La quiescence du cycle cellulaire est une caractéristique clé des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole aide à comprendre le comportement des HSC humains quiescents in vitro dans des conditions quasi physiologiques. En utilisant ce protocole, les chercheurs peuvent tester l’effet de divers composés, nutriments ou protéines qui régulent l’état du cycle cellulaire ainsi que la différenciation des HSC d’une manière évolutive sans utiliser de modèles animaux.
Les médicaments anticancéreux ont des effets variables sur la survie des HSC quiescents et des progéniteurs cyclistes. Ce protocole permet de trouver des agents qui épargnent les HSC ou les agents qui endommagent sélectivement les cellules souches leucémiques quiescentes. Hiroshi Kobayashi, chercheur principal au laboratoire Takubo, démontrera la procédure.
Pour commencer, dissoudre 16 milligrammes par millilitre de palmitate de sodium, 30 milligrammes par oléate de sodium millilitre et 4 milligrammes par millilitre de cholestérol dans le méthanol dans les tubes de verre. Stockez les solutions lipidiques à 30 degrés Celsius négatifs et décongelez-les avant utilisation. Dans un tube de verre frais, mélanger les solutions lipidiques pour obtenir la concentration finale de 100 microgrammes par millilitre de palmitate, 100 microgrammes par oléate millilitre et 20 microgrammes par millilitre de cholestérol.
Évaporer le méthanol en passant le gaz azoté à travers la solution lipidique. Évaporez complètement le méthanol restant en chauffant le tube de verre dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Préparer le DMEM/F-12 moyen avec hepes et glutamine.
Ajouter la pénicilline et le sulfate de streptomie pour une concentration finale de 50 unités et 50 microgrammes par millilitre respectivement. Le milieu peut être stocké à quatre degrés Celsius pendant au moins deux mois. Ajouter 4% de BSA au milieu DMEM/F-12 avec HEPES et glutamine, puis ajuster le pH du milieu à 7,6 en utilisant la solution d’hydroxyde de sodium.
Ajouter le milieu au tube de verre avec les lipides. Dissoudre complètement les lipides par sonication. Si le milieu est opaque après la sonication, prolonger le temps de sonication.
Lorsque l’AS BSA et les lipides sont dissous, les échantillons doivent être stockés à 80 degrés Celsius négatifs et utilisés dans les deux mois. Ajouter 0,001X de mélange d’insuline, de transferrine, de sélénite de sodium et d’éthanol amine au mélange DMEM/F-12, puis filtrer le milieu mixte à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre. Avant utilisation, ajouter le facteur de cellules souches humaines ou SCF et la thrombopoïétine humaine ou TPO au média de culture à une concentration finale de trois nanogrammes par millilitre chacun.
Transférer 200 microlitres des supports de culture précédemment préparés avec des cytokines dans des plaques à fond plat de 96 puits. Pour éviter l’évaporation du milieu, remplissez tous les puits inutilisés de 100 à 200 microlitres de PBS. Resuspendez les cellules souches hématopoïétiques triées ou HSC dans les médias de culture sans cytokines à 60 cellules par microlitre.
Aliquot 600 cellules dans chaque puits. Moins de 300 cellules mèneront à une plus grande variation technique et la culture de plus de 1000 cellules dans un seul puits devrait être évitée en raison de la privation d’éléments nutritifs ou de l’accumulation de cytokines ou de chimiokines défavorables. Culture des cellules dans un incubateur multi-gaz humidifié à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone de 5% et 1% d’oxygène.
Après sept jours de culture des HSC purifiés, jusqu’à 80% des cellules ont montré le marqueur CD34 phénotypes positifs et CD38 négatifs. Le nombre total de cellules dépendait de la concentration de cytokine. Des concentrations plus élevées de SCF et de TPO ont induit l’entrée dans le cycle cellulaire, la prolifération et la différenciation.
Le nombre de HSC phénotypiques caractérisés par les phénotypes négatifs cd34, CD38 négatifs, CD90 positifs et CD45 RA négatifs a augmenté proportionnellement aux concentrations de SCF ou de TPO alors que la fréquence parmi les cellules totales a diminué. Après trois mois de transplantation de HSCs adultes cultivés de moelle, la reconstitution peut être évaluée en fonction de leur fréquence dans le sang périphérique de la murine positive humaine cd45, cd45 cellules négatives ter119 négatives. Trois lignées comprenant les cellules B positives de CD19, le négatif de CD13, les cellules myéloïdes positives de CD33, et les cellules T positives de CD3 ont été reconstituées dans les souris de NOG transplantées avec les HSCs fraîchement décongelés ou cultivés.
Après la culture, les CSH peuvent être soumis à un profilage de l’expression génétique tel que le séquençage en temps réel de la PCR et de l’ARN. La validation fonctionnelle à l’aide de la transplantation chez des souris immunodéficientes peut également être effectuée. Les chercheurs peuvent comparer directement les HSC à vélo et à quiescent dans des conditions définies en ajustant les concentrations de cytokine.
Cela aidera à comprendre les programmes d’auto-renouvellement spécifiques au HSC quiescents, les mécanismes de résistance au stress et les propriétés métaboliques, qui sont difficiles à tester dans les paramètres in vivo.
