Ce travail a été financé par une subvention du NIH R15 AREA pour John Horne (NIMH; R15MH083221).

1. Embryons transgéniques <ol><li> Ici, nous utilisons une lignée transgénique du poisson-zèbre créée grâce à une méthode transposon médiée piège Enhancer 8. L&#39;insert transgénique comprend deux séquences codantes: KalTA4, une version optimisée de poisson zèbre de l&#39;activateur transcriptionnel Gal4, et la protéine fluorescente rouge, mCherry. Le rehausseur de piège méthode donne des lignes de poisson zèbre transgénique qui expriment cette cassette transgénique sous contrôle d&#39;une séquence endogène Enhancer. Ainsi, selon l&#39;identité de la séquence amplificateur spécifique, l&#39;expression des deux KalTA4 et mCherry est localisée à des régions spécifiques du cerveau en développement. Pour les E. (zic4: Gal4TA4, SAMU: mCherry) hzm5 ligne que nous utilisons ici, l&#39;expression est localisée à plusieurs endroits dans le cerveau postérieur, prosencéphale, et, d&#39;une importance particulière ici, le bulbe olfactif 8 (voir également la figure 1.) . Compte tenu de ce mode d&#39;expression, et la localisation de la cassette dans le génome, les transgènes sont prévus pour être sous le contrôle du promoteur zic4 8 (voir aussi <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimagerie / lines_distel / main</a> .). </li><li> Adulte Et (zic4: Gal4TA4, SAMU: mCherry) hzm5 poissons hétérozygotes pour l&#39;insert transgénique sont généralement accouplées avec WT (AB) de poissons, conduisant à environ 50% descendants transgéniques. (Pour un plus grand pourcentage de la progéniture transgénique, deux hétérozygotes peuvent être accouplés.) </li><li> Afin de bloquer la formation de pigments et de faciliter l&#39;imagerie de fluorescence, traiter des embryons transgéniques avec 100 uM de N-phénylthiourée (PTU) commence à 6-8 HPF. </li></ol> 2. Embryons de montage <ol><li> Au HPF 24-28, transfert d&#39;embryons à l&#39;eau oeuf sans PTU. Identifier les embryons transgéniques par l&#39;expression de mCherry utilisant un microscope à fluorescence. Retirer la membrane chorionique à partir d&#39;embryons transgéniques à l&#39;aide de pinces fines. Transfert embryons libérés de leur chorion à une boîte de Petri contenant un tampon d&#39;électroporation, plus 0,02% tricaïne [tampon d&#39;électroporation: 180 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,2] 4. Laisser 2 minutes pour l&#39;anesthésie pour prendre effet avant de passer à l&#39;étape de montage. </li><li> Préparer une solution de 0,5% de faible point de fusion d&#39;agarose en tampon plus tricaïne électroporation par micro-ondes de la solution, puis en plaçant la solution dans un incubateur 34-37 ° C. Une fois la température de la solution d&#39;agarose a équilibré, déposer une goutte de grande taille (~ 500 pi) de la solution d&#39;agarose au centre d&#39;un plat de Pétri de 60 mm. Ajouter 6-8 embryons anesthésiés à cette goutte d&#39;agarose. </li><li> En utilisant une pince fine (ou les extrémités fines de coupe embouts de pipettes microloader), la position de l&#39;embryon de telle sorte qu&#39;ils sont tous confrontés dans la même direction et alignés dans une rangée verticale. Pour solidifier l&#39;agarose, et piéger les embryons en position, placez le plat sur un grand plat de Pétri avec 2-3 mm de glace. </li><li> Une fois que l&#39;agarose est solidifié, inonder le plat avec l&#39;électroporation tampon plus tricaïne, assurant que la solution couvre complètement la baisse solidifié agarose. </li></ol> 3. Micro-injection d&#39;ADN plasmidique d&#39;expression <ol><li> Préparer l&#39;expression de la GFP plasmide en utilisant un kit d&#39;isolation Midi-ou maxi-prep plasmide (par exemple, Qiagen). Suspendre le plasmide à une concentration finale de 0,5 ug / ul dans l&#39;eau stérile, plus 0,03% du rouge de phénol. Pour l&#39;expérience bulbe olfactif ciblant décrit ici, nous utilisons un plasmide d&#39;expression avec la séquence codante du EGFP sous le contrôle de plusieurs sites de liaison de Gal4 (14 tandem séquences UAS et le promoteur du poisson basale, E1B). L&#39;utilisation de ce plasmide, seules les cellules transgénique exprimant le facteur de transcription KalTA4 sera capable d&#39;exprimer la GFP, ainsi, la médiation expression ciblée de la GFP. Remarque: nous sommes ici en utilisant le rouge de phénol pour la visualisation des injections d&#39;ADN, qui devraient être applicables pour cibler d&#39;autres régions du cerveau en développement, aussi longtemps que la région peut être consulté à partir des ventricules. Pour le ciblage des autres types de cellules qui nécessitent une visualisation fluorescente, Bodipy ou Quantam colorants Dot pourrait potentiellement être utilisé pour visualiser les injections sous un éclairage fluorescent. </li><li> Pipettes microinjection peut être fabriqué en utilisant soit un extracteur pipette horizontale ou verticale. Réglages de chaleur et tirez-la force variera selon le type d&#39;extracteur, le type de l&#39;élément chauffant, et le type de tubes capillaires en verre. L&#39;utilisation d&#39;un Sutter P-30 Extracteur vertical, utiliser un réglage de chaleur de 980 et une force de traction de 960 à produire de long, effilé, pipettes forte à paroi mince et capillaire en verre borosilicate avec des filaments [instrument Sutter # BF100-78-10]. Pipettes Microinjetion tiré avec ces paramètres sont scellés et doit être brisé de retour avant l&#39;injection. </li><li> Utiliser un embout de pipette microloader d&#39;ajouter 1-2 pl d&#39;ADN plasmidique solution à la pipette d&#39;injection. </li><li> Mount etsécuriser la pipette chargée dans le support de la pression d&#39;injection du système pipette. </li><li> Briser le dos de la pipette chargé avec une pince fine jusqu&#39;à produire des impulsions de pression version gonflée de la solution de l&#39;ADN rouge. Alternativement, des conseils peut être rompu par l&#39;arrière rapidement pénétrer un submergées, Kimwipe plié en laboratoire. Remarque: en raison des pipettes d&#39;injection sont initialement scellée et doit être manuellement cassée le dos, la taille pointe et le volume d&#39;injection sont variables. Pipettes d&#39;injection Idéal devraient exiger 3-5 impulsions d&#39;injection pour remplir complètement le ventricule du cerveau antérieur de développement des embryons HPF 24 (100 impulsions d&#39;injection ms à 40 psi). </li><li> Injecter la solution d&#39;ADN plasmidique dans les ventricules du cerveau en développement tels que l&#39;ADN est contraint à côté, et intercalés dans la région du cerveau destinée à former le bulbe olfactif. Le bulbe olfactif est dérivé de cellules de la paroi la plus antérieure du ventricule du cerveau antérieur. Ainsi, en insérant la pipette d&#39;injection dans les ventricules tels que la pipette est dirigé vers l&#39;extrémité antérieure du cerveau en développement, l&#39;injection sous pression des forces de l&#39;ADN dans et à proximité de l&#39;ampoule olfactive potentiels. Injecter de l&#39;ADN jusqu&#39;au colorant rouge est clairement visible à l&#39;extrémité antérieure du ventricule du cerveau antérieur. Parce que l&#39;ADN commence à diffuser immédiatement, diluer l&#39;ADN, il est important de procéder à l&#39;étape électroporation dès que possible après l&#39;injection (par exemple, dans les 10 sec). </li></ol> 4. L&#39;électroporation <ol><li> L&#39;électroporation est réalisée à l&#39;aide d&#39;auto-construit électrodes en électrodes de platine Herbe sous-cutané (Grass Technologie # E2). Les électrodes sont attachées à une sonde à main, et la distance finale entre les électrodes de platine devrait être de 1 mm (pour plus de détails sur la construction voir 9). Impulsions électroporation Square-ondes sont produites par reliant les électrodes à une herbe SD-9 Stimulator (Grass technologie, le modèle SD-9). </li><li> Réglez le stimulateur SD-9 pour produire unique, 5 impulsions électroporation ms à 70 volts. Position des électrodes de telle sorte que l&#39;électrode positive est placée à côté de l&#39;extrémité antérieure de l&#39;embryon, tandis que l&#39;électrode négative est postérieure à la tête de l&#39;embryon. Lancer manuellement ~ 7-8 impulsions électroporation en utilisant le sélecteur de mode unique de la SD-9 stimulateur, séparant chaque impulsion par ~ 1 sec. Tensions appropriées varieront selon l&#39;âge des embryons et la source de tension utilisée. Les plus jeunes embryons nécessitent des tensions inférieures pour éviter d&#39;endommager l&#39;embryon, alors âgées embryons nécessitent des tensions plus élevées pour initier électroporation 7. </li><li> Autoriser les embryons de récupérer au moins 10 min après l&#39;électroporation avant de les libérer de l&#39;agarose. </li><li> En utilisant des pinces fines, sans les embryons de l&#39;agarose par traçage délicatement le contour de l&#39;embryon, tout en évitant le contact réel avec les embryons eux-mêmes. </li><li> Une fois libéré, le retour des embryons d&#39;œufs à l&#39;eau (avec PTU si nécessaire). Gardez-les à 28 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient à imager des expression de la GFP. </li></ol> 5. Embryons de montage pour l&#39;imagerie <ol><li> Transfert des embryons à partir d&#39;eau d&#39;œuf, plus PTU à l&#39;eau d&#39;œuf, plus 0,02% tricaïne. Attendez quelques minutes pour l&#39;anesthésie pour prendre effet avant de passer à l&#39;étape de montage. </li><li> Préparer une solution de 0,5% de faible point de fusion d&#39;agarose dans l&#39;œuf par l&#39;eau plus tricaïne micro-ondes de la solution, puis en plaçant la solution dans un incubateur 34-37 ° C. Une fois la température de la solution d&#39;agarose a équilibré, déposer une goutte de grande taille (~ 300 pi) de la solution d&#39;agarose au centre d&#39;un plat de Pétri de 35 mm. Ajouter un embryon anesthésiés à cette goutte d&#39;agarose. </li><li> En utilisant une pince fine (ou les extrémités fines de coupe embouts de pipettes microloader), la position de l&#39;embryon tels qu&#39;ils sont debout, ce qui permet de visualiser une vue dorsale du cerveau en développement avec un microscope droit (oscilloscopes inversé, il faudra une géométrie différente d&#39;embryon, et un plat différent permettant la visualisation d&#39;en bas; voir 12). Consolidez l&#39;agarose en plaçant le plat sur un grand plat de Pétri avec 2-3 mm de glace. Re-orientation avec une pince fine sera probablement nécessaire lors de la solidification de s&#39;assurer que l&#39;embryon ne pas tomber sur le côté. </li><li> Une fois que l&#39;agarose est solidifié, des inondations le plat avec l&#39;oeuf de l&#39;eau, plus tricaïne veillant à ce que la solution couvre complètement la baisse solidifié agarose. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Bien expression de la GFP peut être observée dès 6 heures après l&#39;électroporation, nous sommes ici de montrer des images à partir d&#39;un embryon de 4 jours après l&#39;électroporation tels que la structure des neurites des cellules ciblées a suffisamment développé. Le ET (zic4: Gal4TA4, SAMU: mCherry) hzm5 transgéniques ligne de trappe Enhancer affiche une expression constitutive de mCherry (et KalTA4) dans le cerveau postérieur, le cervelet, le cerveau antérieur, et du bulbe olfactif chez les embryons de 5 jours post-fécondation (fig. 1A et 1C). Les embryons qui ont eu une expression UAS-GFP plasmide incorporé par électroporation ciblées (telles que décrites ci-dessus), expression de la GFP montrent que est restreinte aux cellules du bulbe olfactif de développement (Fig. 1B, 1D, et 1E). Seules les cellules transgénique exprimant le facteur de transcription KalTA4 sont capables d&#39;activer l&#39;expression de ce plasmide UAS-GFP. L&#39;incorporation de ce plasmide dans des embryons non transgéniques ne conduit pas à une expression de la GFP détectable. Ainsi, il est l&#39;action combinée de l&#39;électroporation ciblée de UAS-GFP et localisée expression transgénique du pilote KalTA4 qui mène à l&#39;expression exclusive de la GFP dans les cellules du bulbe olfactif de développement. Les cellules exprimant la GFP montrent typiquement projections axonales des cellules mitrales du bulbe olfactif (Fig. 1B et 1D) 10. Afin de visualiser les projections axonales, les images dans la figure 1B et 1D ont dû être exposés à des niveaux élevés de telle sorte que la région des corps cellulaires ont été bien plus exposés. Un faible niveau d&#39;exposition (Fig. 1E) montre que les corps cellulaires exprimant la GFP sont en effet localisées vers le bulbe olfactif (comparer Fig 1C et 1E;. Ligne grise marque la frontière du bulbe olfactif). <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Ciblées expression de la GFP dans le bulbe olfactif d&#39;un embryon de poisson zèbre 5 DPF. Le ET (zic4: Gal4TA4, SAMU: mCherry) hzm5 transgéniques ligne de trappe enhancer, affiche une expression constitutive de mCherry dans le cerveau postérieur, le cervelet, le cerveau antérieur, et le bulbe olfactif (A et C, la fluorescence mCherry montré en rouge). Cette expression de mCherry est médiée par transgénique Gal4-expression. Les embryons qui ont été électroporation avec un vecteur d&#39;expression UAS-GFP à 28 HPF, affichage expression de la GFP ciblée dans le bulbe olfactif à 5 jours post-fécondation (B, D et E, fluorescence de la GFP en vert. Embryon même que dans une et C). Une image plus faible exposition au fond (E) montre que l&#39;expression de GFP est limitée à corps cellulaires du bulbe olfactif. La ligne grise indique la frontière du bulbe olfactif. Fond clair (échelle de gris), la fluorescence verte (vert), et la fluorescence rouge (rouge) ont été tous prendre des images avec un microscope Olympus BX60 fluorescence.

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	<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li><li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ways+to+admire+zebrafish:+progress+in+functional+genomics+research+methodology.">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li><li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+DNA,+RNA,+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos.">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li><li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+methods+for+in+vivo,+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development.">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish:+a+method+for+time-resolved+loss-of-function.">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation.">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li><li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers:+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish.">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li><li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li><li>Distel, M., Kö, s. t. e. r., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li><li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Sch&#228;rer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous avons décrit une méthode d&#39;électroporation in vivo chez le poisson zèbre, qui utilise un enhancer trap Gal4 lignée transgénique pour cibler l&#39;expression du transgène électroporées à une population spécifique de cellules dans le bulbe olfactif de développement. Cette approche combine l&#39;excellente résolution temporelle de l&#39;électroporation in vivo 7 avec l&#39;expression spécifique au type cellulaire médiée par des lignes enhancer transgéniques piège 8. Bien qu&#39;ici nous avons décrit le ciblage du bulbe olfactif, dans l&#39;électroporation in vivo peuvent être utilisées pour cibler d&#39;autres régions du système nerveux en développement 2-7, et enhancer lignes de piégeage sont disponibles avec l&#39;expression ciblée de Gal4 dans de nombreux types différents de cellules ou des tissus spécifiques 8, 11. Bien sûr, cette technique d&#39;électroporation devrait également être adapté à d&#39;autres approches génétiques combinatioral comme le LexA ou Tet systèmes 13, 14, 15. Un avantage majeur de l&#39;électroporation est qu&#39;il n&#39;ya pas besoin de faire d&#39;autres lignées transgéniques étant donné qu&#39;un adaptée Gal4-ligne est disponible. Cela permet d&#39;économiser six mois. Dans l&#39;électroporation in vivo permet l&#39;incorporation d&#39;oligonucléotides en neurones et de leurs précurseurs à n&#39;importe quel stade précis du développement du système nerveux est d&#39;intérêt 7. Cette résolution temporelle est particulièrement avantageux pour la perte de fonction de l&#39;analyse, car elle permet de contourner les problèmes avec des gènes de ciblage qui ont des fonctions essentielles à des stades précoces de développement. La méthode que nous décrivons ici peut également être utilisé pour intégrer la perte de fonction des réactifs, y compris des oligonucléotides ARNi ou constructions et morpholino oligonucléotides anti-sens 4, 7. Plasmidique axée réactifs tels que dominante négative des plasmides d&#39;expression de protéines ou de court-épingle plasmides ARNi peut aussi être placé sous le contrôle d&#39;un Gal4 SAMU, permettant pour le type spécifique de cellules précises d&#39;expression que nous avons présentés ici pour l&#39;expression de la GFP.

Réactifs: <ul><li> Agarose, à faible point de fusion (Sigma, A9414) </li><li> Plasmidique kit Midi-ou maxi-prep (par exemple, Qiagen, # 12643] </li><li> Rouge de phénol (Sigma, P3532) </li></ul> Equipement: <ul><li> Capillaire en verre avec des filaments; ID = 0,78 mm; DO = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Herbe SD-9 Stimulator (Grass technologie, le modèle SD-9) </li><li> Électrodes de platine Herbe sous-cutanés, aiguille droite (la technologie Grass, # E2) </li><li> Micro-chargeur pipette (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipeter extracteur (par exemple, Sutter, modèle P-30) </li><li> Pipeter extracteur (par exemple, Sutter, modèle P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

Dans l&#39;électroporation in vivo est une méthode puissante pour fournir des plasmides d&#39;expression de l&#39;ADN, réactifs ARNi, et morpholino oligonucléotides anti-sens à des régions spécifiques des embryons en développement, y compris ceux de C. elegans, poussin, xénope, poisson zèbre et la souris 1. Dans le poisson zèbre, de l&#39;électroporation in vivo a été montré pour avoir une excellente résolution spatiale et temporelle pour la livraison de ces réactifs 2-7. La résolution temporelle de cette méthode est importante car elle permet l&#39;incorporation de ces réactifs à des stades spécifiques du développement. Par ailleurs, parce que l&#39;expression des vecteurs électroporées survient dans les 6 heures 7, cette méthode est plus rapide que les approches transgéniques. Alors que la résolution spatiale peut être extrêmement précis pour cibler une seule cellule 2, 6, il est souvent préférable d&#39;incorporer des réactifs dans une population de cellules spécifiques dans un tissu ou une structure. Lorsque vous ciblez plusieurs cellules, à l&#39;électroporation in vivo est efficace pour la livraison à une région spécifique de l&#39;embryon, mais en particulier dans le système nerveux en développement, il est difficile de cibler des types cellulaires spécifiques uniquement par électroporation spatialement discrets. Alternativement, enhancer trap lignées transgéniques offrent un excellent type de cellules spécifiques d&#39;expression des transgènes 8. Nous décrivons ici une approche qui combine transgéniques Gal4 basé lignes de trappe Enhancer 8 avec spatialement discrète in vivo électroporation 7, 9 à cibler spécifiquement le développement des neurones du bulbe olfactif de poisson zèbre. Le ET (zic4: Gal4TA4, SAMU: mCherry) hzm5 (anciennement GA80_9) ligne de trappe rehausseur décrit précédemment 8, affiche ciblées expression transgénique de la médiation par un zèbre mCherry optimisé Gal4 (KalTA4) activateur transcriptionnel dans plusieurs régions du cerveau en développement, y compris rhombencéphale, cervelet, le cerveau antérieur, et le bulbe olfactif. Pour cibler expression de la GFP spécifiquement vers le bulbe olfactif, un plasmide avec la séquence codante de la GFP sous le contrôle de plusieurs sites de liaison de Gal4 (SAMU) a été électroporés dans l&#39;extrémité antérieure du cerveau antérieur aux heures de 24 à 28 après la fécondation (HPF). Bien que cette méthode intègre l&#39;ADN plasmidique dans plusieurs régions du cerveau antérieur, expression de la GFP est seulement induite dans les cellules transgénique exprimant le facteur de transcription KalTA4. Ainsi, en utilisant la ligne GA080_9 transgéniques, cette approche a conduit à l&#39;expression de GFP exclusivement dans le bulbe olfactif de développement. Cellules GFP ciblée exprimer à travers cette approche a montré typiques projections axonales, comme précédemment décrit pour les cellules mitrales du bulbe olfactif 10. Cette méthode pourrait également être utilisé pour l&#39;administration ciblée d&#39;autres réactifs, y compris à court épingle expression de l&#39;ARN interférence plasmides, qui fournirait une méthode pour spatialement et temporellement discrète perte de fonction d&#39;analyse.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

La résolution temporelle et spatiale des manipulations génétiques qui détermine le spectre des phénomènes biologiques qui peuvent perturber. Ici, nous utilisons temporellement et spatialement discrets<em&gt; In vivo</emÉlectroporation&gt;, combinée avec des lignées transgéniques du poisson zèbre, pour induire l&#39;expression d&#39;un transgène GFP spécifiquement dans les neurones du bulbe olfactif de développement.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K vues.  Pace University. La résolution temporelle et spatiale des manipulations génétiques qui détermine le spectre des phénomènes biologiques qui peuvent perturber. Ici, nous utilisons temporellement et spatialement discrets In vivo, combinée avec des lignées transgéniques du poisson zèbre, pour induire l'expression d'un transgène GFP spécifiquement dans les neurones du bulbe olfactif de développement.

Vidéo: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Recherche

Neurosciences

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Activités d&#39;imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...