Les auteurs tiennent à remercier le Freimann Life Science Center et le Centre pour le personnel de recherche Zebrafish pour leurs soins et l&#39;entretien du poisson zèbre.

1. Resuspendre morpholino <ol><li> Diluer 300 nM de fluorescéine-étiqueté morpholino dans 100 ul de nucléase-free eau pour faire une solution d&#39;environ 3 mm. La solution est répartie dans des morpholino plusieurs microtubes paraffine scellés et entreposés à température ambiante et loin de la lumière. </li><li> Pour déterminer la concentration exacte morpholino, diluer 5 pi de solution de morpholino (ou de l&#39;eau comme une vierge) dans 95 ul de 0,1 N HCl. Fixer une référence sur un spectrophotomètre à 265 nm avec le blanc de l&#39;eau et de déterminer ensuite la lecture de la solution diluée morpholino. Multiplier l&#39;absorbance morpholino par sa constante déterminée et par le facteur de dilution pour déterminer la concentration en ng / ul. La constante est morpholino calculé comme suit: Morpholino constante = poids moléculaire de l&#39;absorbance X morpholino 1000/molar. Le poids moléculaire et l&#39;absorbance molaire pour le morpholino peuvent être trouvées sur le &quot;Oligo Properties &quot;feuille fournie avec le produit. Diviser la concentration morpholino, en ng / ul, par le poids moléculaire pour déterminer la concentration en mM. Diluer le morpholino, si nécessaire, à une concentration de travail, généralement 1,2 mM. </li></ol> 2. Amputation de la nageoire <ol><li> Anesthésier poisson zèbre adulte soit tricaïne ou 2-phénoxyéthanol à 1,0 mg / ml dans l&#39;eau du réservoir. </li><li> L&#39;amputation de la nageoire à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir ou un scalpel stérile proximale du premier point de branchement lepidotrichial. Cela devrait être fait à la même proximale / distale emplacement sur chaque animal (par exemple 7 segments osseux distaux de la ceinture fin). IMPORTANT: assurez-vous de couper parfaitement perpendiculaire au plan antérieur / postérieure de l&#39;animal. Coupes en biais se traduira dans l&#39;expansion de la nageoire inégale des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire. </li><li> Retournez le poisson dans un réservoir. En général, nous maintenir le poisson à 33 ° C pour augmenter le taux de régénération. Selon la conception expérimentale, wACI 0-2 jours après l&#39;amputation (dpa) pour la régénération des nageoires et commencer avant l&#39;introduction de la morpholino. D&#39;autres approches sont abordées dans la discussion, ci-dessous. </li></ol> 3. Morpholino injection <ol><li> Le jour avant l&#39;injection du morpholino, faire une plaque d&#39;injection (figure 2). Assurez-vous de découper une encoche à une extrémité du puits, qui aide à stabiliser le poisson pour la procédure de microinjection. </li><li> A 2 dpa, préparer l&#39;appareil d&#39;injection de micro-et la solution morpholino. </li><li> Diluer la fluorescéine-étiqueté morpholino à la concentration appropriée (vous recommandons de commencer avec 1,2 mM) et placer dans un bain à 65 ° C l&#39;eau, pendant 5 minutes. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de verre pour l&#39;injection de micro-aiguilles aide d&#39;un extracteur. </li><li> Chargez l&#39;aiguille avec le morpholino (note: selon que vous sauvegardez le remplissage ou l&#39;avant-charger votre aiguille de déterminer si vous chargez la première aiguille, ou de couper la pointe en premier). </li><li> Coupez la pointe de l&#39;aiguille à uneangle n. </li><li> Suivez les instructions de votre système d&#39;injection de micro-injecter une bulle d&#39;environ 5 nl de morpholino par injection. Les volumes plus importants de morpholino pourrait perturber le tissu. </li><li> Anesthésier le poisson et les déposer sur la plaque d&#39;injection. Retirez tous les excès de liquide et d&#39;orienter l&#39;aiguille à l&#39;emplacement approprié, juste en aval de la raie osseuse (figure 3). En utilisant un microscope et un appareil approprié pour la micro-injection morpholino injections (voir le tableau des réactifs spécifiques), injecter le morpholino dans la nageoire d&#39;avant en arrière, comme le montre la figure 3. L&#39;injection d&#39;arrière en avant provoque le tissu fin de retrousser lors de l&#39;injection et il est très difficile. </li><li> Insérez l&#39;aiguille doucement dans le tissu régénératrice, juste en aval de chaque rayon osseux (marqué &quot;1&quot; dans la figure 3) et poussez jusqu&#39;à ce que distalement situé dans le blastème (marqué «2» à la figure 3). Soyez prudent de ne pas pousser l&#39;aiguille à travers la sallefin des pneus. Lorsque l&#39;aiguille est correctement localisée, injecter le morpholino (c.-à-cliquer une fois). A 1,2 mM, la solution de fluorescéine-étiqueté morpholino apparaît jaune-vert, même dans des conditions d&#39;éclairage normales. Avec chaque injection, d&#39;un jaune &quot;bouffée&quot; de la solution morpholino peuvent être visualisées, ce qui permet de localiser l&#39;injection pour le blastème. Environ 75 nl (10-15 clics) de la solution morpholino doit être injecté par rayon osseux. Pause ~ 1 sec entre les deux clics. Nous injecter seulement la face dorsale, en utilisant la ventrale électroporation seule commande. Alternativement, on pourrait répéter cette procédure complète en utilisant un morpholino contrôle sur la moitié ventrale de la nageoire. </li></ol> 4. L&#39;électroporation de la morpholino <ol><li> Immédiatement après l&#39;injection du morpholino, retirer la plaque d&#39;injection de l&#39;appareil d&#39;injection de micro-. Remplir la plaque d&#39;injection bien avec la solution d&#39;anesthésie jusqu&#39;à ce que le poisson est immergé. L&#39;électroporation est réalisée sous la conduite d&#39;eau. </li> &lt;p&gt; A platine 3 mm de diamètre pince plaque d&#39;électrode (CUY-P3 650 pincettes, Protech international) localise les impulsions d&#39;environ la moitié de l&#39;ailette. Soyez prudent de ne pas toucher les électrodes sur le tissu fin. Pour veiller à ce que les électrodes ne se touchent pas le tissu fin, tourner le poisson sur sa face dorsale et regardez vers le bas de la ligne médiane pour l&#39;électroporation. </li><li> Électroporer la fois la dorsale et ventrale (pour contrôler les effets d&#39;une électroporation non-spécifiques) côtés de la nageoire en utilisant une onde carrée CUY21 Electroporateur (Protech International, Inc). Essuyez les électrodes avec une Kimwipe humide après chaque électroporation pour éliminer les bulles qui se sont formées. Si elles ne sont pas supprimés, un mini-charge s&#39;accumule, ce qui va attirer le tissu vers l&#39;électrode. Les paramètres d&#39;électroporation devrait être fixé à dix consécutive impulsions de 50 ms, à 15 V avec une pause de 1 sec entre les impulsions. </li><li> Placer le poisson sur une lame de verre ou de boîtes de Pétri et rapidement l&#39;image de la fin, en veillant à nouvoir l&#39;orientation dorsale / ventrale. Cette image sera utilisée pour l&#39;analyse repousse le lendemain. Retournez le poisson dans le réservoir. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Si la protéine ciblée qui a été renversé dans l&#39;expression est nécessaire à la régénération fin bon, une différence spectaculaire entre les deux moitiés dorsale et ventrale de la nageoire devrait être évident un jour après l&#39;électroporation (figure 5B). </li><li> A 3 dpa, prendre une autre photo de la nageoire de chaque poisson et correspondre cette image avec le correspondant d&#39;image 2 dpa (figure 5B). La variation naturelle dans le modèle de pigmentation fin entre les animaux vous permettra d&#39;identifier correctement chaque poisson. </li><li> Utilisation de l&#39;image NIH, de retracer les 2 et 3 dpa zones dpa des deux moitiés des dorsales et ventrales (figure 5B). </li><li> Pour déterminer la zone% de la consommation par rapport dorsale ventrale de la formule suivante: (dorsaux 3DPA - dorsaux 2dpa) / (ventrale 3DPA -<html> 2dpa ventrale) X 100 =% de la surface </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <ol><li> Nous avons toujours de dosage pour l&#39;excroissance fin à 3 hpe dpa, ou 24 (électroporation heures après). A cette époque, le morpholino fluorescéine-étiqueté doivent être présents dans la moitié dorsale de la nageoire (Figure complémentaire 1 et la figure 6A). Il est normal de voir certains de fuite vers le bas pour le niveau de l&#39;amputation. </li><li> Il devrait y avoir aucune différence entre les côtés dorsal et ventral de la nageoire injecté et électroporation avec le morpholinos de contrôle (figure 6B). </li><li> Si la cible expérimentale morpholino une protéine essentielle pour leur croissance nageoire, une différence considérable entre les côtés dorsal et ventral doivent être observées (Figure 6C). </li><li> Si l&#39;électrode a touché l&#39;aileron lors de l&#39;électroporation, le tissu apparaît brune (presque brûlé en apparence) et nécrotiques. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma des différents événements qui se produisent lors de la régénération fin. Les temps qui sous-tendent pour chaque événement sont donnés en heures post-amputation (hpa) et correspondent à une température de la cuve de 33 ° C. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figure 2. A. Schéma de la plaque d&#39;injection, qui est fabriqué à partir d&#39;agarose et contient un petit puits pour maintenir le poisson pendant micro-injection du morpholino. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figure 3. Schéma de microinjection morpholino. A. Placez le poisson dans le plat avec la tête du poisson dans l&#39;encoche découpée dans le puits, ce qui aidera les poissons restent stables. B. A faible grossissement, organiser l&#39;aiguille de telle sorte que il est à proximité de la régénération des tissus de l&#39;ailette. C </stro&gt; ng A plus fort grossissement, injecter la partie distale de chaque rayon de la nageoire osseuse (à savoir dans chaque blastème) morpholino. L&#39;aiguille doit entrer dans le tissu juste en aval de l&#39;rayons osseux (1), puis continuer à l&#39;emplacement du blastème (2). Remarque: les cercles verts dans le schéma sont uniquement destinées à indiquer l&#39;emplacement de l&#39;injection. Le morpholino peut brièvement être visualisé comme un vert / jaune &quot;bouffée&quot; après chaque injection, mais cela ne persiste pas comme indiqué dans le schéma. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figure 4. Schéma d&#39;électroporation fin. A. Après microinjection, placer le poisson dans une boîte de Pétri pleine de l&#39;anesthésie et électroporer les moitiés dorsale et ventrale. B. Assurez-vous de ne pas toucher le tissu fin. Les électrodes doivent être placés ~ 1 mm à partir du tissu. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figure 5. Schéma des méthodes utilisées pour calculer l&#39;inhibition excroissance fin. A. Prendre une photo de la nageoire de chaque poisson à 2 dpa, soit immédiatement avant ou après l&#39;injection morpholino et l&#39;électroporation. Trace le tissu régénératrice à la fois de la dorsale (vert) et ventrale (bleu) moitiés de la nageoire en utilisant NIH Image, (lignes noires en pointillés). B. A 3 dpa, prendre une autre photo de chaque ailette et de nouveau tracer les zones dorsale et ventrale de la repousse à l&#39;aide d&#39;image NIH. C. Soustrayez le domaine de la repousse à 2 dpa de la repousse totale de 3 dpa, tant pour les nantis dorsales et ventrales. La zone dorsale pour cent des contre ventrale repousse peut être calculé selon la formule: ((D 3DPA - D 2 dpa) / (V 3DPA - V 2dpa)) X 100. = 100 pour cent d&#39;inhibition - Pourcentage de la superficie. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Exemples Figure 6. De s&#39;attendrerésultats. A. image fluorescente montrant une fluorescéine-étiqueté de contrôle morpholino dans la moitié dorsale de la nageoire, 24 heures après l&#39;électroporation-(HPE). B. Brightfield l&#39;image d&#39;un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino de contrôle dans la moitié dorsale . L&#39;image montre la repousse égale des deux moitiés des dorsales et ventrales d&#39;une nageoire, 24 hpe. C. Brightfield l&#39;image d&#39;un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino expérimentale dans la moitié dorsale. L&#39;image montre l&#39;inhibition de la repousse sur le côté dorsal / injecté. La ligne indique le montant de la repousse à 2 dpa, immédiatement avant l&#39;injection morpholino et l&#39;électroporation. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figure 7. Schéma d&#39;une injection alternée et la procédure d&#39;électroporation à des protéines cibles impliquées dans la cicatrisation des plaies et la formation de blastème. A. Injecter le morpholinoentre chaque rayon de la nageoire osseuse sur la moitié dorsale de la nageoire. B. électroporer la morpholino comme d&#39;habitude. C. amputer la nageoire immédiatement proximale (~ 1 segment osseux) au site d&#39;injection. D. La fluorescéine-étiqueté morpholino peuvent être observées dans l&#39;épithélium de la plaie et blastème à 24 hpe. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figure 8. En utilisant la technique de cibler l&#39;épithélium plaies et la formation blastème. A. Brightfield l&#39;image d&#39;une ailette à 24 hpa qui a été injecté et électroporation avec un morpholino, immédiatement avant l&#39;amputation. B. image fluorescente de la nageoire montré dans le panneau A. Note que la moitié injectée dorsale de la nageoire montre bonne assimilation du morpholino dans le tissu régénératrice. C -. C &quot;plus fort grossissement de la moitié dorsale de la nageoire présenté dans les panneaux A et B. Les sites d&#39;injection sont souvent encore visibles (flèches), Mais de nombreuses cellules cibles ont migré à participer dans l&#39;épithélium de la plaie et la formation blastème (flèche). <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figure 9. En utilisant la technique pour cibler les cellules qui migrent pour former le blastème. A. fluorescent et les images en fond clair encart montrant une nageoire injecté et une électroporation avec morpholino sur les deux moitiés des dorsales et ventrales. La nageoire a ensuite été amputée à deux plans. La moitié dorsale a été coupé immédiatement en aval des sites d&#39;injection, alors que la moitié ventrale a été coupé 9-10 segments osseux distaux aux sites d&#39;injection. B. A 24 hpa, les images fluorescentes et fond clair encart montrent que morpholino a migré vers la dorsale régénérer (1), mais pas les régénérés ventrale (2), indiquant que seule la cellule immédiatement à proximité du site de coupe participer à la formation de blastème. Les deux ensembles de pointes de flèches blanches montrent le niveau de chaque amputationavion. Panneaux marqués 1 et 2 à l&#39;extrême droite de l&#39;image montrent une vue plus fort grossissement des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire, respectivement. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Figure 1 supplémentaire.</a> Une vidéo d&#39;un confocale z-empilement d&#39;une région correspondant à l&#39;emplacement d&#39;un blastème dans une ailette injecté et une électroporation avec un groupe morpholino commande. L&#39;image a été prise à 24 hpe. Comme une molécule de fluorescéine unique ne peut pas être visualisée, pas tous de la morpholino peuvent être visualisés ou quantifié. Cependant, ces images donnent une idée des divers degrés de l&#39;absorption qui peuvent être visualisées dans des cellules individuelles, à partir de points punctiformes, à cellules entières pleines de fluorescence morpholino. Sur l&#39;image fixe, l&#39;orientation est indiquée. La barre d&#39;échelle: 25 microns.

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	<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).</li><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+guidance+of+regenerating+optic+axons+by+chondroitin+sulfate+glycosaminoglycans+in+zebrafish.">Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish.</a> J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).</li><li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+mechanism+underlies+the+planar+polarization+of+regenerating+sensory+hair+cells.">A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).</li><li>Johnson, S. L., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutations+that+cause+stage-specific+defects+in+Zebrafish+fin+regeneration.">Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration.</a> Genetics. 141, 1583-1595 (1995).</li><li>Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+temperature-sensitive+mutant+emmental+reveals+a+role+for+sly1+during+cell+proliferation+in+zebrafish+fin+regeneration.">Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).</li><li>Tu, S., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+in+the+growing+and+regenerating+zebrafish+fin.">Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin.</a> Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).</li><li>Geraudie, J., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+RA-induced+apoptosis+and+patterning+defects+in+regenerating+fins+and+limbs.">Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).</li><li>Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin-betaA+signaling+is+required+for+zebrafish+fin+regeneration.">Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration.</a> Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).</li><li>Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+sonic+hedgehog,+patched+1+and+bmp2+genes+in+patterning+of+the+zebrafish+dermal+fin+rays.">Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays.</a> Development. 125, 4175-4178 (1998).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+Fgf+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration.">Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).</li><li>Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch+signaling+pathway+precedes+heart+regeneration+in+zebrafish.">Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).</li><li>Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+BMP+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration+disrupts+fin+growth+and+scleroblasts+differentiation+and+function.">Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function.</a> Dev Biol. 299, 438-454 (2006).</li><li>Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+expression+pattern+and+function+between+zebrafish+hoxc13+orthologs:+recruitment+of+Hoxc13b+into+an+early+embryonic+role.">Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role.</a> Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+knockdown+in+zebrafish.">Effective targeted gene knockdown in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).</li><li>Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+(GJA1)+is+required+in+the+population+of+dividing+cells+during+fin+regeneration.">Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration.</a> Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ici, nous décrivons un puissant perte de fonction d&#39;approche aux protéines d&#39;intérêt conditionnellement knockdown lors de la régénération chez le poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique a été utilisée pour étudier les gènes des jonctions lacunaires, de signalisation des récepteurs des facteurs de transcription, et microARN au cours excroissance fin de régénération 16, 20-22. Nous prévoyons que cette technique pourrait également être utilisé pour étudier les gènes nécessaires à la cicatrisation des plaies et la formation de blastème en adaptant la technique. Par exemple, on injecte et un groupe morpholino électroporation de commande dans l&#39;espace entre les rayons de la nageoire osseux sur la moitié de l&#39;ailette dorsale avant l&#39;amputation (figure 7). Nous avons ensuite amputé de la nageoire immédiatement en aval de l&#39;avion d&#39;injection. 24 hPa, nous avons observé que les cellules morpholino ciblées avaient émigré distalement pour former à la fois l&#39;épithélium de la plaie et blastème (Figure 8), indiquant que les cellules au cours de ces premières étapes de la régénération peut aussi être TargETED. La technique a quelques limitations notables. Par exemple, la fluorescence de la balise fluorescéine ne persiste pas après fixation et de traitement pour l&#39;immunohistochimie, ce qui rend impossible de corréler un phénotype cellulaire particulier (c.-à-prolifération cellulaire) avec le montant de morpholino présent dans une cellule. En outre, nous avons été en mesure de réaliser constamment l&#39;électroporation de plasmides dans la nageoire caudale de régénération, mais un groupe précédent a fait rapport de l&#39;électroporation réussie de l&#39;ADN dans le tissu fin 23. Enfin, nous avons noté que le morpholino n&#39;est efficace que pour environ 48 heures après l&#39;électroporation 21, qui interdit l&#39;utilisation de cette technique dans sa forme actuelle pour tester les gènes impliqués dans la différenciation des types de cellules nouvelles. Les essais supplémentaires et modification de la procédure peut permettre de surmonter ces limitations actuelles. En outre, il est possible que cette technique pourrait être utiliséepour tester des protéines impliquées dans la migration cellulaire à partir du tissu sous-jacent à l&#39;blastème. Par exemple, nous avons injecté et un contrôle par électroporation morpholino dans les deux côtés de l&#39;aileron (comme décrit dans la figure 7) avant l&#39;amputation. Nous avons ensuite amputée de la moitié dorsale de la nageoire immédiatement en aval de l&#39;avion d&#39;injection et nous amputer la nageoire ventrale beaucoup plus distale. À 24 hpa, les cellules morpholino-positifs sur la face dorsale avait migré à partir du site d&#39;injection à l&#39;épithélium sus-jacent et la plaie blastème. Cependant, ce n&#39;était pas le cas sur la face ventrale (figure 9). Cela confirme l&#39;idée que seules les cellules qui sous-tendent le plan d&#39;amputation de participer à la réponse régénérative. Ces données suggèrent également que les protéines hypothétiques être requis pour la migration des cellules pourrait être testé en utilisant cette technique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT ou CUY21-SC onde carrée électroporateur </td><td> Protech international </td><td> CUY21EDIT ou CUY21SC </td><td> Les deux unités travaillent pour ce protocole </td></tr><tr><td> 3-mm de diamètre électrodes à aubes </td><td> Protech international </td><td> 650-P3 CUY </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino devrait être conçu sur mesure pour votre protéine d&#39;intérêt </td></tr><tr><td> 2-phénoxyéthanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anesthésie; dilué 1:1000 dans l&#39;eau du système de poisson pour la procédure, 1:500 pour l&#39;euthanasie </td></tr><tr><td> Micro-injectisur la pompe </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> PV830 pneumatique PicoPump </td><td> De nombreux systèmes de micro-injection différents pourraient être utilisés </td></tr><tr><td> Micro-manipulateur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> MMJR </td><td> Droitier (MMJL pour les gauchers) </td></tr><tr><td> Micro-injection aiguilles, 1,0 mm de diamètre extérieur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B100F-4 </td><td> Ce sont des capillaires en verre de borosilicate, tiré dans une aiguille </td></tr><tr><td> Porte-aiguille </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 5430-ALL </td><td> Kit de buses Pico; assurez-vous de l&#39;encart joint 1,0 mm pipette </td></tr><tr><td> Aiguille extracteur </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Autres micropipette / aiguille extracteurs doivent aussi travailler </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Leica, Nikon, Zeisss </td><td> Nombre varie selon le fabricant </td><td> Toute stéréomicroscope avec 20X optique et la capacité de travailler avec micromanipulateurs </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Certaines espèces de poissons téléostéens et les urodèles peuvent régénérer leurs tissus. Le poisson zèbre sont devenus un modèle largement utilisé pour étudier la régénération spontanée des tissus adultes, tels que le coeur 1, de la rétine 2, la moelle épinière 3, nerf optique 4, les cellules ciliées sensorielles 5, 6 et les nageoires. La nageoire du poisson zèbre est un appendice relativement simple qui est facile à manipuler pour étudier plusieurs étapes dans la régénération epimorphic. Classiquement, la régénération fin a été caractérisée par trois étapes distinctes: la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l&#39;excroissance fin. Après l&#39;amputation partie de l&#39;aileron, l&#39;épithélium environnant prolifère et migre sur la plaie. A 33 ° C, ce processus se produit dans les six heures après l&#39;amputation (hpa, figure 1B) 6,7. Ensuite, les cellules sous-jacentes de différentes lignées (ex. os, sang, cellules gliales, des fibroblastes) ré-entrer dans le cycle cellulaire pour former un blastème proliférative, wien que l&#39;épiderme sus-jacent continue à proliférer (figure 1D) 8. Excroissance se produit en tant que cellules proximales à la ré-blastème se différencier en lignées leurs respectives pour former de nouveaux tissus (figure 1E) 8. Selon le niveau de l&#39;amputation, la régénération complète est achevée en une semaine à un mois. L&#39;expression d&#39;un grand nombre de familles de gènes, y compris wnt, Hox, FGF, msx, l&#39;acide rétinoïque, chut, cran, bmp, et l&#39;activine-bêta A gènes, est régulée à la hausse au cours des étapes spécifiques de la nageoire de régénération 9-16. Cependant, les rôles de ces gènes et leurs protéines codées en cours de régénération ont été difficiles à évaluer, à moins d&#39;un inhibiteur spécifique de la protéine existe 13, un mutant sensible à la température existe ou un animal transgénique (soit surexprimant la protéine de type sauvage ou une position dominante négatif protéine) a été généré 7,12. Nous déveped une technique de génétique inverse à rapidement et facilement tester le fonctionnement de n&#39;importe quel gène lors de la régénération fin. Oligonucléotides morpholino sont largement utilisés pour étudier la perte de protéines spécifiques au cours du poisson zèbre, le xénope, poulet, et le développement de la souris 17-19. Paires de bases morpholinos avec une séquence d&#39;ARN complémentaire l&#39;une de bloc de pré-ARNm épissage ou de traduction d&#39;ARNm. Nous décrivons une méthode pour introduire efficacement à la fluorescéine étiqueté antisens morpholinos en nageoires de poisson zèbre à l&#39;expression de régénération inactivation de la protéine cible. Le morpholino est micro-injecté dans chaque blastème de régénération de la nageoire du poisson zèbre et la queue par électroporation dans les cellules environnantes. Fluorescéine fournit la charge pour électroporer la morpholino et de visualiser le morpholino dans le tissu fin. Ce protocole permet knockdown protéines conditionnelle d&#39;examiner le rôle des protéines spécifiques au cours de l&#39;excroissance fin de régénération. Dans le Discussion, nous décrivons comment cette approche peut être adapté pour étudier le rôle des protéines spécifiques lors de la cicatrisation ou de la formation blastème, ainsi que d&#39;un marqueur potentiel de la migration cellulaire lors de la formation blastème.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l&#39;expression d&#39;une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l&#39;excroissance de régénération.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K vues.  University of Notre Dame. Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l'expression d'une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excr...

Vidéo: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

L&#39;électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...