SS est soutenu en partie par le HHMI Med en Grad Subvention de formation par l&#39;intermédiaire du Programme TBMM. MHW est soutenu en partie par une bourse de développement de carrière du ministère des Anciens combattants et le soutien généreux de M. et Mme Harold M. Selzman. Ce travail a également été soutenu en partie par le NIH lymphome SPORE P50CA126752 subvention et le NIH R01 DK093660.

Jour 0 1. Isolation des PBMC à partir de sang humain <ol><li> Recueillir 20 ml de sang humain frais en utilisant ponction veineuse dans des tubes Vacutainer Na-héparine. </li><li> Mélanger le sang et avancée RPMI 1640 en 1:1 (v / v). </li><li> Ajouter 20 ml Lymphoprep moyen d&#39;un tube à centrifuger de 50 ml (25 ° C). Lentement couche de 25-30 ml de sang RPMI 1640 mélange sur le dessus du Lymphoprep. </li><li> Centrifuger à 400 xg pendant 40 min sans freins. </li><li> Recueillir les deux couches distinctes et floue à l&#39;aide d&#39;une pipette jetable dans 10 ml de PBS 1x (25 ° C) et porter le volume à 50 ml avec du PBS 1x. </li><li> Centrifuger à 450 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter 20 ml de RPMI 1640 avancée. </li><li> Centrifuger à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant. Ajouter 10 ml de milieu complet de lymphocytes T additionné de 5 ng / ml rhIL-15 préchauffé à 37 ° C. </li><li> Compter le nombre de cellules et la plaque en 24 manteau de culture de tissus ainsied plaque à 2 x 10 6 cellules / puits dans les médias complets de lymphocytes T supplémenté avec 5 ng / ml rhIL-15 Ajouter de l&#39;eau stérile pour puits environnants. Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 1 2. Les plaques de revêtement avec un anticorps anti-CD28 et anti-CD3 pour stimuler les lymphocytes T <ol><li> Diluer anticorps anti-CD28 et anti-CD3 dans de l&#39;eau stérile à une concentration de 1 pg / ml. </li><li> Ajouter 500 ul de solution d&#39;anticorps à chaque 5 puits marqués d&#39;une culture de tissu non enduit plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter de l&#39;eau stérile pour se reposer des puits. Enveloppez la plaque dans une pellicule rétractable et placer au réfrigérateur 4 ° C. </li></ol> 3. Nucléofection de cellules T non stimulés <ol><li> Préchauffer médias lymphocytes T à 37 ° C et un supplément de 5 ng / ml de rhIL-15. Préparer une solution complète Nucleofector en ajoutant 500 ul de supplément Nucleofector 1 à 2,25 ml de solution Nucleofector. </li><li> Aliquot 5 ug chacun des transposon (Zeo-pT-CMV-eGFP) et la transposase (pCMV-piggyBac) dans un tube de 1,5 ml. Remarque: il peut être nécessaire d&#39;optimiser la transposase et la quantité d&#39;ADN du transposon pour la livraison génique optimale et de minimiser toxicité cellulaire. Les plasmides peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande. </li><li> PBMC récolte de la plaque 24 tissus et la culture dans un tube de 50 ml. Compter le nombre de cellules. Enregistrer 2 x 10 6 cellules pour une utilisation en tant que commande au cours de la cytométrie en flux. </li><li> Ajouter 7-10 x 10 6 cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger à 400 xg, 5 min, aspirer le surnageant et le doigt du coup de la pastille. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules T nucléofection solution complète à la cellule desserré granulés. </li><li> Ajouter le mélange de solution de cellules dans le tube contenant les plasmides. </li><li> Ajouter le mélange de solution de cellule de plasmide au fond de la cuvette nucléofection. Veillez à ne pas introduire de bulles. </li><li> Nucleofect les cellules en utilisant programme U-014 (cellules T non stimulés, l&#39;homme, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Immédiatement ajouter 500 ul de médias préchauffé avec rhIL-15 à la cuvette. Transférer les cellules à un puits d&#39;une plaque à 24 puits avec 1,5 ml de milieu préchauffé à rhIL15. </li><li> Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 2 4. La stimulation non spécifique des cellules T <ol><li> Récolte des cellules et de déterminer le nombre de cellules. Annuler 0,5 x 10 6 cellules par cytométrie en flux pour déterminer la fréquence de cellules GFP-positives. Utilisez les PBMC non transfectées comme témoins. </li><li> Aspirer la solution CD3/28 anticorps de la plaque de culture de tissu non enduit et rincer chaque puits avec les médias de lymphocytes T. </li><li> Remettre en suspension les cellules nucleofected à 0,5 x 10 6 cellules par ml dans les médias complets CTLadditionné de 5 ng / ml de rhIL-15. Ajouter 2,0 ml de chacune des cellules nucleofected à 4 puits de la plaque de culture de tissus non. Ajouter 0,5 x 10 6 cellules non nucleofected au 5 bien. </li><li> Incuber pendant 3 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 5 <ol><li> Récolter les cellules T stimulées à partir de la plaque non revêtue de la culture tissulaire. </li><li> Compter et Réensemencement les cellules dans un 24 plaque de culture tissulaire pour bien les enrober à 0,7 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de lymphocytes T avec 5 ng / ml d&#39;IL-15. </li></ol> Jour 7 7. L&#39;analyse de l&#39;expression des gènes <ol><li> Cellules de récolte et se colorent avec anti-humain CD8 (peut également utiliser l&#39;anti-CD3 et anti-CD4) et d&#39;analyser avec la cytométrie en flux pour l&#39;expression de la GFP%. </li></ol> Jour 8 (Facultatif) 8. L&#39;expansion des cellules T <ol><li> Le jour 8 après transfection, les cellules T peuvent être réensemencées en TDes cellules support avec l&#39;IL-15 à une densité de 0,7 x 10 6 cellules par puits d&#39;une nouvelle expansion 16. </li></ol>

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	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le procédé décrit ici permet de modifier transgène stable de lymphocytes T humains primaires. Nous avons déjà testé l&#39;utilisation du système piggyBac transposon pour modifier des cellules T pour exprimer un gène rapporteur (pour plus de 4 semaines), un gène suicide non immunogène, un récepteur d&#39;antigène chimérique pour l&#39;immunothérapie adoptive (pour plus de 100 jours), et à concevoir une résistance aux médicaments immunosuppresseurs 7,13-15. Non-virale modification des...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Avancée RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone sérum de veau fœtal </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-je Supplément </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 humaine protéine recombinante </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Endofree Plasmid Maxi </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Cellules T humaines Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> Plate 24 Tissue Culture Eh bien traitée </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Culture tissulaire Eh bien non traitée Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Complète des cellules T médias composition 1x avancée RPMI 1640 5% inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l&#39;origine dérivé de la 1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l&#39;enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d&#39;intérêt entre répétées inversées d&#39;éléments qui sont nécessaires à l&#39;activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un &quot;couper et coller&quot; mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d&#39;intérêt. PiggyBac a démontré l&#39;efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de 1,2 insecte, de mammifère 3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires 7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l&#39;efficacité de transfert de gènes 9,10. Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l&#39;immunothérapie adoptive du cancer 11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le 12. Nous avons déjà évalué l&#39;utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide 7. L&#39;analyse des sites d&#39;intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes 13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d&#39;antigène chimérique dirigé contre l&#39;antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales in vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique 14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée 15. Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l&#39;isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l&#39;activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l&#39;analyse et la quantification de l&#39;expression génique par cytométrie en flux. PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d&#39;intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux 14, nous avons également utilisé piggyBac d&#39;ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d&#39;éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire 7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) 15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.

Un schéma montrant les étapes de la modification génétique de lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est illustré à la figure 1. Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès des auteurs. Un schemtic démontrant les étapes génétiquement modifiés lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est showin dans la figure 2. Il est nécessaire d&#39;activer les cellules T dans le but de les amener à se diviser, se développer et se propager dans la cultu...

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l&#39;aide de la<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon exposition expression du transgène système stable.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

17.1K vues.  Baylor College of Medicine. Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale PiggyBac Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l'aide de la PiggyBac Transposon exposition expression du transgène système stable.