Cette recherche a été financée en partie par le NIH-RO3 EB007299-02 et NSF EPSCoR premier prix.

1. Préparation Construct tissus Le tissu de construire processus de préparation se compose de trois étapes principales: l&#39;expansion de la population de la cellule, l&#39;ensemencement de cellules sur un échafaudage biomatériau, et la différenciation par l&#39;utilisation de molécules de signalisation chimiques. La procédure pour la préparation construction est basée sur des méthodes menées par Dennis et al., Hong et al., Et Marion et Mao 8,9,10. <ol><li> Après la culture et l&#39;expansion de la lignée cellulaire, des semences, les cellules souches mésenchymateuses humaines (h MSC) sur une éponge de gélatine (4 mm de diamètre, 3,5 mm d&#39;épaisseur) à une densité de 1x10 6 cellules / ml pour les os et 3x10 6 cellules / ml pour formation de tissu adipeux. </li><li> Pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses h dans adipeux, appliquer les médias induction adipeux constitués de 1 uM de dexaméthasone, 0,5 uM isobutyl-méthylxanthine, 10 pg / ml d&#39;insuline humaine recombinante-, et 200 uM indométhacine dans un milieu à l&#39;expansion cellulaireUne fois les cellules confluentes apparaissent sur l&#39;échafaud. Après trois jours, de remplacer les médias avec 10 pg / ml de l&#39;insuline humaine recombinante-dans les médias d&#39;extension pour 24 heures, puis revenir à des médias à induction. Répétez le cycle trois fois et ensuite échanger seulement dans les médias d&#39;entretien tous les deux jours. </li><li> Pour induire l&#39;ostéogenèse, préparer des milieux d&#39;induction ostéogéniques en faisant une concentration finale de 0,1 uM de dexaméthasone, 50 uM de L-ascorbique-2phosphate, et 10 mM β-glycérophosphate dans le milieu de l&#39;expansion des cellules. Remplacez-le par Fresh Media ostéogéniques tous les deux jours. </li></ol> 2. Caractérisation actionneur Caractérisation de l&#39;actionneur est une étape essentielle pour l&#39;expérience des MRE. MRE repose sur la propagation des ondes de cisaillement mécaniques afin d&#39;évaluer les valeurs locales de propriétés mécaniques et, par conséquent, ces vibrations mécaniques doivent être générés et caractérisés dans le tissu d&#39;intérêt en utilisant un actionneur piézoélectrique. Un exa illustréemple du processus de caractérisation est représenté sur la figure 3. L&#39;objectif de cette procédure est d&#39;optimiser le mouvement de l&#39;actionneur afin de générer des ondes de cisaillement inoffensifs avec des amplitudes importantes (~ 250 microns). <ol><li> Avant l&#39;expérience, appliquer de 0,5% sur gel d&#39;agarose à enfermer la construction dans un tube à essai de 10 mm. La température du gel soit d&#39;environ 37 ° C à minimiser les dommages à la construction. </li><li> Après avoir laissé les agarose gel cinq minutes pour durcir à température ambiante, insérer la pointe du moteur piézo-électrique de flexion dans la surface du gel. </li><li> Fixer le tube contenant l&#39;échantillon et l&#39;actionneur à un support rigide, et orienter le faisceau de la vibromètre laser à effet Doppler vers la pointe de l&#39;actionneur mécanique. Ajuster le positionnement du système pour optimiser le signal réfléchi, utiliser un ruban réfléchissant si nécessaire. </li><li> Basé sur la fréquence de résonance attendue de l&#39;actionneur mécanique, réglez le générateur de fonction pour balayer la dgamme de fréquences esired (soit 20 à 2000 Hz dans cette expérience) en utilisant une tension de fonctionnement de 20 Vcc avec un signal de bruit blanc. </li><li> Afficher le spectre caractérisé sur le programme Polytec Vibrosoft pour identifier la fréquence de résonance du système et mettre le programme d&#39;FFT et la vitesse de l&#39;axe des y. </li><li> Pour la mesure de déplacement, définir l&#39;actionneur pour fournir une sinusoïde en continu à la fréquence de résonance indiquée en utilisant une tension de fonctionnement de 200 Vpp, et noter le déplacement généré étant délivrée à la surface du gel. Définir Vibrosoft pour afficher la FFT avec le déplacement de l&#39;axe des y. </li></ol> 3. Acquisition d&#39;image <ol><li> Après avoir terminé la caractérisation d&#39;actionnement, mettre l&#39;échantillon et l&#39;actionneur dans le centre de l&#39;appareil d&#39;IRM. Pour les expériences construct tissus, utilisation d&#39;une bobine petite et plus sensible RF (10 mm de cette expérience) pour la transmission et la réception du signal RF. (La procédure indiquée utilise un T 9,4verticale aimant alésage équipés avec des gradients de trois axes, 100 g / cm). </li><li> Acquérir une image éclaireur pour l&#39;identification de l&#39;emplacement construction. </li><li> Définissez les paramètres pour l&#39;acquisition. Un type in vitro sagittale balayage ont un temps de répétition de 1000 ms, de temps d&#39;écho de 20-40 ms, épaisseur de tranche de 0,5-1,0 mm, et le champ de vision de 12x10 mm 2 avec une taille de matrice de 128x128 pixels. </li><li> Pour les paramètres d&#39;élastographie, régler la fréquence actionneur à la valeur déterminée par la caractérisation laser Doppler Vibromètre. Dans l&#39;étude actuelle, une paire bipolaire a été nécessaire avec une amplitude de gradient de 50 g / cm. Autres paramètres à ajuster comprennent le retard qui devrait être fixé à zéro millisecondes pour l&#39;acquisition initiale. </li><li> Changer le générateur de fonction pour mode rafale et d&#39;ajuster les paramètres du générateur de fonction pour correspondre à ceux dans les paramètres d&#39;acquisition élastographie, y compris la fréquence et le nombre de cycles. En outre, définir la fonctionGénérateur tion à l&#39;extérieur déclenché. </li><li> Pour une image sagittale, mis en mouvement la sensibilisation à faire dans le sens positif et tranche lancer le scan. Suite à l&#39;acquisition, vérifier l&#39;image et de changer la sensibilisation à la direction tranche négative. </li><li> Exécutez le programme MATLAB qui effectuera la division complexe pour la génération de l&#39;image de l&#39;onde de cisaillement. </li><li> Évaluer l&#39;image pour la présence d&#39;ondes de cisaillement et des artefacts possibles comme l&#39;emballage de phase. </li><li> Si aucun ajustement à l&#39;image sont nécessaires, ajuster la taille de tableau de paramètres à huit valeurs équidistantes allant de zéro secondes pour une période complète de la fréquence de résonance caractérisé. </li><li> Acquérir une analyse dans les deux tranches les orientations positives et négatives. </li><li> Une fois les images sont acquises, utilisez un programme MATLAB conçu pour générer des données d&#39;ondes de cisaillement d&#39;un tableau d&#39;images. </li></ol> 4. Traitement d&#39;image Expérience MRE <ol><li> Thétape e finale de l&#39;EDM est de calculer la rigidité de cisaillement à partir des images des ondes de cisaillement. Placer les données dans le programme MATLAB qui permettra d&#39;évaluer l&#39;ensemble de données en trois dimensions (2 spatiale, 1 temporelle). </li></ol> Note: en supposant par une onde de cisaillement plane, les équations de mouvement permettant de découpler l&#39;estimation de la valeur-module complexe de cisaillement en fonction du déplacement et son laplacien. L&#39;algorithme se rapproche spatiales dérivées secondes avec des différences finies et calcule le module de cisaillement sur une base pixel par pixel. De ce nombre complexe, de nombreux paramètres mécaniques peut être déduite comme la vitesse des ondes de cisaillement, l&#39;atténuation des ondes, la rigidité en cisaillement, l&#39;élasticité de cisaillement, la viscosité de cisaillement, etc L&#39;algorithme permet également la sélection des régions d&#39;intérêt pour lequel la moyenne et l&#39;écart-type de chaque paramètre est calculée. <ol start="2"><li> Les paramètres d&#39;imagerie doivent être précisés au début du programme. En outre, ee limite supérieure de la élastogramme peut être ajusté pour optimiser le contraste dans l&#39;échantillon. </li></ol> Remarque: Le programme donne des résultats intermédiaires (vague après filtres passe-bas, vague après filtrage directionnel, temporelle FFT, les profils en ligne, etc) qui aident l&#39;utilisateur à évaluer la fidélité de la reprise. <ol start="3"><li> Certains paramètres peuvent être réglés sur la base de cette information, tels que les niveaux de filtres passe-bas, la fréquence temporelle de la requête, la direction de propagation de l&#39;onde, etc écart-type d&#39;un paramètre dans une région d&#39;intérêt est également un indicateur de la qualité du calcul. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Figure 4 notes du changement dans les propriétés mécaniques tout au long de quatre semaines de développement et de construction ostéogénique adipogénique. MRE a été réalisée à 730-820 Hz. Bien que les deux éponges ensemencées ont commencé à environ 3 kPa, osteogenic tissus dirigées donné lieu à une rigidité de 22 kPa, alors que, adipeux dirigé tissus a diminué dans la rigidité à 1 kPa. En outre, les constructions ostéogéniques ont montré une diminution notable de la taille en comparaison du début à la fin de l&#39;étude. D&#39;autres objets dérivés de l&#39;étude de l&#39;élastographie sont présentés dans le tableau 1. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Le processus d&#39;acquisition d&#39;image pour l&#39;élastographie par résonance magnétique. Au cours d&#39;acquisition d&#39;image, une séquence d&#39;impulsions (a) commande la synchronisation (b) du générateur de fonction avec le impulsions de gradients bipolaire de l&#39;appareil d&#39;IRM. Suite à l&#39;acquisition des gradients bipolaire basculée dans des orientations positives et négatives, (c) une image d&#39;onde de cisaillement est produit en utilisant la division complexe. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Schéma Figure 2. Du processus de MRE pour le moteur de tissusconstructions Luin. Tout d&#39;abord, les cellules (a) sont d&#39;abord développée et a étendu à la taille de la population essentielle pour le projet conçu. Puis les cellules sont ensemencées (b) sur un échafaudage bio-matériau et les réactifs chimiques sont appliqués au signal de différenciation. Échafaudages sont caractérisés avec MRE, dont la première étape (c) est la détermination de la fréquence de résonance de l&#39;actionneur couplé à l&#39;assemblage. Suivant, des images IRM (d) sont acquises pour générer une image d&#39;onde de cisaillement (e). Enfin, un algorithme est appliqué pour obtenir une élastogramme (f) que les cartes de la rigidité de la construction. Parallèlement, les constructions sont sectionnés pour l&#39;évaluation histologique (g) afin de valider la différenciation. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Procédure de caractérisation de l&#39;actionneur. L&#39;échafaudage gélatine est délimitée par un gel d&#39;agarose à 0,5%. Pour caractériser le mouvement d&#39;être transféré dans l&#39;échantillon un bruit blanc est d&#39;abord envoyé dans le système(1a) et le mouvement qui en résulte est détectée en utilisant un laser à effet Doppler Vibromètre (1b). Une fois la fréquence de résonance est déterminée, un signal continu sinusoïde à résonance (2a) est envoyé pour déterminer le déplacement (2b) transférée à l&#39;environnement de la gélatine. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Construire la carte de développement sur ​​une période de quatre semaines. Adipogéniques (A) et ostéogénique (O) des constructions sont indiqués de gauche à droite avec une amplitude correspondant et images des ondes de cisaillement, élastogramme, et la rigidité de cisaillement moyenne. La palette de couleurs pour les élastogramme correspond avec le schéma de couleurs du graphique à barres et barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type au sein de la région chaque construction d&#39;intérêt. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tableau 1"/&gt; Tableau 1. Les propriétés mécaniques des constructions adipeux et ostéo sur une période de quatre semaines de croissance.

<ol>
	<li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging.">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li><li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro.">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li><li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+magnetic+resonance+elastography+(microMRE.">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li><li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves.">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li><li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs.">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , (2011).</li><li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation.">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li><li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shear+wave:+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test.">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li><li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge.">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li><li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously:+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression.">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li><li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering.">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li><li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spin-echo+magnetic+resonance+elastography+of+the+brain.">Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain.</a> , 1647-1647 (2001).</li><li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+EPI+based+3D+MR+elastography+of+the+brain.">Fast EPI based 3D MR elastography of the brain.</a> , 3385-3385 (2006).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts à déclarer.

Dans cette procédure, le processus de MRE pour les constructions de l&#39;ingénierie tissulaire est démontré, de la préparation cellulaire à la génération d&#39;un élastogramme. En appliquant une méthode d&#39;évaluation non destructive mécanique à la canalisation du génie tissulaire, il est maintenant possible d&#39;évaluer les changements dans les constructions d&#39;ingénierie tout au long de multiples étapes de développement. En outre, s&#39;ajoute à d&#39;autres méthodes d&#39;ERM MR pour les ti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> MSCGM-Bullet Kit </td><td> Réactif </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> DPBS 1X </td><td> Réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine-EDTA </td><td> Réactif </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Dexaméthasone </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-isobutyl-1-méthylxanthine </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> L&#39;insuline bovine du pancréas </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Indométhacine </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-glycérophosphate </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique-2-phosphate </td><td> Réactif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Échafaud </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules souches mésenchymateuses </td><td> Lignée cellulaire </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR scanner </td><td> Équipement </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz WB </td></tr><tr><td> 10mm Litz Coil </td><td> Équipement </td><td> Doty scientifique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser Doppler Vibromètre </td><td> Équipement </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Logiciel </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Générateur de fonctions </td><td> Équipement </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur </td><td> Équipement </td><td> Piezo inc </td><td> EPA-104-115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo flexion du moteur </td><td> Équipement </td><td> Piezo inc. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> Computer-Linux </td><td> Équipement </td><td> Processeur: Intel Core 2 Duo E8400 Mémoire: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Computer-Windows </td><td> Équipement </td><td> Processeur: Intel Core 2 Duo E8400 Mémoire: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Logiciel </td><td> The Mathworks, Inc </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

magnetic resonance elastography methodology for the evaluation of tissue engineered construct growth

Traditionnel essais mécaniques se traduit souvent par la destruction de l&#39;échantillon, et dans le cas de tissu à long terme conçu de construire des études, l&#39;utilisation de l&#39;évaluation destructrice n&#39;est pas acceptable. Une alternative proposée est l&#39;utilisation d&#39;un procédé d&#39;imagerie appelée élastographie par résonance magnétique. L&#39;élastographie est une méthode non destructive pour déterminer le résultat d&#39;ingénierie en mesurant les valeurs locales des propriétés mécaniques (c.-à-module complexe de cisaillement), qui sont des marqueurs essentiels pour identifier la structure et la fonctionnalité d&#39;un tissu. Comme un moyen non invasif d&#39;évaluation, le suivi des constructions d&#39;ingénierie avec des modalités d&#39;imagerie telles que l&#39;imagerie par résonance magnétique (IRM) a vu un intérêt croissant dans la dernière décennie 1. Par exemple, les par résonance magnétique (MR) des techniques de diffusion et de relaxométrie ont été en mesure de caractériser les changements dans les propriétés chimiques et physiques au cours du développement de l&#39;ingénierie tissulaire 2. La méthode proposée dansle protocole suivant utilise microscopique élastographie par résonance magnétique (μMRE) en tant que technique MR non invasive permettant de mesurer les propriétés mécaniques de petite tissus mous 3. MRE est réalisé en couplant un actionneur mécanique sonore avec le tissu d&#39;intérêt et l&#39;enregistrement de la propagation des ondes de cisaillement avec un scanner MR 4. Récemment, μMRE a été appliqué dans l&#39;ingénierie tissulaire pour acquérir des informations essentiel de la croissance qui est traditionnellement mesurée à l&#39;aide des techniques macroscopiques mécaniques destructeurs 5. Dans la procédure suivante, l&#39;élastographie est obtenue par l&#39;imagerie de constructions d&#39;ingénierie avec une version modifiée de Hahn spin-séquence d&#39;écho associée à un actionneur mécanique. Comme le montre la figure 1, la séquence modifiée se synchronise avec l&#39;acquisition de l&#39;image de transmission des ondes de cisaillement extérieures; ultérieurement, le mouvement est sensibilisée par l&#39;utilisation de paires oscillant bipolaires. Après la collecte d&#39;images avec un mouvement positif et négatif sensitization, la division complexe des données de produire une image d&#39;onde de cisaillement. Puis, l&#39;image est évaluée en utilisant un algorithme d&#39;inversion pour générer une carte rigidité au cisaillement 6. Les résultats des mesures à chaque voxel a été démontré fortement corrélés (R 2&gt; 0.9914) avec les données recueillies à l&#39;aide l&#39;analyse mécanique dynamique 7. Dans cette étude, l&#39;élastographie est intégré dans le processus de développement du tissu pour le suivi des lignées de cellules souches mésenchymateuses (CSM h) la différenciation dans des constructions adipogéniques et ostéogénique comme le montre la figure 2.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth at JoVE.com

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

La procédure démontre la méthodologie de l&#39;élastographie par résonance magnétique pour le suivi des résultats d&#39;ingénierie du tissu adipeux et les constructions de tissus ostéogéniques d&#39;ingénierie grâce à une évaluation non invasive locale des propriétés mécaniques en utilisant microscopique élastographie par résonance magnétique (μMRE).

Méthodologie élastographie par résonance magnétique pour l&#39;évaluation des tissus Conçu croissance Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K vues.  University of Nebraska-Lincoln. La procédure démontre la méthodologie de l'élastographie par résonance magnétique pour le suivi des résultats d'ingénierie du tissu adipeux et les constructions de tissus ostéogéniques d'ingénierie grâce à une évaluation non invasive locale des propriétés mécaniques en utilisant microscopique élastographie par résonance magnétique (μMRE).

Vidéo: Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocole pour l&#39;évaluation hydrodynamique relative de Vannes polymères tri-leaflet

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Technique chirurgicale pour l&#39;implantation de l&#39;ingénierie tissulaire vasculaires greffes et suivantes<em&gt; In Vivo</em&gt; Surveillance

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymiques Rat Modèle d&#39;évaluation des Engineered ligament croisé antérieur greffes

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automatisé Contraction L&#39;analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Soutien métabolique des excisées, les tissus de cerveau vivants lors de l’Acquisition de la microscopie par résonance magnétique

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Coutume machinée moules de vitroplants de maîtres gravé au Laser

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Aorte abdominale Hydrogel imitant le tissu de fabrication fantômes pour Validation élastographie par ultrasons

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...