Les auteurs tiennent à remercier Sally Roberts (Université de Birmingham, Birmingham au Royaume-Uni) pour le don sorte de l&#39;anticorps E1E4. Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Institut national du cancer (4R00CA137160-03).

1. Préparation pour les cultures organotypiques Raft <ol><li> Les grilles métalliques radeau bien d&#39;abord être traités avec de l&#39;acide sulfurique chromique pour enlever tout résidu qui pourrait interférer avec le processus de différenciation. Immerger les grilles métalliques dans un récipient en verre contenant de l&#39;acide sulfurique pendant une heure, puis de façon continue rincés pendant la nuit avec l&#39;eau du robinet. Après la nuit de rinçage, les grilles de radeau doit être rincé pendant 3-5 heures dans de l&#39;eau bidistillée. </li><li> Pour fournir un soutien pour les radeaux, pliez trois côtés du radeau d&#39;environ 0,5 cm à égale distance les uns des autres. Les grilles métalliques doit alors être autoclavés. </li><li> Préparer le tampon de reconstitution 10X en ajoutant 2,2 g NaHCO3 et 4,8 g Hepes. Dissoudre dans 100 ml de 0,05 M NaOH. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C. </li><li> Préparer le 10X DMEM sans bicarbonate de sodium. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C. </li><li> Préparer le facteur de croissance épidermique de la souris: Dissoudre 100 mg de l&#39;EGF et 10 mg de BSA chaque dans 10 ml désionisée ddH 2 0. Combinez FEM et de la BSA et ajouter à 80 ml ​​d&#39;eau désionisée ddH 2 0 pour un volume total de 100 ml. Filtrez-stériliser, partie aliquote (5 ml) et un magasin dans le -20 ° C. Pour chaque litre de milieu E, ajoutez 5 ml de 1 mg / ml EGF (concentration finale de 5 ng / ml). </li></ol> 2. Préparation de gels de collagène <ol><li> Un gel de collagène est nécessaire pour chaque radeau. Le collagène doit être maintenu sur de la glace pour l&#39;empêcher de se solidifier. Chaque gel de collagène nécessite 3 ml de mélange de collagène consistant en: 2,4 ml de collagène de type à froid de queue de rat I (concentration finale 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampon de reconstitution 10X, 10X 0,3 ml DMEM et1-2 X 10 6 souris 3T3 J2 fibroblastes comme cellules nourricières. Pour les solutions à forte concentration de collagène de queue de rat, diluer dans 0,02 M d&#39;acide acétique pour obtenir la concentration de travail correcte. </li><li> Déterminer le nombre de gels de collagène (radeaux), vous devrez, puis calculer un mélange maître pour la quantité de collagène, reconstit 10Xtampon ution, 10X DMEM et J2 fibroblastes nécessaire. Inclure suffisamment chaque Master Mix pour 3-4 gels supplémentaires dus à la viscosité du collagène. </li><li> Pour préparer le gel de collagène, trypsiniser les J2 fibroblastes et neutraliser avec le milieu. Mélanger tous les fibroblastes et les placer dans un flacon de 50 ml conique. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Encore une fois, le 1-2x10 6 fibroblastes sont requis par un gel de collagène et donc par radeau. Isoler les cellules à faible vitesse. </li><li> Aspirer le milieu de la fibroblastes et une pastille de remettre en suspension dans la quantité appropriée de tampon de reconstitution 10X, 10X DMEM et du collagène pour le nombre de radeaux calculés. Ajouter le collagène dernière pour empêcher le gel de se solidifier trop rapidement. Une fois que le collagène est ajouté, mélanger rapidement, mais avec précaution pour prévenir l&#39;introduction de bulles dans le gel. Le gel doit être d&#39;une couleur orange rougeâtre, indiquant le bon pH. Si le mélange de gel est trop jaune, ajouter quelques gouttes de 1N, stérilisée par filtrationNaOH et mélanger doucement afin d&#39;obtenir la bonne couleur. </li><li> Ajouter 3 ml du collagène: mélange des fibroblastes dans les puits d&#39;une boîte de culture à 6 puits. Le mélange de collagène devrait être introduit à la pipette lentement sur le côté de chaque puits pour éviter de générer des bulles. Placer la plaque à 37 ° C incubateur de culture de tissu et laisser se solidifier pendant 30 minutes. </li><li> Après 30 minutes, ajouter 3 ml de milieu E avec de l&#39;EGF au sommet du gel de collagène solidifié et retourner la plaque dans l&#39;incubateur. Les gels doivent être conservés à 37 ° C pendant au moins un jour, mais utilisé dans les quatre jours. Résultats optimaux après deux jours d&#39;incubation. </li></ol> 3. Préparer les kératinocytes différenciation <ol><li> Kératinocytes passage bas devrait être augmenté pour atteindre environ 70% de confluence. Chaque radeau nécessite 1-2x10 6 kératinocytes. Trypsiniser les kératinocytes et neutraliser avec le milieu E avec de l&#39;EGF. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Isoler les cellules à faible SPEéd. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu E avec de l&#39;EGF pour chaque culture radeau calculée. </li><li> Aspirer le milieu des gels de collagène en inclinant la plaque à 6 puits. Ajouter 2 ml de milieu E frais avec de l&#39;EGF à chaque gel. Pour chaque gel, ajouter prudemment de 1 ml de kératinocytes remis en suspension les 2 ml de milieu E déjà présent dans le puits. Délicatement la pipette les kératinocytes, plus les 2 ml des médias, puis laisser tomber goutte à goutte de retour sur le gel. Agitant ou en faisant tourner la plaque peut entraîner la distribution inégale des cellules d&#39;un côté du gel de collagène. Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Les cellules doivent être cultivées à confluence, remplaçant le milieu E par jour. Les cellules sont confluentes lorsque les changements de milieu au jaune un jour après un changement dans le milieu. Cela prend généralement 2-4 jours. Si le milieu n&#39;a pas changé par quatre jours, passez à l&#39;étape suivante. </li></ol> 4. Rendre les cultures Raft <ol><li> Utilisez une pince stérile pour placer une grille métallique stérile radeau, se pencha vers le bas côtés, Dans une boîte de 10 cm. Aspirer le milieu de gel de collagène. Pour desserrer le gel sur les côtés du puits, rendez-vous autour du périmètre du gel avec une spatule stérile en utilisant un mouvement ascendant et descendant. Pour retirer le gel de collagène, inclinez légèrement la plaque et soulever en plaçant un sous spatule. Fixer le gel de collagène sur la grille métallique sans générer des bulles entre la grille et le gel. Deux gels peuvent être placés sur chaque grille. </li><li> Afin de rendre l&#39;interface air-liquide, ajouter du milieu E sans EGF lentement vers le fond du plat de sorte que la grille de radeau est en contact avec les médias, mais le gel de collagène n&#39;est pas. Les supports ne devrait pas venir au travers des trous dans la grille. Ajouter le support lentement pour éviter de générer des bulles sous la grille, car cela permettra d&#39;éviter la différenciation uniforme. Incuber les radeaux à 37 ° C et changer le milieu tous les deux jours maintien de l&#39;interface air-liquide. Récolter les radeaux après 14 jours. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Lorsque te protocole est effectuée correctement avec des kératinocytes primaires, cette procédure se traduira par un épithélium bien différencié où les différentes couches de la peau sont évidentes. Ce sera atteint grâce à l&#39;examen histologique par coloration des sections de cultures radeau pour l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E), comme indiqué dans la figure 1B. Coloration H &amp; E est également utile d&#39;examiner la morphologie de radeaux et de l&#39;effet des virus ou des composés antiviraux sur la capacité des cellules de stratifier et de se différencier. Par exemple, radeaux fabriqués à partir de HPV-immortalisées primaires de kératinocytes humains (HFK-31) sont sensiblement plus épais par rapport aux radeaux fabriqués à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK), reflétant une augmentation du taux de prolifération et la capacité des protéines HPV à maintenir les cellules de différenciation actifs dans le cycle cellulaire (figure 1B) 10. Il en résulte en matière de rétention des noyaux à travers l&#39;épithélium, alors que les kératinocytes normaux sortent du cycle cellulaire lors de la différenciation, ce qui entraîne une rupture de laenveloppe nucléaire. Examiner de plus près la différenciation, immunohistochimie peut être effectuée à examiner marqueurs de différenciation spécifiques, notamment cytokératines, ainsi que involucrine, et filaggrine. Cytokératines différentes sont exprimés à des stades spécifiques de la différenciation 7. Comme le montre la figure 2, la cytokératine 10 (K10) n&#39;est pas exprimé dans la couche basale, et ne se trouve dans les couches suprabasales qui se composent de cellules progressivement de différenciation. En radeaux HPV positives, l&#39;expression de K10 est retardée par rapport à celle des kératinocytes normaux, ce qui reflète l&#39;influence des protéines contre le VPH sur la différenciation des kératinocytes. L&#39;immunohistochimie peut également être utilisée pour examiner le profil d&#39;expression des gènes viraux. La figure 3 est une coloration représentant examinant l&#39;expression de la protéine E1 HPV ^ E4, qui est une protéine dont la fin de l&#39;expression est restreinte aux couches supérieures de l&#39;épithélium. Comme prévu, aucune coloration n&#39;est observée dans les cultures de radeau de la normale HUMAn kératinocytes de prépuce. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> Figure 1. Un Plan) de la méthode pour la préparation de cultures organotypiques radeau à partir de kératinocytes primaires ou de lignées de cellules épithéliales. B) coloration hématoxyline et éosine des cultures organotypiques radeau générés à partir de kératinocytes de prépuce humain maintenir de façon stable contre le VPH-31 (HFK-31) épisomes, ou à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK). Les couches individuelles sont identifiées épithéliales, ainsi que le bouchon de collagène. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> Figure 2. Cytokératine 10 (K10) l&#39;expression est restreinte aux couches suprabasales de l&#39;épithélium. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales en utilisant un anticorps à K10. L&#39;ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l&#39;aide confocal microscopie à fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l&#39;épithélium. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> Figure 3. Le VPH E1 ^ E4 protéines est produite à la fin de la phase productive du cycle de vie virale. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales à l&#39;aide d&#39;anticorps E1E4. L&#39;ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l&#39;aide microscopie confocale de fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l&#39;épithélium.

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	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous décrivons ici une méthode qui peut être utilisé pour étudier la différenciation épithéliale en général, mais peut également être facilement adapté pour étudier la pathogenèse virale, ainsi que l&#39;efficacité de traitements potentiels. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales, soit que le site primaire de l&#39;infection, comme dans le cas du VPH, ou à un certain moment dans le cycle de vie du virus, comme avec des herpèsvirus. Bien que de plus en plus les cultures organotypiques rade...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le collagène de type queue de rat 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM sans NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> Grilles métalliques en acier </td><td> Williams et Mettle Co. </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E milieu 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

Le développement de cultures organotypiques radeau épithéliales a fourni aux chercheurs un système efficace dans le système in vitro qui reproduit fidèlement la différenciation épithéliale récapitule. Il ya beaucoup d&#39;utilisations de ce système. Par exemple, la capacité de croître des cultures tridimensionnelles radeau organotypiques de kératinocytes a été un jalon important dans l&#39;étude du virus du papillome humain (VPH) 1. Le cycle de vie du VPH est étroitement liée à la différenciation de l&#39;épithélium pavimenteux 2. Organotypiques cultures radeau épithéliales comme démontré ici de reproduire le cycle de vie complet du virus du papillome, y compris la production de virus 3,4,5. En outre, ces cultures présentent des lésions dysplasiques radeau similaires à ceux observés lors de l&#39;infection in vivo par le VPH. Par conséquent ce système peut également être utilisée pour étudier les cancers des cellules épithéliales, ainsi que l&#39;effet des drogues sur la différenciation des cellules épithéliales en général. Initialement développé par Asselineau et Prunieras <sjusqu&#39;à&gt; 6 et modifié par Kopan et al. 7, le système épithélial organotypique culture radeau a mûri pour devenir un général, modèle de culture relativement facile, ce qui implique la croissance des cellules sur le collagène se branche maintenue à l&#39;interface air-liquide (figure 1A). Au cours de 10-14 jours, les cellules de stratifier et de différencier, formant un épithélium sur toute son épaisseur qui produit la différenciation spécifiques cytokératines. Radeaux récoltées peuvent être examinés histologiquement, ainsi que par des techniques classiques moléculaires et biochimiques. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour la génération des cultures primaires de radeau des kératinocytes humains. La même technique peut être utilisée avec des lignées de cellules épithéliales, et peut facilement être adapté pour une utilisation avec du tissu épithélial à partir de biopsies normales ou malades 8. De nombreux virus cibles soit l&#39;épithélium cutané ou muqueux, dans le cadre de leur cycle de vie réplicative. Au cours des dernières années, la possibilité d&#39;utiliser le culte radeau organotypiqueres comme une méthode d&#39;étude des interactions virus-hôte cellulaire a été montré pour plusieurs virus de l&#39;herpès, ainsi que les adénovirus, parvovirus, poxvirus et 9. Cultures organotypiques radeau peut donc être adaptée afin d&#39;examiner la pathogenèse virale, et sont les seuls moyens pour tester de nouveaux agents antiviraux pour les virus qui ne sont pas cultivables dans des lignées cellulaires permanentes.

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Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Un<em&gt; In vitro</em&gt; La méthode pour imiter<em&gt; In vivo</em&gt; Différenciation épithéliale est décrite. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales dans le cadre de leur cycle de vie virale, et cette méthode fournit un moyen d&#39;examiner le virus: les interactions hôte-qui ressemble plus à ce qui se produit<em&gt; In vivo</em&gt;. Cette technique peut être utilisée avec des kératinocytes primaires, des lignées cellulaires établies, ainsi que la normale ou pathologique des tissus de biopsie.

Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K vues.  University of North Carolina-Chapel Hill. Un In vitro La méthode pour imiter In vivo Différenciation épithéliale est décrite. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales dans le cadre de leur cycle de vie virale, et cette méthode fournit un moyen d'examiner le virus: les interactions hôte-qui ressemble plus à ce qui se produit In vivo. Cette technique peut être utilisée avec des kératinocytes primaires, des lignées cellulaires établies, ainsi ...

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Recherche

Immunologie et infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Génération de cellules T régulatrices induites de l&#39;homme primaires cellules T naïves et mémoire

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

L&#39;induction d&#39;une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...