Ce travail a été financé par NIH R01 AI073783 à K. Teter. Nous remercions le Dr Shane Massey pour l&#39;aide au développement de l&#39;fractionnement subcellulaire protocole et Helen Burress pour la lecture critique du manuscrit.

1. Préparation de la digitonine <ol><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 100% à un microtube et le placer dans un bloc thermique fixée à 80 ° C pendant 10 min. </li><li> Dissoudre 2,5 mg de digitonine dans 250 uL d&#39;éthanol chauffé pour produire une solution stock de 1% de digitonine. </li><li> Pour générer une solution de travail de digitonine 0,04%, ajouter 40 ul de la solution stock à 960 uL digitonine de HCN tampon (50 mM Hepes pH 7,5, NaCl 150 mM, 2 mM de CaCl2, 10 mM de N-éthylmaléimide, et un inhibiteur de protéase cocktail). </li></ol> 2. L&#39;intoxication cellulaire et de perméabilisation Notre test de translocation peut être appliquée à une gamme de toxines et de lignées cellulaires. Ci-dessous, nous fournissons un protocole détaillé pour la détection de la toxine cholérique (CT). Un aperçu de la procédure est prévue dans la figure 1. <ol><li> Des cellules HeLa sont ensemencées en plaques 6 puits contenant 1 ml de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et les antibiotiques antimycosiquespour atteindre 1x10 6 cellules / puits, après une nuit d&#39;incubation à 37 ° C. Pour générer assez de toxine cytosolique pour la détection reproductible, trois puits sont nécessaires pour chaque condition. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, de remplacer le milieu de culture avec 1 ml de DMEM contenant 100 ng / mL de GM1. Cela augmente le nombre de sites de liaison pour la TDM, comme le récepteur GM1 de la CT sera s&#39;intercaler dans la membrane plasmique des cellules exposées à une solution de GM1. </li><li> Après une incubation de 1 h à 37 ° C, éliminer le milieu GM1 contenant et laver les cellules deux fois avec du DMEM. Ensuite, placer les cellules à 4 ° C pendant 30 min dans 1 ml de DMEM contenant 1 ug / ml de CT. </li><li> Retirez le support contenant la toxine, se laver les cellules deux fois avec du DMEM et incuber les cellules dans 1 ml de DMEM à 37 ° C pour l&#39;intervalle de temps souhaité (s). </li><li> A la fin de chaque période de chasse, laver les cellules avec du PBS et incuber chaque puits avec 250 uL d&#39;EDTA 0,5 mM dans du PBS. Laissez reposer pendant 10 cellules<html> min à température ambiante, puis les retirer de la plaque de 6 puits par trituration vigoureuse avec un P1000 Pipetman. Après un puits de cellules ont été recueillies, le combiner avec le deuxième puis troisième puits de la même condition. Grattoirs cellulaire peut également être utilisé pour collecter les cellules. </li><li> Placer la suspension cellulaire combinée des trois puits de reproduire (750 uL du volume total) dans un microtube unique, et la faire tourner dans une microcentrifugeuse de table pendant 5 min à 5000 x g. Les culots cellulaires de taille à peu près équivalente devrait être obtenue pour toutes les conditions. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 100 ul de la solution de 0,04% de travail de digitonine. Placer la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 min. </li><li> Spin cellules perméabilisées digitonine à 16.000 xg pendant 10 min dans une microcentrifugeuse de table. Transférer la fraction cytosolique contenant le surnageant dans un microtube frais, et de conserver la fraction organite contenant de granules. </li></ol>titre &quot;&gt; 3. Préparation des échantillons <ol><li> Cytosol fractions contenant le surnageant sont dilués dans un tampon de HCN à un volume final de 1 ml. Volumes d&#39;échantillon d&#39;au moins 1 ml sont nécessaires pour assurer de l&#39;air est purgé de la boucle de 500 échantillons uL avant l&#39;injection. </li><li> Organite fractions contenant granulés sont remises en suspension dans 1 ml de tampon contenant 1% de HCN Triton X-100. Ajout de détergent est nécessaire pour libérer la piscine membrane encastrée de la toxine. </li><li> Normes toxines à des concentrations de 100, 10, 1 et 0,1 ng / mL sont préparées dans un tampon de HCN. </li><li> Séries parallèles des fractions cytosoliques et des organites sont préparés pour une expérience de contrôle pour confirmer la fidélité de la procédure de fractionnement. Les fractions générée comme décrit dans la section 2 sont remis en suspension dans 20 pl de tampon d&#39;échantillon 4x (fraction cytosolique) ou 120 pi de tampon d&#39;échantillon 1x (fraction organite). Volumes équivalents de chaque fraction sont résolus par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide et sondé bl&#39;analyse par Western blot y démontrer le partitionnement d&#39;une protéine cytosolique dans la fraction surnageante et solubles, des protéines résidentes ER dans la fraction granulés 16-19. </li></ol> 4. Préparation des lames de SPR <ol><li> La SPR Reichert SR7000 Réfractomètre est utilisé pour des expériences de SPR. </li><li> Régler une lame de verre plaqué or avec une monocouche auto-assemblée dans l&#39;instrument de SPR. Pour activer le capteur de glissière, perfuser de 1:1 (v: v) solution de 0,4 M d&#39;EDC et 0,1 M NHS sur la lame pendant 10 min à un débit de 41 ul / min. Tous les perfusions ultérieures utiliseront le même débit. </li><li> Pour enlever la SEE: tampon d&#39;activation du NHS, laver la plaque pendant 5 min avec du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (PBST). La plaque contient maintenant longes amide réactive due à désoperculer par la SEE: solution de NHS. </li><li> Perfuser un anticorps anti-CTA sur la lame du capteur activé à une dilution de 1:20,000 dans 20 mM acétate de sodium (pH 5,5) pendant 15 min. Une chute initiale de la réfraction dansdex unité (RIU) seront vus en raison du changement de pH. Cette étape sera suivie par une augmentation de la RIU que l&#39;anticorps est capturé par les longes amide-réactive sur la lame du capteur. </li><li> Retirer les anticorps non liés de la diapositive du capteur avec un lavage PBST 5 minutes. Le signal produit par RIU l&#39;anticorps capturée plateau et se stabiliser, fournissant un signal de base de nouvelles. </li><li> Perfuser 1 M éthanolamine (pH 8,5) sur la lame du capteur pendant 5 min. Cette casquettes et inactive les attaches non liée à gauche sur la diapositive capteur. </li></ol> 5. L&#39;analyse d&#39;échantillons de SPR <ol><li> Pour établir une lecture de base, PBST perfuser sur le capteur revêtues d&#39;anticorps pendant 5 min. </li><li> Perfuser un échantillon expérimental ou standard toxine sur le capteur pour 300 sec. Retirez le ligand de la mémoire tampon et de PBST perfuser sur le capteur pour un autre sec 200. </li><li> Après chaque perfusion, la toxine liée est retiré de la sonde par un lavage avec PBST 100 sec à pH 5,0. Ce sera de retour le signalà sa lecture initiale de référence, permettant ainsi à un autre échantillon d&#39;être traitées sur le même capteur. </li><li> Avant de charger un nouvel échantillon, pousser une petite quantité d&#39;air à travers la boucle d&#39;échantillonnage d&#39;expulser tout liquide résiduel provenant de l&#39;échantillon précédent. En utilisant la procédure décrite dans 5.2 à 5.4, nous avons exécuté jusqu&#39;à 12 échantillons sur une lame sans perte substantielle du signal de référence. </li><li> L&#39;analyse des données est réalisée avec le laveur deux logiciels, et le logiciel Igor est utilisé pour la préparation des figures. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La toxine de pertussis (PT) est une toxine AB qui se déplace de la surface des cellules à l&#39;urgence avant son d&#39;une chaîne (PTS1) pénètre dans le cytosol 3, 12. Comme le montre la figure 2, notre test de translocation SPR basé pouvait détecter PTS1 dans le cytosol des cellules CHO ébriété. Aucun signal n&#39;a été généré à partir du cytosol des cellules unintoxicated, qui a confirmé l&#39;anticorps anti-PTS1 n&#39;a pas de réaction croisée avec une composante du cytosol hôte. L&#39;fraction cytosolique des cellules d&#39;ébriété dans la présence de bréfeldine A (BfA) a également échoué à produire un signal positif. BfA empêche le transport de toxines au site de translocation ER 6-8, 12, 20-25 et, par conséquent, une livraison de la chaîne vers le cytosol. A la fin de chaque cycle, la toxine liée est dépouillé de la diapositive du capteur. Cette échantillons a permis plusieurs à être projeté sur une lame de capteur unique et ainsi fourni une comparaison directe entre les résultats obtenus avec différentes conditions expérimentales. CT est un autre type AB, ER-translocation de toxine 4. Dans la figure 3A, CTA1 a été détecté dans la fraction cytosolique de cellules HeLa CT-traitée. Cette souligner que notre méthodologie fonctionne avec plusieurs types de cellules et peut être appliquée à toute toxine pour laquelle un anticorps anti-A anticorps à chaîne est disponible. Aucun signal n&#39;a été détecté lors de la fraction cytosolique de CT-cellules traitées a été perfusé au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTB (figure 3B), démontrant ainsi que le CTA1sous-unité, mais pas la cellule contraignant CTB pentamère entre dans le cytosol. La figure 3C montre le signal de la fraction organelle est hors échelle en comparaison à la faiblesse du signal de la fraction cytosolique. Cela était conforme à l&#39;inefficacité connue de CT transport vers le site de translocation ER 6, 7, ce qui limite la quantité de toxine qui peut atteindre le cytosol. Par ailleurs, la fraction organite contient holotoxine CT ainsi que ER-localisées CTA1, de sorte que le signal résultant de SPR pour la fraction organite est gonflé par la masse supplémentaire de l&#39;holotoxine pentamère CTB-associés. Ainsi, il n&#39;est pas pratique pour tracer des données à partir des fractions organite et cytosoliques sur la sensorgramme mêmes. Notre test peut surveiller l&#39;accumulation dépendant du temps de translocation, la toxine cytosolique (figure 4). Les cellules ont été exposées à CT à 4 ° C, une température qui permet liaison de la toxine à la membrane plasmique, mais empêche l&#39;internalisation de la toxine associée aux cellules. Après le remoVal de toxine non consolidées, les cellules ont été réchauffée à 37 ° C. Les deux toxines de transport à l&#39;urgence et une translocation de la chaîne vers le cytosol peut se produire à cette température. Aucune toxine n&#39;a été détectée dans le cytosol 15 minutes après l&#39;échauffement à 37 ° C. Cela reflète le décalage requis pour le trafic holotoxine (i) à l&#39;ER, (ii) Un / dissociation sous-unité B de l&#39;ER, et (iii) Une chaîne de l&#39;exportation vers le cytosol. Une piscine de toxine mineure cytosolique a été détectée après 30 minutes à 37 ° C, et les quantités progressivement plus de toxine cytosolique ont été détectés après le 45 et 60 intervalles minute chase. Même des niveaux plus de toxine cytosolique ont été détectés après un intervalle de 5 heures 17 chase, démontrant ainsi une constante, à long terme la livraison de toxine associée aux cellules vers le cytosol hôte. Notre test peut également détecter l&#39;inhibition de la translocation de la toxine dans le cytosol (Fig. 5). Les cellules traitées avec du diméthylsulfoxyde 10% (DMSO), un chaperon chimique qui empêche le Disord thermiquesEring de l&#39;isolement CTA1 sous-unité (T. Banerjee et K. Teter, observations non publiées), présentaient de faibles niveaux de CTA1 cytosolique en comparaison aux cellules témoins non traitées. Déroulement de la toxine Une chaîne est une condition préalable pour la translocation vers le cytosol 16-18, afin de stabiliser le DMSO-induite de CTA1 conséquence empêché son mouvement à partir du RE vers le cytosol. L&#39;association constante de vitesse (k a) calculée à partir des expériences SPR est directement proportionnelle à la concentration de ligand dans le tampon de perfusion 14, 15, 26. Ainsi, il est possible de déterminer la concentration cytosolique de la toxine à partir d&#39;un graphe qui trace les valeurs de k une toxine comme les normes en fonction de la concentration des toxines. Cette procédure a été utilisée pour quantifier le bloc DMSO induit la translocation de la toxine présenté dans la Figure 5: la courbe standard générée à partir des concentrations connues de toxine a été utilisée pour calculer un cytosolique CTA1 CONCENTRATion de 0,3 ng / ml pour les cellules non traitées et 0,1 ng / mL pour le DMSO cellules traitées (Fig. 6). L&#39;inhibition de la CTA1 déroulement par le DMSO ainsi généré une réduction de 3 fois dans la translocation ER-à-cytosol des CTA1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Figure 1. Aperçu Protocole. (A) Les cellules sont incubées avec de la toxine AB à 4 ° C, une température qui permet liaison de la toxine à la surface cellulaire, mais empêche l&#39;endocytose toxine. Les sous-unités A et B de la toxine sont représentés par des cercles rouges et bleus, respectivement. (B) de toxine non lié est éliminé du milieu, et les cellules sont chauffées à 37 ° C afin de promouvoir endocytose et le transport rétrograde de l&#39;holotoxine à l&#39;urgence. Holotoxine de dissociation se produit dans l&#39;urgence, qui permet l&#39;isolement Une chaîne pour entrer dans le cytosol en passant à travers un canal protéique conducteur (s) dans la membrane du RE. (C) Les cellules sont traitées avec de la digitonine, afin de perméabiliser de façon sélective le plasmamembrane. (D) La centrifugation est utilisée pour les cellules dans une partition séparée des fractions cytosoliques et des organites. Le cytosol est évincé de la cellule par les pores digitonine-générée et est situé dans le surnageant. Le intacte, liée à la membrane des organites se trouvent dans la fraction de granules. (E) Pour détecter la piscine translocation de la toxine Une chaîne dans le cytosol hôte, la fraction surnageante est perfusé au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-A anticorps à chaîne. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Figure 2. Détection de PTS1 translocation dans le cytosol hôte. Les cellules CHO ont été étiquetés par impulsions à 4 ° C pendant 30 min avec 1 ug / ml de PT. Les cellules ont ensuite été pourchassé pendant 3 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 5 ug BfA / mL (+ BfA intoxiqué). Perméabilisation de la membrane plasmique à la digitonine a été utilisé pour des extraits de cellules séparées partition en organite et cytosoliques fractions. Un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-PTS1 a été utilisé pour détecter la piscine cytosolique de PTS1 partir de cellules non traitées ou traitées BfA. PTS1 normes ont été perfusés sur le capteur comme contrôles positifs, tandis que la fraction cytosolique des cellules unintoxicated a été perfusé sur la lame du capteur comme un contrôle négatif. A la fin de chaque cycle, l&#39;échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Figure 3. Détection de CTA1 translocation dans le cytosol hôte. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pendant 2 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 5 ug BfA / mL (+ BfA intoxiqué). Perméabilisation de la membrane plasmique à la digitonine a été utilisé pour des extraits de cellules séparées partition en organite et les fractions cytosoliques. (A) Les fractions cytosoliques ont été perfusés au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTA. Connuquantités de LTC ont été utilisés comme contrôles positifs, tandis que le cytosol des cellules unintoxicated a été utilisé comme contrôle négatif. (B) la fraction cytosolique des cellules ébriété en l&#39;absence de BFA a été perfusé au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTB. A purifié CTB pentamère a été perfusé sur la lame comme un contrôle positif. (C) La fraction organite a été solubilisé avec 1% de Triton X-100 avant la perfusion sur un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTA. Pour fins de comparaison, la fraction cytosolique (1 ml de volume final) de l&#39;extrait même cellule et un standard du CTA ont également été perfusé sur le capteur. Pour tous les panneaux, l&#39;échantillon a été dépouillé liée à partir du capteur à la fin de chaque course. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Figure 4. Cinétique de CTA1 entrée dans le cytosol. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pour 15, 30, 45 ou 60 min à 37 ° C de la toxine sans Medium. Pour détecter la piscine translocation de la toxine, fractions cytosoliques des cellules perméabilisées digitonine ont été perfusés au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTA. Normes du CTA ont été perfusés sur le capteur ainsi. A la fin de chaque cycle, l&#39;échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Figure 5. Inhibition de CTA1 translocation par le DMSO. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pendant 2 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 10% de DMSO (+ DMSO intoxiqué). Pour détecter la piscine translocation de la toxine, fractions cytosoliques des cellules perméabilisées digitonine ont été perfusés au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;un anticorps anti-CTA. Normes du CTA (100, 10, 1 et 0,1 ng / mL) ont été perfusés sur le capteur comme contrôles positifs, seul le 1 et 0,1 ng / mL normes sont indiquées à des fins de mise à l&#39;échelle. Le cytosol à partir unintoxicatecellules D a été utilisé comme contrôle négatif. A la fin de chaque cycle, l&#39;échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Figure 6. Calcul de CTA1 cytosolique. K une des valeurs pour les normes du CTA de la figure 5 ont été tracées en fonction de la concentration de toxine. La courbe ainsi obtenue standard a été utilisé pour déterminer, sur la base des valeurs de k une des échantillons expérimentaux de la figure 5, la concentration de CTA1 cytosolique dans les cellules non traitées et traitées DMSO. Normes toxines sont présentés comme des cercles remplis; le cytosol non traité est présenté comme une place ouverte, et le cytosol DMSO-traité est présenté comme un cercle ouvert. Les moyennes ± gammes de deux expériences indépendantes sont présentés.

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Comparaison à la méthodologie existante Notre test de translocation SPR à base représente une méthode rapide, sensible, et quantitatives pour détecter administration de la toxine dans le cytosol hôte. La technique ne nécessite pas de radiomarquage ou d&#39;autres modifications à la toxine, et il peut être appliqué à toute toxine pour lequel un anti-toxine A anticorps à chaîne est disponible. Les méthodes existantes pour surveiller le passage de toxines dans le cytosol se fondent...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Digitonine </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Liste </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-hydroxysuccinimide) </td><td> Pierce </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> L&#39;éthanolamine </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA d&#39;anticorps </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> D&#39;anticorps anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 d&#39;anticorps </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Réfractomètre </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR capteur de diapositives </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Pompe à seringue </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Toxines AB se composent d&#39;un sous-unité enzymatique Un cellulaire et d&#39;une sous-contraignante B 1. Ces toxines sont sécrétées dans le milieu extracellulaire, mais ils agissent sur des cibles dans le cytosol des eucaryotes. Certains voyages AB toxines par les transporteurs vésiculaires de la surface cellulaire vers le réticulum endoplasmique (RE) avant d&#39;entrer dans le cytosol 2-4. Dans l&#39;urgence, le dissocie catalytique Une chaîne du reste de la toxine et se déplace à travers un canal protéique-conducteurs pour atteindre sa cible cytosolique 5. La translocation, cytosolique Une chaîne est difficile à détecter car le trafic de toxine à l&#39;ER est un processus extrêmement inefficace: la toxine la plus intériorisé est acheminé vers les lysosomes de dégradation, alors seulement une petite fraction de la surface de la toxine liée atteint l&#39;appareil de Golgi et ER 6 -12. Pour surveiller la translocation de la toxine de ER dans le cytosol des cellules en culture, nous avons combiné un protocole avec le fractionnement subcellulaire highlméthode de détection sensible y résonance plasmonique de surface (SPR) 13-15. La membrane plasmique des cellules traitées toxine est sélectivement perméabilisées à la digitonine, permettant la collecte d&#39;une fraction cytosolique qui est ensuite perfusé au cours d&#39;un capteur SPR recouvert d&#39;une anti-toxine un anticorps à chaîne. Le capteur revêtues d&#39;anticorps peut capturer et détecter pg / mL quantités de toxines cytosolique. Avec ce protocole, il est possible de suivre la cinétique d&#39;entrée de toxine dans le cytosol et de caractériser des effets inhibiteurs sur l&#39;événement de translocation. La concentration de la toxine cytosolique peut également être calculé à partir d&#39;une courbe standard générée avec des quantités connues d&#39;une chaîne de normes qui ont été perfusés sur le capteur. Notre méthode représente un système rapide de détection sensible et quantitative qui ne nécessite pas de radiomarquage ou d&#39;autres modifications à la toxine cible.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l&#39;entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.

La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K vues.  University of Central Florida. Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l'entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

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Immunologie et infection

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Détection de l&#39;aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un Densovirus dans le coton Heliothis

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...