La localisation des protéines dans le contexte de l’ultrastructure de la cellule est un outil de recherche puissant depuis des décennies. Avec ce protocole, nous avons étendu les protéines peu abondantes ou difficiles à localiser. Nous utilisons la microscopie à fluorescence pour marquer les protéines de manière sensible et criblable et la combinons avec la microscopie électronique pour recharger l’ultrastructure de la cellule.
Ici, nous allons faire une démonstration en coupe de CLEM sur les protéines d’autophagie, mais il peut vraiment être appliqué à n’importe quelle question biologique où l’ultrastructure de la cellule est intéressante, en particulier dans l’étude d’événements rares. Tineke Veenendaal, technicienne de recherche senior de notre laboratoire, fera une démonstration de la procédure avec moi. Pour commencer, remplacez le PBS contenant 0,15 % de glycine par 1 % de gélatine dans du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius.
Grattez et transférez les cellules dans la gélatine dans un tube de microcentrifugation. Pelleter les cellules à 6 000 G pendant une minute à température ambiante dans une microcentrifugeuse, puis retirer la gélatine sans perturber la pastille. Ajouter 12 % de gélatine chauffée à 37 degrés Celsius à la pastille et remettre en suspension doucement en pipetant avec des pointes de pipette ou des pipettes de pâturage en verre préchauffées à la même température.
Incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis granulez les cellules à 6 000 g pendant une minute. Solidifiez la gélatine sur de la glace pendant 30 minutes. Pour retirer les cellules enrobées de gélatine du tube, coupez l’extrémité du tube contenant la pastille du reste du tube avec une lame de rasoir.
Coupez ensuite l’extrémité du tube avec la pastille de cellule en deux perpendiculairement à la première coupe. Placez les deux moitiés d’extrémité du tube contenant la pastille de cellule dans 2,3 molaires de saccharose et incubez pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Cela provoque le rétrécissement léger des moitiés de pastilles cellulaires et leur délogation du tube en plastique.
Retirez les moitiés de tube avec la pastille de cellules enrobée de gélatine du saccharose, puis retirez les moitiés de pastilles de cellules des moitiés de tubes en plastique avec une pince à épiler. Coupez manuellement la pastille en blocs d’une taille appropriée avec une lame de rasoir et utilisez un microscope à dissection stéréoscopique pour grossir le sujet pendant la coupe. Incubez les blocs cellulaires pendant une nuit dans du saccharose de 2,3 molaires à quatre degrés Celsius.
Placez-les sur une goupille porte-échantillon en aluminium. Laissez suffisamment de saccharose sur les bords du bloc pour qu’il forme un mince collier entre le bloc et la goupille. Congelez-le et conservez-le dans de l’azote liquide.
Coupez l’avant du bloc pour aplatir sa surface afin d’obtenir des sections d’environ 250 nanomètres d’épaisseur. Coupez ensuite les côtés du bloc en sectionnant de 50 à 100 micromètres sur le côté de la face du bloc d’échantillon avec le coin du couteau. Le découpage de quatre côtés de la face du bloc d’échantillon créera un rectangle saillant d’environ 250 par 375 micromètres.
Sectionnez un ruban à partir du rectangle saillant en veillant à ce que les sections aient une épaisseur comprise entre 70 et 90 nanomètres et aient un éclat doré argenté. Éloignez les sections du tranchant du couteau diamanté avec un cheveu sur un bâton pour créer un long ruban. Prenez le ruban en trempant la boucle de ramassage de trois millimètres dans un mélange un pour un de 2,3 molaires de saccharose et de 2 % de méthylcellulose.
Insérez la boucle dans la chambre cryogénique du microtome, et une fois que la gouttelette commence à geler, ramassez rapidement les sections en appuyant doucement la gouttelette contre elles. Retirez la boucle de la chambre cryogénique. Attendez que la gouttelette soit complètement décongelée et pressez-la sur une grille préparée.
Placez les grilles avec des sections sur environ un millilitre de PBS dans un petit plat ou une assiette à plusieurs puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Traitez les grilles sur environ 75 microlitres de gouttelettes sur Parafilm et commencez par des lavages à la glycine PBS à température ambiante. Incuber les grilles avec un tampon bloquant composé de 0,1 % d’albumine C sérique bovine et de 0,5 % de gélatine de peau de poisson dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante comme étape de blocage.
Diluer les anticorps primaires dans le tampon bloquant dans le PBS et incuber les grilles sur des gouttelettes d’environ 10 microlitres de cette solution pendant une heure à température ambiante. Laver les grilles dans de l’albumine sérique bovine à 0,1 % dans du PBS cinq fois à température ambiante. Diluer les anticorps secondaires et le DAPI dans le tampon bloquant du PBS.
Ensuite, incubez les grilles sur des gouttelettes d’environ 10 microlitres de cette solution pendant 30 minutes ou plus à température ambiante avant de laver les grilles dans du PBS cinq fois comme indiqué précédemment. Pour monter les échantillons pour la microscopie optique, immergez les grilles dans du glycérol à 50 % dans de l’eau distillée deux fois pendant cinq minutes à température ambiante. Placez une grille par lamelle entre une lame de verre et une lamelle de recouvrement à 50 % de glycérol, en veillant à ce que les sections soient face à la lamelle.
Pour la microscopie optique, prenez une lame de verre avec les grilles prises en sandwich dans un microscope à grand champ avec une platine automatisée. Sélectionnez un objectif à huile à fort grossissement et créez un ensemble de mosaïques d’image du ruban de sections. Ensuite, pour le démontage et la microscopie électronique ou le contraste EM, ajoutez 10 microlitres d’eau distillée sur le côté du sandwich de glissement du couvercle de lame en verre et attendez que l’action capillaire remplisse l’interface sandwich du couvercle en verre.
Retirez délicatement la lamelle sans mélanger l’huile d’immersion dans le glycérol. Récupérez les grilles avec une pince à épiler et plongez-les dans de l’eau distillée trois fois à température ambiante pour éliminer les 50 % de glycérol. Séchez soigneusement l’arrière de la grille avec un papier de soie non pelucheux et placez la section de la grille côté vers le bas sur des gouttelettes d’eau distillée.
Pour colorer les coupes de contraste en microscopie électronique, incubez-les avec de l’acétate d’uranyle pendant cinq minutes à température ambiante. Refroidir la solution d’acétate d’uranyle méthylcellulose en plaçant les gouttelettes sur Parafilm sur une plaque métallique sur de la glace. Lavez ensuite les grilles avec cette solution glacée deux fois et incubez-les dans la solution pendant 10 minutes.
Bouclez les grilles en insérant une boucle de séchage de la grille dans la gouttelette d’acétate d’uranyle méthylcellulose sous chaque grille et en la soulevant doucement jusqu’à ce que la grille soit retirée de la gouttelette. Pour éponger l’excès de solution, touchez la boucle à un angle d’environ 60 degrés sur le papier filtre non pelucheux et faites-la glisser lentement le long du papier jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de solution absorbée. Placez la boucle avec la grille dans une grille appropriée et laissez-la sécher à température ambiante pendant plus de 10 minutes.
Utilisez la vue d’ensemble obtenue par microscopie optique pour localiser une région d’intérêt pour l’imagerie dans le microscope électronique à transmission ou MET, et annotez le retour sur investissement sur l’ensemble de données de microscopie optique. Une fois qu’une région est sélectionnée, obtenez une tuile d’image réglée à un grossissement de 20 000x à 50 000x dans le MET. Reconstruisez le jeu de tuiles d’image dans un logiciel de post-traitement.
Effectuer la corrélation basée sur le signal DAPI et les contours de fluorescence et nucléaires en microscopie électronique. Déplacez les images pour les superposer avec précision et effectuez la corrélation manuelle avec précision. Les cellules HEPG2 dérivées de l’hépatoblastome ont été affamées pendant deux heures dans l’EBSS avant d’être fixées avec du paraldéhyde à 4 % pendant deux heures.
L’imagerie IF de LC3 et LAMP1 sur des coupes révèle relativement peu de ponctuations de LC3 et peu de colocalisation avec LAMP1. L’information moléculaire de l’IF a été liée à l’information ultrastructurale obtenue en microscopie électronique en superposant les deux modalités d’imagerie basées sur le DAPI et les contours nucléaires. La corrélation des organites positifs de la LC3 à l’ultrastructure EM a révélé que les différents puncta représentaient des stades distincts de l’autophagie.
L’ultrastructure des différents compartiments marqués LC3, illustrée par la première boîte, est illustrée ici. Les images de microscopie électronique lumière corrélative sont montrées à gauche, et les images de microscopie électronique pseudo-colorées sont montrées à droite. Les membranes autophagosomiques internes et externes sont indiquées par des pointes de flèches blanches et noires.
Il est intéressant de noter que l’EM a identifié des taches fluorescentes relativement faibles comme des autolysosomes LC3 positifs, qui sont caractérisés par un contenu dense et des vésicules intraluminales. Cela révèle une visibilité minimale de la LC3 dans l’IF des coupes cryogéniques ultra-minces, suggérant une LC3 détectable dans les autolysosomes à l’état stationnaire malgré l’environnement de dégradation. Cependant, les puncta positifs de la LC3 représentent principalement des autophagosomes, peu d’entre eux représentant des autolysosomes.
Pour les chercheurs qui souhaitent effectuer un marquage immunogold au lieu d’un CLEM sur section, les protocoles et les conseils décrits ici sont également pleinement applicables au marquage immunogold. Nous avons d’abord appliqué CLEM en coupe à des protéines régulatrices endosomiques de faible abondance et montré pour la première fois, leur localisation ultrastructurale endogène.
