permettre l&#39;échange des nutriments, l&#39;oxygène et des stimuli à travers les membranes, tandis que les anticorps et les cellules immunitaires de l&#39;hôte qui sont plus grandes que la taille des pores capsule sont exclus 5. Ici, nous avons préenvoyé une approche à la culture et de différencier les CSEh neurones dopaminergiques dans un microenvironnement 3D utilisant des microcapsules d&#39;alginate. Nous avons modifié les conditions de culture de 2 à accroître la viabilité des CSEh encapsulé. Nous avons précédemment montré que l&#39;ajout de p160-Rho-associé superhélice kinase (ROCK) inhibiteur, Y-27632 et du foetus humain fibroblastes milieu conditionné de remplacement du sérum (HFF-CM) à la plate-forme 3D a considérablement amélioré la viabilité des CSEh encapsulé dans lequel les cellules expriment définitives gènes marqueurs endodermiques 1. Nous avons maintenant utilisé cette plate-forme 3D pour la propagation de la différenciation des CSEh et efficace pour les neurones dopaminergiques. Analyses d&#39;expression des protéines et des gènes après la phase finale de la DA de la différenciation neuronale a montré une expression accrue de la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur de neurones DA, plus de 100 plis au bout de 2 semaines. Nous avons supposé que notre plate-forme 3D utilisant des microcapsules d&#39;alginate peut être utile d&#39;étudier la prolifération et la différenciation dirigéedes CSEh à des lignées différentes. Ce système 3D permet également la séparation des cellules nourricières de CSEh au cours du processus de différenciation et possède également un potentiel pour le système immunitaire d&#39;isolement lors de la transplantation à l&#39;avenir.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Nous avons optimisé une technique de microencapsulation comme une plate-forme efficace pour la propagation 3D et la différenciation des cellules souches embryonnaires à l&#39;endoderme et dopaminergiques (DA) des neurones. Il fournit aussi une occasion pour le système immunitaire des cellules d&#39;isolement de l&#39;hôte lors de la transplantation. Cette plate-forme peut être adaptée à d&#39;autres types cellulaires.

Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K vues.  The University of New South Wales. Nous avons optimisé une technique de microencapsulation comme une plate-forme efficace pour la propagation 3D et la différenciation des cellules souches embryonnaires à l'endoderme et dopaminergiques (DA) des neurones. Il fournit aussi une occasion pour le système immunitaire des cellules d'isolement de l'hôte lors de la transplantation. Cette plate-forme peut être adaptée à d'autres types cellulaires.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

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Bio-ingénierie

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...