Notre plateforme utilise des tissus musculaires conçus en 3D et du matériel de détection magnétique pour mesurer la contractilité sur 24 puits simultanément. Cela fournit une méthode à débit plus élevé pour évaluer de nouveaux traitements in vitro en utilisant des tissus musculaires humains. Notre méthode de coulée améliore la consistance et la reproductibilité dans la fabrication de tissus musculaires issus de l’ingénierie 3D.
Nous avons conçu une plaque de coulée consommable de 24 puits équipée d’un matériel de détection magnétique pour les mesures et l’analyse de contractilité sur notre plate-forme. Cette méthode peut fournir des informations précieuses sur la modélisation in vitro des maladies, la découverte de médicaments et la thérapie génique pour toute maladie musculaire affectant la contractilité. Nous intégrons actuellement des motoneurones dans nos constructions 3D pour créer également un modèle de jonction neuromusculaire.
Pour commencer, placez un kit de moulage de tissus pré-réfrigéré sur un bloc froid ou de la glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire. Posez la plaque de coulée à plat sur de la glace. Ajouter la thrombine au milieu de base pour obtenir la solution de thrombine et déplacer le réseau post-lit de la plaque de coulée vers une nouvelle plaque stérile à 24 puits.
Pipeter 50 microlitres de solution de thrombine dans chaque puits pré-refroidi de la plaque de coulée et replacer le treillis sur le kit. Mettez le kit de coulée de côté sur la glace. Ensuite, ajoutez 500 millilitres de milieu RPMI, 10 millilitres de B27 et 2,5 grammes d’acide aminocaproïque, ou ACA, pour préparer le milieu EMT cardiaque.
Retirez le milieu EMT qui sera utilisé pour couler les tissus et ajoutez-y 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Préparez le milieu EMT squelettique en ajoutant 50 millilitres de milieu F10 et 0,25 gramme d’acide aminocaproïque, ou ACA, pour les myoblastes primaires. Utilisez 0,1 gramme d’ACA pour les myoblastes dérivés de l’IPSC.
Ensuite, filtrer stérile le milieu de coulée contenant de l’ACA. Réchauffer le réactif de dissociation de qualité culture cellulaire et un volume égal de milieu EMT à 37 degrés Celsius. Ce milieu EMT chauffé sera utilisé pour diluer le réactif de dissociation.
Lavez les cellules avec du PBS et ajoutez le réactif de dissociation chauffé pour soulever les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient levées et vérifier les cultures toutes les deux à trois minutes en tapotant le côté de la plaque. Une fois les cellules soulevées, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres.
Triturate avec une pipette P-1000 pour assurer une suspension unicellulaire. Laver la plaque et le ballon avec un milieu EMT supplémentaire pour recueillir les cellules restantes et les ajouter au tube conique. Encore une fois, triturez les cellules pour assurer une suspension unicellulaire.
Ajouter un milieu EMT pour mettre fin au processus de dissociation, puis prélever des échantillons des suspensions cellulaires pour le nombre de cellules. Effectuer le comptage cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre en bleu trypan. Faites tourner les cellules à 200 g pendant quatre minutes, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres du milieu de base EMT pour éliminer le réactif de dissociation résiduel.
Après avoir centrifugé à nouveau pendant quatre minutes, aspirer le surnageant et préparer les suspensions cellulaires aux densités appropriées. Calculer les volumes de chaque solution cellulaire nécessaire pour constituer le nombre souhaité de tissus et pipeter les volumes calculés de cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez 10 microlitres de fibrinogène par EMT à la suspension cellulaire et placez-la sur de la glace.
Assurez-vous que chaque EMT contient 90 microlitres de suspension cellulaire, 10 microlitres de fibrinogène et 50 microlitres de solution de thrombine dans la construction finale du tissu. Dans une hotte de culture cellulaire, retirez le couvercle du kit de coulée de tissus et placez la plaque de coulée avec le réseau de poteaux posé à plat sur la glace. Mélanger le mélange de fibrinogène cellulaire et aspirer 100 microlitres avec une pipette P-200.
Ajouter 100 microlitres du mélange dans des puits préparés avec 50 microlitres de solution de thrombine et triturer cinq fois pour bien mélanger. Ne poussez pas la pipette au-delà de la première butée et retirez l’embout après la trituration pour éviter de créer des bulles. Mélanger la suspension cellulaire dans le tube conique avant de couler chaque tissu.
Tenez simultanément le treillis et la plaque de puits de coulée à l’aide du doigt et du pouce d’une main pour éviter tout mouvement du réseau ou laissez la plaque à plat sur la glace et secouez le seau à glace pour voir dans la plaque de coulée. Répétez avec une nouvelle pointe P-200 pour chaque tissu jusqu’à ce que tous les tissus soient moulés. Transférez soigneusement le kit ensemencé dans l’incubateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant 80 minutes.
Ensuite, préparez une nouvelle assiette de 24 puits avec deux millilitres par puits du milieu EMT pour les tissus cardiaques et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pour réchauffer le milieu. Après l’incubation de 80 minutes, ajoutez doucement un millilitre de milieu EMT au bord des puits de coulée et incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes d’incubation, soulevez soigneusement le post-treillis et transférez les tissus de la plaque de coulée vers une plaque préparée à 24 puits avec le milieu chauffé.
Enfin, retournez les plaques avec des tissus dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius. La production infructueuse d’EMT peut aller de défaillances catastrophiques telles que le détachement des tissus des poteaux, à des défauts structurels plus subtils tels que des bulles d’air et un dépôt tissulaire inégal autour des deux poteaux. La construction EMT un jour après le casting est montrée ici.
Les tissus musculaires squelettiques ont été transférés dans un milieu de différenciation à partir du jour zéro de la fusion cellulaire et du compactage de l’hydrogel. Du septième au jour 28, le même EMT a affiché une longueur totale légèrement plus courte entre les deux poteaux et une largeur plus petite lorsqu’elle a été mesurée à travers la section centrale de l’EMT. Quatre plaques de tissus ont été suivies pendant 21 jours en comparant le diamètre EMT tout au long du compactage.
Les points temporels montrent une taille EMT cohérente entre les plaques. Le compactage maximal est atteint au jour 21 lorsque le remodelage de la matrice est stabilisé. L’immunohistochimie des EMT est représentée ici.
Les EMT ont été fixés au jour 10 de culture et incorporés dans de la paraffine. Des coupes transversales minces ont été colorées avec des anticorps contre la chaîne lourde de myosine et la dystrophine avant l’imagerie. Ces images graphiques représentent la force de contraction absolue moyenne mesurée à partir des ambulanciers cardiaques et des ambulanciers squelettiques au fil du temps.
Le traitement aigu et chronique à la doxorubicine dans les tissus cardiaques modifiés est présenté ici. Trois doses différentes de Dox ont été administrées en bolus ou administrées en continu à des tissus cardiaques modifiés pendant 27 jours. La relation dose-réponse à la BDM dans les tissus musculaires squelettiques modifiés est présentée dans cette figure.
La fréquence des battements cardiaques ou la fréquence des contractions cesse de manière dose-dépendante en tandem avec un arrêt de la force contractile indiquant une cardiotoxicité lorsque les ambulanciers sont exposés à ce composé. Les choses les plus importantes à retenir lors de la coulée des tissus sont de garder tout froid en tout temps, y compris votre suspension cellulaire et vos réactifs, et de garder le post-réseau complètement stationnaire une fois que la coulée commence.
