Notre protocole permet l’imagerie de l’ensemble du cerveau de la mouche pendant le comportement, ce qui est important pour comprendre comment les neurones dans différentes régions du cerveau interagissent pour façonner le comportement. Contrairement à d’autres protocoles publiés, cela a été développé spécifiquement pour accéder à l’ensemble du cerveau pendant que la mouche se comporte et se sent par une odeur, le goût ou la stimulation visuelle. Pour créer une fente de tête.
Après avoir imprimé le support avec une imprimante 3D, placez un morceau de ruban adhésif rectangulairement sur une surface plane sous un microscope stéréo. Et couper un morceau d’environ cinq millimètres par un centimètre. Utilisez deux scalpels fixés ensemble en parallèle pour couper un 400 par 400 micromètres fente suivante au milieu du côté plus long de la bande, et placer la bande sur le côté plus plat du trou sur le fond du support.
Utilisez des forceps pour pousser le ruban environ 500 micromètres autour du trou. Et utilisez du vernis à ongles noir pour couvrir le haut de la bande et le support. Après avoir laissé sécher le vernis à ongles pendant au moins une heure, utilisez un tissu roulé pour ajouter environ un microlitre de graisse à la fente de la tête.
Pour préparer la fente du corps, couper un morceau d’environ deux centimètres de ruban large en deux morceaux et couper 1,5 millimètre de large tranches. Ensuite, découpez une fente d’épaule et de corps de 0,3 millimètre de profondeur et assurez-vous que la bande s’adapte au support. Pour fixer une mouche dans le support, placez d’abord un récipient peu profond avec de la glace sous le microscope disséquant, et placez le support à l’envers sur un morceau de tissu de laboratoire placé au-dessus de la glace.
Aspirez une femelle d’un à quatre jours voler de sa vile, et souffler la mouche sur la glace non fondue. Lorsque la mouche cesse de bouger, utilisez les forceps Dell pour saisir la mouche à la base des ailes et faites glisser la mouche dans le support avec le cou à l’intérieur de la fente. Les yeux doivent être également positionnés de chaque côté de la fente.
Si nécessaire, ajouter un microlitre de graisse sur le dessus de la tête pour empêcher la colle d’atteindre l’arrière de la tête. Couvrez ensuite le corps d’un tissu et d’un peu de glace pour vous assurer que la mouche ne bouge pas. Pour fixer la tête, placez-la à un angle d’environ 20 degrés à partir d’une vue entièrement postérieure.
Et utilisez un tissu enroulé pour appliquer de la colle UV autour de la tête tout en évitant de salir la zone sensorielle d’intérêt. Pour les expériences gustatives, utilisez des forceps pour retirer la trompe et ajouter de la colle à la base de proboscis pour empêcher le mouvement. Si aucune expérience gustative n’est prévue pousser et coller la trompe dans la tête.
Guérir la colle avec de la lumière UV pendant cinq secondes, et utiliser un tissu enroulé pour nettoyer soigneusement les zones entourant la tête, pour enlever toute colle liquide restante qui pourrait coller aux jambes et les portes du sol, les zones sensorielles. Ensuite, utilisez une fine bande de ruban adhésif ou un tissu pour déplacer les jambes vers l’avant si nécessaire. Pour positionner le corps, retirez le récipient de glace et retournez le support.
Retirez l’eau autour de la mouche et agissez rapidement avant que la mouche ne se rétablisse de l’anesthésie placez la bande de fente corporelle au-dessus du trou et poussez doucement le corps de la mouche vers le bas, en prenant soin de ne pas trop étirer le cou. Couvrir les gros trous restants de ruban adhésif et ajouter environ un microlitre de graisse à l’arrière de la tête, afin d’empêcher la colle de coller à cet endroit. Utilisez un tissu enroulé pour peindre la colle UV autour du thorax et sur le dessus du ruban adhésif et du thorax, et guérir la colle avec de la lumière UV pendant environ cinq secondes.
Retirez soigneusement la graisse et la colle non durcie à l’aide d’un tissu de laboratoire et ajoutez environ un millilitre de solution saline au sommet de la tête. Utilisez des forceps pour repousser les bulles d’air et vérifier les fuites en plaçant un glissement de couverture sur la solution saline et en retournant le support pour vérifier la solution saline sur le côté avant. Si la solution saline est observée, retirer la solution saline et fixer le trou avec plus de colle ou plus de graisse.
Pour disséquer la tête choisir le grossissement le plus élevé et utiliser aiguisé forceps très fine pour faire deux coupes à la base du triangle central cuticule foncé de chaque côté du cou. Couper autour du triangle sombre, et enlever cette partie de la cuticule. Muscle 16 et l’œsophage doit être visible à travers ce trou et se déplaçant rythmiquement.
Utilisez les forceps très fins pour pincer soigneusement le dessus de cette zone pour couper le muscle 16 sans percer l’œsophage. Si le mouvement rythmique s’arrête le muscle 16 a probablement été enlevé. Lorsque le muscle a été excisé à partir du bord médial de la région du triangle sombre, utilisez les forceps comme une paire de ciseaux pour couper soigneusement et enlever le reste de la cuticule en petits morceaux.
Ensuite, utilisez les forceps pour saisir et lentement et régulièrement retirer un sac gonflable à la fois. Dans cette vidéo, une sonde de calcium a été exprimée dans tous les neurones de ces deux cerveaux de mouche de fruit. Et une bouffée d’odeur a été présentée.
Dans cette expérience, l’expression de capteur de calcium a été limitée aux neurones dopaminergiques et sérotonergiques. Remarquez la corrélation étroite entre la forte activité synchrone sur le cerveau et le comportement de marche des mouches illustrant comment tout le cerveau peut être observé au cours d’un comportement spécifique. À l’aide de l’analyse des composants principaux et de l’analyse indépendante des composants, différentes régions fonctionnelles mises en évidence dans différentes couleurs peuvent être extraites.
La forme et la localisation des régions fonctionnelles permettent aux régions d’être cartographiées en modèles anatomiques. Identifier les régions du cerveau et, dans certains cas, les types de neurones. Une fois alignés sur le modèle anatomique approprié, les valeurs de fluorescence peuvent être moyennes dans des régions cérébrales anatomiques spécifiques pour une analyse quantitative.
Par exemple, dans cette analyse, nous pouvons observer que toutes les régions sont plus actives pendant la marche que pendant le toilettage. patienter. Apprendre cette technique de dissection cardiaque est difficile.
Dans mon laboratoire, les gens ont besoin en moyenne de trois à quatre mois avant de le maîtriser et d’obtenir leurs premières préparations utiles. En suivant ce protocole, nous pouvons enregistrer l’activité cérébrale à grande échelle à l’aide d’un microscope à fluorescence. Des méthodes rapides telles que la microscopie de champ lumineux sont particulièrement indiquées.
