Nous tenons à remercier le partage open-source d&#39;un code de traces de particules MATLAB fournies par Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), avec le code précédent IDL et une documentation détaillée fournie par John C. Crocker et Eric Semaines R.. Ce travail a été rendu possible grâce au financement de l&#39;Institut national du cancer (NCI / NIH), K99CA155045 et R00CA155045 (PI: CPM).

1. Sphéroïdes La culture de la tumeur <ol><li> Mélanger 10 ml de l&#39;eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 g d&#39;agarose pour obtenir une solution d&#39;agarose à 1%. </li><li> solution d&#39;agarose à la chaleur au-dessus de 70 ° C (plus ou moins 14 secondes dans un four micro-ondes standard ou à l&#39;aide d&#39;une plaque chauffante) avant aliquotage 40 ul de solution d&#39;agarose dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant au moins 1 heure tandis que la récolte de cellules en utilisant des techniques standard. </li><li> Utiliser un hématimètre pour déterminer la concentration de cellules dans la suspension. </li><li> Diluer la suspension cellulaire à 1.000 cellules / ml et ajouter 100 ul de cette dilution au puits contenant le lit d&#39;agarose durci. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur un agitateur pendant une nuit dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Enlever le modèle de secoueur et ajouter 100 ul de milieu de culture cellulaire. </li><li> Incuber jusqu&#39;à ce que des sphéroïdes de diamètre désiré soit atteint. Par exemple, après 9 jours, un spHeroid aura environ 450 m de diamètre. Pendant ce temps, un milieu de croissance frais peut être ajouté dans les puits d&#39;aspiration mais doit être évitée car cela se traduira par la suppression de la sphéroïde. </li></ol> 2. Préparation Sphéroïdes tumorales 3D embarqués dans ECM <ol><li> Préparer une station de travail avec les matériaux nécessaires à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire. </li><li> Préparer un mélange dilué de 1 um de diamètre sondes fluorescentes traceurs carboxylate modifié par l&#39;ajout de sondes 2 pièces en stock (2% de solides) pour 25 parties d&#39;eau stérile. </li><li> Retirer une bouteille de 3,1 mg / ml de collagène bovin du réfrigérateur et placez-le sur la glace. </li><li> Aliquote de 125 ul de collagène dans un vide flacon de 2 ml. </li><li> Ajouter 50 pi de solution diluée de la sonde de traceur dans le flacon contenant le collagène et vortex brièvement pour distribuer des sondes. </li><li> Ajouter 235 ul de milieu de culture cellulaire approprié contenant du phénol rouge (qui devient jaune) pour un volume total de 410 ml et vortex brièvement avant de retirer 205 ml (demi le volume total) et le placer dans un nouveau flacon ml 2. Une fiole contiendra le sphéroïde de tumeur et Vial 2 sera un mélange de commande. </li><li> Ajouter ~ 2 pi de NaOH 1 M au flacon 1 pour amener la solution revenir à pH neutre (milieu de culture contenant du phénol rouge devraient revenir à rouge). Notez que cela va provoquer le mélange de commencer guérir si elle n&#39;est pas conservé dans la glace. brièvement Vortex à mélanger, puis retour au bac de glace immédiatement. NOTE: Le sphéroïde est à peine visible à l&#39;œil nu après 9 jours de culture et son retrait de la chambre d&#39;agarose est une tâche délicate. Utilisation d&#39;un microscope de dissection peut être utile pour certains utilisateurs. Le maintien de l&#39;intégrité du sphéroïde pendant le transfert est primordiale. </li><li> En utilisant une pointe de pipette à large ouverture, retirez délicatement 40 pi de milieu du puits contenant de l&#39;ellipsoïde de la tumeur. Conservez ce 40 pi tout en effectuant l&#39;étape suivante. </li><li> Vérifiez le bien afin de voir si le sphéroïdea été enlevé à l&#39;étape précédente. S&#39;il l&#39;était, ajouter 40 ul contenant le sphéroïde au flacon 1. Sinon, placez les 40 pi dans le puits et répétez l&#39;étape précédente. </li><li> Incorporer délicatement 1 Vial (ne pas risquer de vortex, il peut endommager le sphéroïde) avant de transférer le mélange dans 60 parties de pi en trois puits séparés d&#39;une plaque de 96 puits. Inspecter chaque puits avec un microscope après l&#39;ajout de mélange pour déterminer qui contient bien le sphéroïde. </li><li> Ajouter ~ 2 ul de NaOH 1 M et 40 ul de milieu de culture cellulaire dans le flacon 2 et vortex avant aliquotage 60 ul de ce mélange dans un puits vide dans la plaque à 96 puits et l&#39;étiquetage comme témoin. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pour durcir pendant au moins 1 heure. </li></ol> 3. Construire la grille de points d&#39;échantillonnage et prenez une vidéo à chaque point dans <ol><li> Transférer la plaque de l&#39;échantillon de l&#39;incubateur de la platine du microscope. Laisser 10 minutes pour que l&#39;échantillon EQUILibrate à la température ambiante si une platine chauffante n&#39;est pas disponible. </li><li> Observer l&#39;échantillon avec de faibles lentilles de l&#39;objectif motorisés pour s&#39;assurer qu&#39;il est intact et prêt pour l&#39;imagerie. Déterminer la position de la tumeur à l&#39;intérieur du puits. </li><li> Décidez du nombre de points d&#39;échantillonnage à prendre. En général, 20 points d&#39;échantillonnage dans chaque puits, répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde produiront des résultats suffisamment détaillés. </li><li> Déplacez le stade à chaque position souhaitée et utiliser un logiciel de microscope interface pour enregistrer les coordonnées x et y (ou enregistrer les coordonnées manuellement si l&#39;interface du logiciel n&#39;est pas disponible). </li><li> Mettez le microscope à un objectif de haute puissance (typiquement 100X), et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d&#39;onde d&#39;excitation des sondes de traceurs. Utilisez la liste des points créés à l&#39;étape 3.4 pour passer au premier point de la grille. </li><li> Ajustez la mise au point de trouver le fond du puits, puis déplacez-vous de trouver un champ de vision (FOV) contenant plusieurs trac de mise au pointer sondes. </li><li> Observer l&#39;histogramme de l&#39;intensité et de régler l&#39;intensité et la durée d&#39;exposition pour donner la plus grande gamme dynamique possible, tout en veillant à ce que l&#39;image ne soit pas saturé. </li><li> Obtenir une séquence vidéo à un taux de 20-30 ms par trame de cadre (environ 800 cadres ou 16-24 sec de longueur est recommandé de fournir des statistiques suffisantes pour le calcul MSD robuste en équilibre avec la nécessité de réduire au minimum le temps d&#39;acquisition à chaque point de la grille spatiale) et enregistrer avec une convention appropriée. Pendant l&#39;enregistrement, ne touchez pas le microscope ou une table. </li><li> Répéter les étapes 3.6 à 3.9 pour chaque point dans la grille de l&#39;échantillon. </li><li> Répétez les étapes 3.3 à 3.10 pour chaque bien dans l&#39;expérience. </li></ol> 4. Analyser les données vidéo à Calculer Propriétés rhéologiques à chaque point dans l&#39;échantillon <ol><li> Copiez toutes les données vidéo dans un dossier d&#39;analyse (éventuellement sur un autre ordinateur). </li><li> données d&#39;image à l&#39;importation dans MATLAB ou d&#39;autres logiciels d&#39;analyse. NOTE: documentation détaillée concernant l&#39;ensemble des routines MATLAB particules de suivi adoptées ici est disponible à <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . L&#39;utilisation d&#39;une fonction d&#39;appel personnalisée pour le traitement de plusieurs fichiers à des positions différentes automatisation est recommandé. </li><li> Calibrer le logiciel par l&#39;analyse de plusieurs images de la vidéo afin de déterminer de manière appropriée sélection et de rejet paramètres (taille, passe-bande, etc) pour identifier les positions du centre de la sonde. Vaste expérience de ces étapes cruciales est décrit par Crocker et Grier. </li><li> Utilisez le logiciel pour déterminer automatiquement à chaque position de la sonde pour toutes les images de la vidéo, puis relier ces positions dans les trajectoires. </li><li> Utilisez les données de trajectoire pour calculer la moyenne carré déplacement (TMS) en fonction du temps de latence, en étant sûr d&#39;appliquer le facteur de calibration spatiale appropriée (um par pixel) pour l&#39;objectif spécifique, toute catégorisation de pixels, etc (généralement effectuédans les méta-données). </li><li> Calculer G * (en utilisant la relation généralisée de Stokes-Einstein pris en considération les limites d&#39;application de GSER pour un échantillon particulier 24,28,43. Alternativement, les utilisateurs peuvent souhaiter interpréter propriétés ECM directement à partir de MSD en comparant simplement la loi de puissance mise à l&#39;échelle, plateau valeurs, indices d&#39;hétérogénéité ou d&#39;autres paramètres. </li><li> Répétez les étapes 4.2 à 4.6 pour chaque fov dans l&#39;expérience. </li><li> Co-enregistrer les données de position de l&#39;étape 3.4 avec modulii viscoélastiques à une fréquence d&#39;intérêt particulier. Selon le fabricant du microscope utilisé, cette étape peut être facilitée par une routine personnalisée qui lit les métadonnées de microscope ou de la position des données peuvent être compilées manuellement. </li><li> Utiliser des fonctions d&#39;interpolation 3D pour générer une carte de la rhéologie spatiale de l&#39;ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie robuste et largement applicable pour le suivi longitudinal des changements locaux dans ECM rigidité dans des modèles de tumeurs 3D. Nous prévoyons que cette méthode pourrait être adoptée par les biologistes du cancer et biophysiciens intéressés par le comportement mécanosensible impliquée dans le remodelage matriciel pendant la croissance de la tumeur et les processus d&#39;invasion. Quantification précise de la matrice cinétique de dégradation pourrait ê...

Il est clair à partir d&#39;un nombre croissant de preuves dans la littérature que les cellules cancéreuses, comme les cellules épithéliales de mammifères non malignes, sont très sensibles aux propriétés mécaniques et biophysiques de la matrice extracellulaire environnante (ECM) et d&#39;autres composants de microenvironnement 1-9. Études mécanistiques élégantes ont donné un aperçu du rôle de la rigidité extracellulaire en tant que partenaire de signalisation mécano complexe qui régit le comportement de la tumeur maligne et la morphogenèse 2,3,10,11. Ce travail a été facilité en particulier par le développement de la 3D dans des modèles de tumeurs in vitro qui restaurent biologiquement architecture tissulaire pertinents et peuvent être cultivées dans des matériaux d&#39;échafaudage mécanique accordables et imagés par microscopie optique 12-19. Cependant, de l&#39;autre côté de cette boîte de dialogue entre mechanoregulatory microenvironnement tumoral et, à travers laquelle les cellules cancéreuses, à son tour modifier la rhéologie de leur environnement, reste assezplus difficile à étudier. Par exemple, au cours des processus d&#39;invasion, les cellules à la périphérie d&#39;une tumeur peut subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et augmenter l&#39;expression de métalloprotéases matricielles (MMP) qui provoquent une dégradation locale de l&#39;ECM 20 à 22, qui à son tour, influence le comportement de croissance mécanosensible d&#39; d&#39;autres cellules tumorales proximales. Grâce à une variété de processus biochimiques, les cellules cancéreuses composer continuellement la rigidité locale de son environnement de haut en bas en fonction de différents processus à des moments différents. La méthode décrite ici est motivé par le besoin d&#39;outils d&#39;analyse qui rendent compte des changements locaux dans la rigidité et la conformité de l&#39;ECM lors de la croissance, qui peuvent être intégrés aux modèles tumoraux 3D et corrélés longitudinalement par des changements biochimiques et phénotypiques sans mettre fin à la culture. A la recherche d&#39;une technique appropriée pour mettre en œuvre dans ce contexte, microrhéologie particules de suivi (PTM) apparaît comme un candidat sérieux.Ce procédé, a lancé à l&#39;origine par Mason et 23,24 Weitz, utilise le mouvement de sondes de traceurs incorporés dans un fluide complexe pour signaler le module complexe dépendant de la fréquence viscoélastique de cisaillement, G * (ω) à des échelles de longueur micron. Cette approche générale a été développé avec de multiples variantes adaptées pour différentes applications dans la matière, colloïdes, biophysique molle condensée et la physique des polymères 25-31. PTM a certains avantages par rapport à d&#39;autres méthodes, comme les lectures de viscoélasticité locale sont fournies par l&#39;imagerie vidéo non destructif de sondes de traceurs biochimiques inactifs qui sont incorporés au moment de la préparation de la culture et restent en place pendant de longues périodes de croissance. Ceci est en contraste avec les mesures de l&#39;étalon-or avec un rhéomètre à cisaillement oscillatoire vrac, ce qui nécessite obligatoirement la fin de la culture et des rapports de la rhéologie macroscopique de l&#39;échantillon en vrac plutôt que des mesures ponctuelles sein de la tumeur microenvir 3D complexeronnement. En effet, un certain nombre d&#39;études ont montré l&#39;utilité de l&#39;interprétation des mesures de mouvements de la sonde de traceur dans ou autour de cellules cancéreuses ou non-cancéreuses de mesurer des déformations associées à la migration des cellules 32, le stress mécanique induit par un sphéroïde expansion 33, rhéologie intracellulaire 34,35, et mapper les contraintes mécaniques et les déformations dans les tissus par génie 36, et la relation entre la taille des pores et la vitesse d&#39;invasion 37. D&#39;autres techniques appropriées pour microrhéologie, telles que la microscopie à force atomique (AFM) peuvent être mises en œuvre, mais surtout pour les points de palpage à la surface de l&#39;échantillon et peuvent également poser des problèmes de stérilité culture qui compliquent les mesures longitudinales 38. Ici, nous décrivons un protocole complet qui englobe les méthodes de croissance des sphéroïdes tumoraux 3D appropriés pour le transfert dans ECM avec des sondes fluorescentes intégrés pour la vidéo particules de suivi et d&#39;analyse pour la cartographie fiable spatialechangements dans microrhéologie au fil du temps dans la culture. Dans la présente application, les modèles de tumeurs 3D sont cultivées en format multi-puits en vue de leur incorporation des mesures de Microrhéologie avec d&#39;autres tests traditionnels (par exemple, cytotoxicité) qui ce format est propice à la. Dans cette illustration représentative de cette méthodologie nous culture in vitro sphéroïdes 3D en utilisant des cellules Panc-1, une lignée cellulaire de cancer pancréatique établi connus pour former des sphéroïdes 39, mais toutes les mesures décrites ici sont largement applicables à l&#39;étude des tumeurs solides en utilisant une variété de lignées cellulaires adaptés à la culture 3D. Fondés sur l&#39;imagerie parce que cette méthode est intrinsèquement il est idéal pour les co-enregistrement des données de Microrhéologie haute résolution avec de grands champs de diascopie de vue qui signalent des changements dans la croissance cellulaire, la migration et le phénotype. La mise en œuvre de PTM intégré à la microscopie lumière transmise de cette manière suppose positionnement reproductible des wh stade de microscopeich est généralement disponible sur grand champ épifluorescence commerciale microscopes biologiques motorisés. Le protocole développé ci-dessous peut être mis en oeuvre avec n&#39;importe quel fluorescence automatisé microscope biologique raisonnablement équipé. Il s&#39;agit d&#39;une méthode intensive de données en soi, ce qui nécessite l&#39;acquisition de gigaoctets de données numériques de microscopie vidéo pour le traitement hors ligne. Dans le protocole suivant, le protocole 1 se rapporte à la préparation initiale des sphéroïdes de tumeur qui est décrite ici en utilisant superposition sur agarose, mais pourrait être substitués par une variété d&#39;autres méthodes telles que la goutte suspendue 40, ou culture rotatif 41 techniques. Protocole 2 décrit le processus d&#39;intégration des sphéroïdes dans un échafaudage de collagène mais alternativement, in vitro tumeurs en 3D peuvent être cultivées par encapsulation ou l&#39;incorporation de cellules remises en suspension dans l&#39;ECM 12,15, plutôt que de sphéroïdes non adhérentes simples pré-formées. Protocoles suivants décrivent les procédures pour obtenir des mesures de Microrhéologie résolues en temps par l&#39;acquisition et le traitement des données de microscopie vidéo, respectivement. Le traitement des données est décrit en utilisant MATLAB, faisant usage de routines open source pour PTM construit sur ​​des algorithmes initialement décrite par Crocker et Grier 42, qui ont également été largement développés pour différentes plates-formes logicielles (voir http://www.physics.emory.edu/ ~ semaines / idl /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Le micro-mécanique a été montré pour agir comme un régulateur essentiel du comportement de la croissance tumorale et de signalisation, qui est elle-même transformée et modifiée dans le cadre d&#39;un ensemble d&#39;interactions, dans les deux sens mécanosensibles complexes. Alors que le développement de modèles de tumeurs 3D biologiquement pertinentes ont facilité études mécanistiques sur l&#39;impact de la matrice rhéologie sur la croissance de la tumeur, le problème inverse de l&#39;évolution de la cartographie de l&#39;environnement mécanique induite par des tumeurs reste difficile. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de microrhéologie de traces de particules (PTM) en conjonction avec des modèles 3D de cancer du pancréas dans le cadre d&#39;une approche robuste et viable pour le suivi longitudinal des changements physiques dans le microenvironnement de la tumeur, in situ. La méthodologie décrite ici intègre un système de préparation de modèles in vitro 3D incorporés dans un modèle de matrice extracellulaire (ECM) de l&#39;échafaudage de collagène de type I avec des sondes marquées par fluorescence répartis uniformément pour po-sition et des mesures de temps-dépendante Microrhéologie à travers l&#39;échantillon. tumeurs in vitro sont étalées et sondés dans des conditions parallèles en utilisant des plaques d&#39;imagerie multi-puits. S&#39;appuyant sur ​​des méthodes établies, les vidéos des traceurs mouvements de la sonde sont transformés par la Relation généralisé Stokes Einstein (TBS) pour signaler le complexe viscoélastique module de cisaillement dépendant de la fréquence, G * (ω). Parce que cette approche est basée imagerie, caractérisation mécanique est également mappé sur de grands champs spatiaux transmis-lumière de signaler simultanément des changements qualitatifs dans la taille et le phénotype tumoral 3D. Les résultats représentatifs montrant contraste réponse mécanique dans les sous-régions associées à une dégradation locale de la matrice induite invasion ainsi que le calibrage du système, les données de validation sont présentés. Résultats indésirables de erreurs expérimentales communes et le dépannage de ces questions sont également présentés. Le format de la culture placage 3D 96 puits mis en œuvre dans ce protocole est conducive de corrélation des mesures de Microrhéologie avec des essais de criblage thérapeutiques ou d&#39;imagerie moléculaire à acquérir de nouvelles connaissances dans l&#39;impact des traitements ou à des stimuli biochimiques sur le microenvironnement mécanique.

Pour vérifier la validité de G * (ω) des mesures à des positions localisées dans un micro-environnement de la tumeur modèle complexe, deux expériences de validation initiales ont été menées. Tout d&#39;abord, nous avons cherché à valider nos mesures contre le «gold standard» de masse oscillante cisaillement rhéométrie. Nous avons préparé des échantillons identiques de matrice de collagène (sans cellules) à une concentration de 1,0 mg / ml de collagène. Ces échantillons ont été sondés a...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K vues.  University of Massachusetts Boston.  microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Recherche

Bio-ingénierie

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...