Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) et l&#39;Union européenne (ZF-Santé).

1. Préparation du mélange d&#39;injection <ol><li> Utilisez morpholinos in vivo les cellules internalisent de façon plus efficace que les molécules morpholino normales. Voir les informations du fabricant pour plus de détails (Tableau 1: Réactifs et matériels). </li><li> Utilisation d&#39;un colorant fluorescent de poursuite (par exemple rouge CellTracker CMTPX, Invitrogen) pour visualiser l&#39;exactitude de l&#39;injection. Ce colorant est métabolisé dans la cellule et devient fluorescent seulement dans la cellule après l&#39;absorption. Par conséquent, cette étape est cruciale pour déterminer les cellules qui sont efficacement ciblées par la microinjection cerebroventricular. </li><li> Préparer un tampon phosphate salin (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) pour diluer solution morpholino. Si une dilution de la solution morpholino est nécessaire, utilisez toujours PBS. </li><li> Préparer 10 pl du mélange d&#39;injection en ajoutant 9 pl de la solution morpholino et 1 pl de the colorant traqueur de cellules (dilué ou non la concentration du stock de la solution morpholino est de 500 uM Nos résultats précédents 22 indiquent que plusieurs doses différentes du morpholino -.. allant de 50 et 500 microns - conduire à des niveaux de knockdown de manière efficace knockdown à des phénotypes hypomorphic). 1 pl de la solution est assez pour injection dans un cerveau de poisson zèbre. </li><li> Bien mélanger et stocker à température ambiante jusqu&#39;à ce que l&#39;injection. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;appareil d&#39;injection <ol><li> Préparer les capillaires injection vitre à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguilles. Utilisez les paramètres suivants: valeur du cycle de chauffage: 463, tirant valeur du cycle: 230, vitesse: 1,5 s, temps: 75 ms. </li><li> Allumez la source de pression et ajuster les réglages de pression de 50 psi ou 3,5 bars. </li><li> Réglez les paramètres microinjecteur comme suit: maintenir la pression de 20 psi, la pression d&#39;éjection 10 psi, la valeur de période de 2,5 et 100 msec gamme de déclenchement. </li><li> Tournersur la lampe annulaire et positionner l&#39;anneau sur la platine du microscope. </li><li> Placer le support de capillaire à une position appropriée à côté du microscope. </li><li> Insérer le capillaire en verre dans le support. Ajustez l&#39;angle d&#39;injection à 45 degrés. </li><li> Casser la pointe du capillaire en verre à l&#39;aide d&#39;une pince fine extrémité et calibrer la sortie de pression de l&#39;orifice. Ce doit être testé en immergeant la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;eau du poisson et de donner une impulsion de pression en continu. Les bulles d&#39;air découlant devraient être une seule ligne, ce qui est une indication de la pression optimale / taille de l&#39;orifice. S&#39;il vous plaît voir la vidéo de démonstration de ce calibrage. </li><li> Chargez le capillaire en verre avec la solution injectable sans bulles d&#39;air. </li><li> Appliquer une pression pour enlever l&#39;air entre l&#39;extrémité du capillaire en verre et la solution injectable chargée. </li></ol> 3. Anesthésie <ol><li> Préparer la solution mère des anesthésiques (0,1% MESAB - éthyl-m-aminobenzoate de méthanesulfonate). </li><li> Retirer nombre souhaité de poisson à partir de leurs réservoirs dans des cages de souris en plastique ou autre récipient de transport avec une quantité suffisante d&#39;eau. </li><li> Préparer la solution d&#39;anesthésie dans une petite boîte en plastique en mélangeant 200 ml d&#39;eau du poisson avec 5 ml de solution anesthésique boursier. La concentration finale de la anesthésiques: 0,0025% (v / v). </li><li> Remplir à moitié un plat en plastique Petri avec des anesthésiques. Utilisez ce plat pour préparations injectables. </li><li> Incuber les poissons dans les anesthésiques jusqu&#39;à ce que les dompte de poissons. </li></ol> 4. Incision et microinjection Cerebroventricular <ol><li> Retirer le poisson de la boîte à l&#39;aide d&#39;un filet de poisson et le placer dans la boîte de Pétri. </li><li> Maintenez le poisson avec la pince et d&#39;orienter la tête d&#39;une manière qu&#39;il s&#39;incline légèrement vers le bas. Cela facilitera l&#39;incision. </li><li> Générer une petite fente sur le crâne à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 30 barbelé-end. Utilisez seulement la pointe de l&#39;aiguille et ne pénètrent pas plus deassez dans le cerveau car cela pourrait causer des dommages aux tissus du cerveau et se manifeste par l&#39;hémorragie. </li><li> Maintenez le poisson et insérez la pointe du capillaire en verre sur le site d&#39;incision. </li><li> Orienter la pointe du capillaire en verre vers le télencéphale. Évitez de toucher le tissu cérébral car cela crée des dommages aux tissus et empêche également la dispersion de la solution injectée. </li><li> Injecter la solution. Le liquide se disperse immédiatement après l&#39;injection. </li></ol> 5. Récupération et analyse de la précision d&#39;injection <ol><li> Retirer le poisson de la configuration de l&#39;injection et le placer dans une boîte en plastique avec de l&#39;eau du poisson frais. </li><li> Permettre la récupération. </li><li> Re-anesthésier le poisson avec 0,0025% MESAB brièvement et vérifier le poisson sous le microscope à fluorescence. Une dispersion complète de la fluorescence rouge est une indication de la distribution à grande échelle du liquide injecté. </li><li> Mettez le poisson dans la boîte en plastique. </li><li> Branchez le boîtier en plastique de til le système de circulation pour oxygéner les poissons et les maintenir pendant de longues périodes de temps. </li><li> Utilisez le poisson à des fins souhaitées telles que des analyses comportementales ou de sacrifier les animaux à des moments souhaités après l&#39;injection pour préparer des échantillons de tissus pour des analyses plus poussées (colorations histologiques, immunohistochimie, etc.) Les références suivantes donnent des exemples de la façon d&#39;analyser le cerveau de poisson zèbre adulte: 9,11,17-20,24-27. Le meilleur temps pour observer un effet de choc efficace (plus de 50% knockdown) était de 12 heures dans nos études 22. </li></ol> 6. Contrôles scientifiques proposées <ol><li> Utilisez une molécule morpholino de décalage qui n&#39;est pas censé causer aucun phénotype comme contrôle négatif. Utilisez soit une molécule morpholino standard ou spécifiquement contrôles morpholino conception pour chaque gène d&#39;intérêt. En outre, utiliser le solvant (dans ce cas PBS) comme un autre témoin négatif pour évaluer les effets ou la toxicité non spécifiques de la mismeatch / contrôle injections morpholino. </li><li> Utilisez PCNA morpholinos décrit précédemment 22 comme contrôles positifs. Cette morpholino provoque knockdown efficace dans le cerveau du poisson zèbre adulte (75-95% d&#39;efficacité de knockdown à 1 jour de l&#39;injection) 22. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode que nous décrivons ici permet une administration facile et rapide de morpholinos dans le cerveau de poisson zèbre adulte. Nous avons montré que notre méthode d&#39;injection bloque efficacement l&#39;expression des gènes dans les cellules ventriculaires et entraîne des conséquences fonctionnelles de la réponse de la neurogenèse. Il ya des points important d&#39;être prudent lors de l&#39;exécution sur la microinjection cerebroventricular. Par exemple, l&#39;effet des molécules morpholino dépend de la concentration utilisée. Cette concentration doit être déterminée par l&#39;utilisateur final. Nous vous recommandons de commencer avec la solution de stock (500 M) et en effectuant des dilutions en série, et idéalement d&#39;effectuer une pré-test par injection dans des embryons en utilisant un écart embryon injection protocoles 28-30. Auparavant, nous avons obtenu différents niveaux d&#39;efficacité knockdown avec des concentrations de morpholinos allant de 50 et 500 microns 22. En second lieu, l&#39;orifice de la vitre capillaire ne doit pas être large que cela conduira à une vaste afflux de liquide dans le cerveau après l&#39;injection. De même, l&#39;ouverture ne doit pas être trop étroit car cela empêchera injection adéquate. On peut déterminer la combinaison optimale orifice pression en pompant de l&#39;air dans une boîte de Pétri avec de l&#39;eau. Les bulles découlant devraient être sur une seule ligne, mais pas en plusieurs lignes. Nous démontrons dans la vidéo. Troisièmement, l&#39;incubation du poisson dans les anesthésiques est critique. Le poisson ne doit pas être conservée plus de 2 min dans les anesthésiques. Cela va entraver le taux de récupération après l&#39;injection. Quatrièmement, l&#39;emplacement de l&#39;incision est essentiel pour disperser complètement le liquide injecté. La région ventriculaire sur le toit optique est plus grande au-dessus de la ligne médiane et se rétrécit latéralement. Par conséquent, l&#39;expérimentateur doit générer la fente dans le crâne à proximité de la ligne médiane et juste caudale à la plaque de crâne couvrant la région télencéphalique. Un des avantages du produit à injecter cerebroventricularn méthode (CVMI) est son rapidness. CVMI est une méthode rapide pour le dosage de la fonction des gènes. Cette fonction est utile et important par rapport à la génération de lignées transgéniques pour des études fonctionnelles, qui prennent généralement plusieurs mois. En outre, CVMI conduit à une répartition uniforme du liquide injecté et fournit donc une manipulation relativement approfondie de l&#39;activité des gènes, par rapport aux injections focales ou l&#39;électroporation. Avec CVMI, plusieurs gènes peuvent être renversés simultanément en préparant injection mélange contenant de multiples morpholinos oligonucléotide. CVMI peut être utilisé pour injecter des concentrations différentes d&#39;une donnée oligonucléotides morpholino, et peut donc être utilisé pour analyser les phénotypes hypomorphic. Enfin, ce paradigme d&#39;injection n&#39;entraîne pas de toxicité ou de compromettre la survie des animaux. La technique CVMI pourrait être étendu à d&#39;autres types d&#39;études telles que l&#39;injection de peptides modulateurs, des médicaments, ADN plasmidique ou modulateur ARN molecules ou d&#39;autres substances qui pourraient influer sur la physiologie des cellules. Dosage combinaison de molécules et la réalisation d&#39;analyses dose-réponse sont possibles en utilisant notre méthode, qui permet l&#39;étude des phénotypes hypomorphic. Grâce à ces propriétés, CVMI s&#39;avère être un test rapide et facile pour les études d&#39;expression dans le cerveau du poisson zèbre adulte, et ouvre de dépistage rapide et des analyses fonctionnelles. Le cerveau du poisson zèbre adulte peut produire constitutivement nouveaux neurones tout le long axe rostrocaudal et il peut également se régénérer après des lésions traumatiques. Ceci est en contraste frappant avec le cerveau des mammifères avec la neurogenèse limitée et pas du tout, plutôt faible capacité de régénération. Cette activité de cellules souches répandue et la capacité de récupération rend poisson-zèbre un organisme modèle utile pour comprendre les programmes moléculaires nécessaires à la régénération du système nerveux central, qui sont actuellement largement inconnue. Par conséquent, d&#39;enquêter sur la base moléculaire de l&#39;aptitude de régénération des zebrafish cerveau est un domaine de recherche intéressant qui pourrait expliquer la différence fondamentale la façon dont les poissons et les mammifères cerveau réagit après une blessure, et confèrent également des pistes pour les thérapies médicales régénératrices chez les humains. Afin de comprendre l&#39;infrastructure moléculaires de la plasticité du cerveau des vertébrés et de régénération, les cellules gliales constituent un domaine de recherche important car ils sont les ancêtres neurogène 3,8,20. Ainsi, en utilisant la technique CVMI d&#39;altérer la fonction des gènes dans les cellules gliales radiales du cerveau du poisson zèbre joue un rôle dans l&#39;élucidation de la façon dont le cerveau de poisson peut activité progénitrices couple à la neurogenèse adulte et efficace réponse régénérative. Nous avons récemment montré l&#39;implication et l&#39;exigence de plusieurs facteurs et voies de signalisation dans la réponse de la neurogenèse de régénération du cerveau de poisson zèbre adulte 24,26,27, et ces études ont été rendues possibles par l&#39;utilisation de la méthode CVMI. Dans l&#39;ensemble, les connaissances que nous acquérons de poisson zèbre cerveau pourrait être exploitée pour imposer Regenecapacité figurative aux cellules gliales mammifères qui réagissent à des blessures et va donc aider à concevoir des thérapies cliniques pour les troubles neurologiques humaines et les blessures graves.

neurogenèse adulte est un trait commun aux vertébrés, mais son degré de prévalence et de l&#39;efficacité varie en fonction de la phylogénie 1,2,3,4,5,6. Par exemple, le cerveau des mammifères adultes contiennent des régions de cellules souches en grande partie limitées au cerveau antérieur 7,8, tandis que le poisson-zèbre teleost contient seize domaines des cellules souches différentes et des zones neurologiques associées à l&#39;ensemble de son cerveau 4,5,9,10. Cette variation entre les mammifères et les poissons zèbres pourrait refléter une disparité dans les mécanismes de maintenance des cellules souches et de la capacité neurogène des cellules progénitrices. La compétence tout au long de poisson zèbre pour produire des neurones dans le cerveau pourrait également poser des ramifications cliniques comme les mécanismes moléculaires utilisés par le poisson-zèbre cerveau pourraient être exploitées pour des applications thérapeutiques pour lutter contre les maladies neurodégénératives chez l&#39;homme. Plusieurs cellules souches zones du cerveau de poisson zèbre adulte ont été analysées et il a été démontré que l&#39;cellules qui tapissent la surface ventriculaire de ces régions servent de cellules progénitrices 9,11-20. Des analyses détaillées dans le télencéphale poisson zèbre, par exemple, ont identifié les cellules gliales radiales, qui délimitent la surface ventriculaire de cette région du cerveau à être progéniteurs neurogéniques 19, 20. Cela est vrai pour d&#39;autres régions comme le cervelet et le toit optique, où ventricularly-situé cellules neuro fournissent l&#39;entrée neurogène 16,21. À cette fin, la compréhension des mécanismes moléculaires régissant la compétence neurogène répandu dans le cerveau du poisson zèbre adulte nécessite la manipulation de l&#39;expression des gènes dans les cellules progénitrices. Diverses méthodes ont été décrites précédemment pour la fonction des gènes modulant chez le poisson zèbre. Il s&#39;agit notamment de génération de lignées transgéniques exprimant conditionnelles variantes souhaitée d&#39;une seule protéine, injections focales à base de plasmide couplés à des traitements d&#39;électroporation ou chimiques. Nous avons déjà conçu unprocédé d&#39;administration de diverses substances, notamment des oligonucléotides morpholino ou de protéines dans le cerveau de poisson zèbre adulte avec microinjection cerebroventricular comme un moyen rapide et efficace de la fonction des gènes modulant dans les cellules ventriculaires du poisson zèbre adulte forebrain 22. Dans nos études, morpholinos in vivo ont été utilisés en raison de leur composition chimique impliquant la molécule morpholino lié de façon covalente à l&#39;arginine peptides de livraison riches, qui permettent la prestation efficace des cellules d&#39;intérêt sans avoir besoin de perméabilisation supplémentaires telles que l&#39;électroporation 23. Cela permettrait un ciblage minutieux du tissu désiré après l&#39;injection, tout comme ce que nous avons observé chez les adultes poisson zèbre telencephalon 22. Utilisation des morpholinos in vivo sont donc supérieur aux méthodes existantes de tissu de ciblage telles que l&#39;électroporation ou l&#39;injection focal de molécules d&#39;ADN. Ici, nous démontrons visuellement la façon dont nous effectuons cette opération et de fournir unprotocole étape par étape. Nous commençons par expliquer la préparation du mélange d&#39;injection et le poisson à injecter, et de procéder, en démontrant comment le dispositif d&#39;injection est mis en place. Nous fournissons une description de la méthode d&#39;injection cerebroventricular, qui consiste à générer une incision dans le crâne et l&#39;injection des morpholinos utilisant microinjecteur. Nous élaborons également sur les points critiques il les faut être prudent durant toute la procédure en leur indiquant que l&#39;optimisation ou des guides de dépannage.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulation de l&#39;expression des gènes dans les tissus est nécessaire de réaliser des études fonctionnelles. Dans cet article, nous démontrons la technique de micro-injection cerebroventricular (CVMI) comme un moyen de moduler l&#39;expression des gènes dans le cerveau du poisson zèbre adulte. En utilisant CVMI, les substances peuvent être administrées dans le fluide cerebroventricular et être distribués à fond le long de l&#39;axe rostrocaudal du cerveau. Nous nous concentrons particulièrement sur ​​l&#39;utilisation d&#39;oligonucléotides antisens morpholino, qui sont des outils puissants pour abattre l&#39;expression des gènes in vivo. Dans notre méthode, lorsqu&#39;elle est appliquée, les molécules morpholino sont absorbés par les cellules qui tapissent la surface ventriculaire. Ces cellules comprennent des cellules gliales radiales, qui agissent en tant que progéniteurs neurogènes. Par conséquent, abattre l&#39;expression des gènes dans les cellules gliales radiales est d&#39;une importance capitale pour analyser la réponse de la neurogenèse répandue chez le poisson zèbre, et aussi permettrait de mieux comprendre comment les vertébrés pourraient soutenir NEUROGEN adulteréponse du SIAE. Une telle compréhension pourrait également contribuer aux efforts pour les applications cliniques dans les maladies neurodégénératives humaines et la régénération du système nerveux central. Ainsi, nous présentons la méthode de micro-injection cerebroventricular comme un moyen rapide et efficace pour modifier l&#39;expression des gènes et la réponse de la neurogenèse dans le cerveau antérieur de poisson zèbre adulte. Nous fournissons également des conseils de dépannage et autres informations utiles sur la façon de mener à bien la procédure CVMI.

Microinjection Cerebroventricular conduit à une large diffusion de la solution injectée En utilisant le schéma de workflow et technique de la micro-injection cerebroventricular illustré à la figure 1, nous avons administré oligonucléotides morpholino dans le cerveau de poisson zèbre adulte. Un protocole précis de l&#39;injection conduit à la dispersion du liquide injecté dans le cerveau et l&#39;efficacité de ciblage des cellules proches de la surface du ventricule (Figure 2A). Injections où le capillaire en verre empale le tissu cérébral auront un signal fluorescent dense au niveau du point d&#39;injection (figure 2B). Si la quantité injectée n&#39;est pas suffisant, le signal fluorescent faible sera observée (figure 2C). Microinjection Cerebroventricular peut être utilisé pour abattre l&#39;expression du gène à la région ventriculaire du cerveau du poisson zèbre adulte Nous avons montré èmeà morpholinos vivo peut pénétrer de quelques diamètres cellulaires à l&#39;intérieur de la surface du ventricule et donc capable de cibler efficacement les cellules ventriculaires (figures 3A, 3B). Injection Morpholino pouvez l&#39;expression des gènes knockdown car il permettra de réduire la production de la protéine correspondante (un exemple est PCNA comme le montrent les figures 3C, 3D). Nous avons déjà démontré que abattre gènes en utilisant cette technique entraîne des conséquences fonctionnelles au cours de la neurogenèse adulte (figures 3e, 3f) ou la réponse de régénération (figures 3G, 3H). Nous avons démontré que la gamme de knockdown efficace (plus de 50% knockdown) est atteinte environ 12 heures après l&#39;injection du morpholinos 22. Nous avons également observé que la période de knockdown efficace est jusqu&#39;à environ 5 jours après l&#39;injection de la protéine PCNA 22. Plus de 70% knockdown a été vu jusqu&#39;à 3 jours après l&#39;injection 22. Les courbes de knockdown sont dépendants on le niveau d&#39;expression des protéines endogènes et de l&#39;efficacité des molécules morpholino, et doit être déterminée pour chaque gène par l&#39;expérimentateur. Dans nos études, nous n&#39;avons pas vu que la procédure CVMI compromet la survie de l&#39;animal, sans doute parce que l&#39;administration des molécules morpholino est locale et ne provoque pas de toxicité systémique. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de la technique d&#39;injection cerebroventricular. (A) L&#39;injection est réalisée à partir de la dorsale du poisson zèbre adulte (1) au niveau du toit optique (OT, 2). Une incision est faite sur la plaque du crâne tectal optique avec une aiguille de calibre 30 (3). Utilisation de tubes capillaires en verre, les molécules morpholino sont injectés dans le liquide du ventricule (4). Une dispersion complète est unechieved instantanément (5). (B) La canule et son barbelés fin est montré dans un fort grossissement. (C) L&#39;orientation de l&#39;aiguille avant l&#39;incision. (D) L&#39;incision est encerclé et a souligné en pointillés. (E) L&#39;injection capillaire est situé comme indiqué et l&#39;injection est effectuée. Tous les panneaux ont été adaptés à partir ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figure 2. Comparaison de l&#39;efficacité de l&#39;injection et de la précision. (A) une bonne injection conduit à cibler des cellules proches de la surface du ventricule. (B) si le capillaire en verre est insérée dans le tissu cérébral, il génère un signal de fluorescence central. (C </strong&gt;) Si le montant de l&#39;injection est faible, cela conduira à une plus faible signal de fluorescence. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figure 3. . Pénétration Morpholino, l&#39;efficacité des passes rabattues de gènes et ses conséquences fonctionnelles (A) GFP immunologique sur les sections transversales télencéphaliques de contrôle morpholino-injectés Tg (H2A: GFP) lignée transgénique montrant noyaux GFP-positives. (B) la GFP immunomarquage sur les sections transversales de la GFP télencéphaliques antisens morpholino-injecté Tg (H2A: GFP) lignée transgénique affichant noyaux GFP-positives. Noter la différence dans le signal de la GFP à la région ventriculaire. v: ventricule. (C) PCNA immunologique sur le contrôle morpholino-injecté cerveau montrant la distribution généralisée des cellules PCNA-positifs. ( <strong&gt; D) PCNA immunologique sur PCNA antisens morpholino cerveaux injectés montrant des quantités significativement réduit de cellules PCNA-positifs, montrant que CVMI pouvez gènes endogènes knockdown. (E) BrdU et HuC / D immunologique sur le contrôle morpholino-injectés cerveau afin de déterminer les nouveaux neurones après une expérience pulse-chase BrdU décrit précédemment 22. (F) BrdU et HuC / D immunologique sur PCNA antisens morpholino-cerveaux injectés afin de déterminer les nouveaux neurones après une expérience pulse-chase BrdU décrit précédemment 22. (G) Knocking-down PCNA conduit à une réduction significative de la génération de nouveaux neurones, ce qui indique que CVMI peut être utilisé à des gènes endogènes knockdown, qui donnent lieu à des conséquences fonctionnelles. Tous les panneaux ont été adaptés à partir ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Dans cet article, nous démontrons une méthode pour la manipulation de l&#39;expression des gènes dans les cellules ventriculaires du télencéphale de poisson zèbre adulte en utilisant des oligonucléotides antisens morpholino. Nous présentons aussi un protocole efficace et rapide qui peut être utilisé pour des études fonctionnelles dans le cerveau des vertébrés adultes cette méthode.

Micromanipulation de l&#39;expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d&#39;oligonucléotides Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K vues.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. Dans cet article, nous démontrons une méthode pour la manipulation de l'expression des gènes dans les cellules ventriculaires du télencéphale de poisson zèbre adulte en utilisant des oligonucléotides antisens morpholino. Nous présentons aussi un protocole efficace et rapide qui peut être utilisé pour des études fonctionnelles dans le cerveau des vertébrés adultes cette méthode.

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Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Recherche

Neurosciences

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analyse des modifications d&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l&#39;antérieur thalamique Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...