Ce protocole permet l’étiquetage des cellules ependymoglial individuelles dans le télencéphale de poisson zèbre pour permettre leur surveillance à long terme, aussi bien que la manipulation des voies spécifiques d’une manière cellule-autonome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étiquetage d’une seule cellule de manière rapide et efficace, ainsi que l’édition de gènes et la manipulation des voies de signalisation de manière autonome. Cette méthode permet d’étude des questions fondamentales de biologie cellulaire, par exemple, sur la délamination cellulaire, le maintien de l’homéostasie épithéliale et la symétrie de la division cellulaire.
Commencez par utiliser un appareil de traction d’aiguilles pour préparer des capillaires en verre. Utilisez des pointes de microchargeur pour remplir un capillaire en verre préparé de dix microlitres de solution plasmide. Ensuite, appuyez sur le menu changer capillaire"sur le dispositif d’injection pour permettre à l’aiguille d’être chargé dans le porte-aiguille.
Ensuite, passez du dispositif d’injection du capillaire de changement au mode d’injection. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope avec un grossissement quatre fois, et finden forceps, couper seulement la pointe du capillaire. Ensuite, appliquez une pression sur la pédale pour confirmer que les solutions plasmides s’épuisent facilement de l’aiguille sans entrave.
Lorsque l’aiguille est prête, transférer un poisson zèbre du réservoir d’élevage dans un récipient de solution anesthésique. Et attendre quelques minutes jusqu’à ce que le mouvement des branchies s’apaie. Appuyez sur le côté dorsal du poisson sous sedated vers le haut sur une éponge pré-mouillée sous le stéréomicroscope, et utilisez un microknife disséquant en acier inoxydable avec un bord de coupe de 40 millimètres et une épaisseur de 0,5 millimètre pour créer soigneusement un petit trou dans le crâne de poisson sur le côté postérieur du telencéphalon, juste à côté de la bordure du tectum optique.
Inclinez le poisson au besoin et orientez la pointe du capillaire en verre vers le crâne dans l’angle correct pour faciliter la pénétration de la pointe capillaire à travers le trou. Ensuite, insérez très soigneusement la pointe du capillaire dans le trou à travers la couche dorsale des cellules épendymales, jusqu’à ce qu’elle atteigne le ventricule télencéphale, et appliquez une pression sur la pédale pendant environ 10 secondes pour délivrer environ 1 microlitre de la solution plasmide. Le succès de la livraison peut être confirmé en observant la propagation du liquide vert dans tout le ventricule.
Couvrir le télencéphale de poisson avec une petite quantité de gel à ultrasons. Pour l’électroporation de l’animal injecté par plasmide, retirez l’éponge de l’injection et plongez le côté intérieur des électrotips dans le gel à ultrasons. Placez la tête de poisson entre les électrodes, avec l’électrode positive sur le côté ventral de la tête et l’électrode négative sur le côté dorsal.
Puis, tout en tenant le corps du poisson dans l’éponge, appuyez sur les électrodes doucement et précisément contre le télencéphale et administrer le courant avec la pédale, en maintenant les électrodes en place jusqu’à ce que les cinq impulsions soient terminées. Si l’électroporation est réussie, des cellules ependymoglial simples étiquetées plasmides peuvent être observées parmi les cellules ependymoglial non plasmides étiquetées. Selon l’efficacité du processus d’électroporation, un nombre plus élevé ou inférieur de cellules épendymogliales peut être étiqueté.
Néanmoins, le protocole démontré donne un plus grand nombre de cellules étiquetées que les protocoles précédemment publiés. Notez que la plus forte densité de cellules étiquetées tend à émerger principalement du côté ventriculaire intérieur des deux hémisphères en raison de la façon dont le liquide plasmide injecté se répartit entre les hémisphères. Dans cette vidéo, un hémisphère du télencéphale de poisson zèbre est présenté en 3D, où les cellules épendymoglial avec des processus radio, sont dans le magenta une fois observés du côté.
Par co-électroporation avec un autre plasmide qui étiquette les noyaux, la division cellulaire des cellules épendymoglial peut être observée. L’électroporation infructueuse entraîne un nombre très faible ou aucune cellule épendymoglial étiquetée. Les cellules épendymales dorsales, cependant, sont les plus susceptibles d’être étiquetées.
Leur soma est plus grand dans cuboïde et ils ne possèdent pas de processus radio-allongés comme évident d’une vue latérale de la couche cellulaire épendymoglial. les cellules étiquetées tdTomato-mem sont très probablement des cellules épendymales, qui sont situées au-dessus de la couche d’ependymoglia. En revanche, l’introduction d’un tdTomato-mem exprimant le plasmide aux cellules ependmyoglial individuelles a comme conséquence l’expression de tdTomato-mem en plus de l’étiquetage initial de cellules.
Les choses les plus importantes à retenir sont de couper seulement la pointe du capillaire et de pénétrer la couche épendymale tout en injectant de sorte que le liquide se propage dans tout le ventricule. Cette technique permet la surveillance à long terme des cellules ependymoglial simples par imagerie in vivo, et donc établir leur rôle dans la régénération du cerveau ainsi que leur vaste lien génétique in vivo.
