이 작품은 K. Teter에 NIH R01 부여 AI073783에 의해 투자되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기위한 subcellular 분별화 프로토콜과 헬렌 Burress의 개발에 도움 박사 쉐인 메시 감사합니다.

1. digitonin의 준비 <ol><li> microcentrifuge 튜브에 100 % 에탄올 500 μL를 추가하고 80 ° C 10 분에 대해 설정된 열 블록에 넣습니다. </li><li> digitonin의 1 % 주식 솔루션을 생산하는 온수 에탄올 250 μL에 dig​​itonin 2.5 MG를 해산. </li><li> 0.04 %의 digitonin의 작업 솔루션을 생성하려면, HCN 버퍼 960 μL (50 MM의 Hepes 산도 7.5, 150 MM NaCl, 2 MM CaCl 2, 10 MM N - ethylmaleimide, 그리고 테아제 억제제에 digitonin 주식 솔루션 40 μL를 추가 칵테일). </li></ol> 2. 휴대폰 중독과 permeabilization 우리 translocation 분석은 독소와 세포 라인의 범위에 적용할 수 있습니다. 아래, 우리는 콜레라 독소 (중부 표준시)의 검출에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 절차의 개요는 그림 1에서 제공됩니다. <ol><li> HELA 세포는 10 % 보충 한 ML DMEM을 포함하는 6 자 접시에 씨앗을 품고 아르 태아 소 혈청과 항생제 - antimycotic1x10 6 세포를 달성하기 위해 / 잘 후에 37 하룻밤 인큐베이션 ° C. 재현성 감지하기에 충분한 cytosolic 독소를 생성하려면, 세중의 위 각 조건이 필요합니다. </li><li> 하룻밤 부화 다음, 1 ML DMEM이 ganglioside GM1의 100 NG / ML을 포함하는으로 배지를 교체하십시오. 중부 표준시의 GM1 수용체가 GM1의 솔루션에 노출된 세포의 플라즈마 막에 사이에 끼어 넣다하므로 이것은, CT에 대한 구속력이있는 사이트의 수를 증가합니다. </li><li> 37 1 시간 보육 후에 ° C, GM1 - 포함된 매체를 제거하고 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻으십시오. 그런 다음, 4 셀 배치 ° C 일 ML DMEM 1 μg / 중부 표준시의 ML을 포함에서 30 분. </li><li> 37, 독소 함유 매체를 제거 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻어, 1 ML DMEM으로 세포를 품어 ° 원하는 시간 간격 (S)에 대한 C. </li><li> 각 추적 기간의 끝에, PBS로 세포를 씻어하고 PBS에 0.​​5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 250 μL와 각각 잘 품어. 세포가 10 앉아서 보자<html> 다음 상온에서 분 및 P1000 pipetman로 활발한 분쇄하여 6 잘 플레이트에서 제거합니다. 세포 중 하나를 잘 수집되고 나면 잘 같은 상태에서 두 번째 그리고 셋째로 결합되어 있습니다. 세포기구 또한 세포를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 단일 microcentrifuge 튜브의 세 가지 복제 우물 (750 μL 총 볼륨)에서 결합된 세포 현탁액을 놓고 5000 X G.에서 5 분 탁상 microcentrifuge에 스핀 대략 동등한 크기의 셀 알약은 모든 조건을 획득해야합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 digitonin의 0.04 % 작업 솔루션을 100 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 10 분 얼음에 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 탁상 microcentrifuge 10 분 16,000 XG에서 digitonin - permeabilized 세포를 돌린다. 새로운 microcentrifuge 튜브에 cytosol 함유 뜨는 분수를 전송하고, organelle 함유 펠렛 분율을 유지합니다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 샘플 준비 <ol><li> Cytosol 함유 뜨는 분수는 1 ML의 최종 볼륨 HCN 버퍼에 희석 수 있습니다. 최소한 1 ML의 샘플 볼륨은 공기가 주입되기 전에 500 μL 시료 루프에서 정화되도록하기 위해 필요합니다. </li><li> Organelle 함유 펠렛의 분수는 1퍼센트 트리톤 X - 100을 포함하는 HCN 버퍼 1 ML에 resuspended 있습니다. 세제의 추가는 독소의 멤브레인 - 쌌다는 수영장을 공개하는 것이 필요합니다. </li><li> 100 농도, 10, 1, 0.1 NG / ML에서 독소 기준은 HCN 버퍼에 준비가되어 있습니다. </li><li> cytosolic 및 organelle 분수의 양대 세트 분획화 절차의 충실도를 확인하기 위해 제어 실험을 준비하고 있습니다. 분수는 4X 샘플 버퍼 (cytosolic 분율) 또는 1X 샘플 버퍼 (organelle 분율) 120 μL의 20 μL에 resuspended 아르 제 2에 설명되어 생성. 각 분획의 상응하는 볼륨은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동에 의해 해결하고 B를 탐색할 아르Y 서양 얼룩 분석 뜨는 분수에서 cytosolic 단백질의 파티션 및 펠렛 분율 16-19에 용해, 주민 ER 단백질을 설명합니다. </li></ol> 4. SPR 슬라이드 준비 <ol><li> Reichert SR7000 SPR 굴절계는 SPR 실험에 사용됩니다. </li><li> SPR의 악기에 자기 조립 monolayer와 금도금 유리 슬라이드를 설정합니다. 41 μL / 분의 유량 10 분 슬라이드를 통해 0.4 M 및 0.1 M EDC의 보건국의 솔루션 : 센서 슬라이드를 활성화하려면, 1:1 (V V)를 perfuse. 이후의 모든 perfusions 같은 유량을 사용합니다. </li><li> EDC 제거하려면 다음 보건국 활성화 버퍼를, PBS는 0.05 %에게 십대 초반 20 (PBST)을 포함하는 5 분 접시를 씻으십시오. 보건국 솔루션 : 접시는 현재 EDC로 uncapping에 의한 반응 아미드 tethers가 포함되어 있습니다. </li><li> 15 분 20 MM의 아세트산 나트륨 (산도 5.5)에서 1:20,000의 희석에 활성화된 센서 슬라이드를 통해 안티 CTA 항체를 Perfuse. 의 굴절률에 초기 드롭덱스 단위 (RIU)은 산도의 변화로 인해 보여줄 것입니다. 항체가 센서 슬라이드에있는 아미드 반응 tethers 점령므로 이것은 RIU 증가가 뒤따라갈 겁니다. </li><li> 5 분 PBST 세척과 센서 슬라이드에서 언바운드 항체를 제거합니다. 캡처한 항체에 의해 만들어진 RIU 신호 고원과 안정화는 새로운 기준 신호를 제공합니다. </li><li> 5 분 센서 슬라이드를 통해 Perfuse 1 M ethanolamine (산도 8.5). 이 모자와 센서 슬라이드에 남아있는 언바운드 tethers을 inactivates. </li></ol> 5. 샘플 SPR 분석 <ol><li> 5 분 항체 - 코팅 센서를 통해 기본적인 읽기, perfuse의 PBST을 설정합니다. </li><li> 300 초에 대한 센서를 통해 실험 샘플이나 독소 표준을 Perfuse. 또 200 초에 대한 센서를 통해 버퍼와 perfuse의 PBST에서 리간드를 제거합니다. </li><li> 각 재관류 후, 행 독소는 산도 5.0에서 PBST로 100 초 세척하여 센서에서 제거됩니다. 이것은 신호를 반환합니다따라서 다른 샘플이 동일한 센서 처리 수 있도록. 초기 기준 읽기에 </li><li> 새로운 샘플을로드하기 전에, 이전 예제에서 잔여 액을 추방하기 위해 샘플 루프를 통해 공기의 작은 금액을 밀어. 5.2-5.4에서 설명한 절차를 사용하여, 우리는 기준 신호의 실질적 손실없이 슬라이드 12 샘플까지 실행합니다. </li><li> 데이터 분석은 스크러버이 소프트웨어와 함께 수행하고, 이고르 소프트웨어는 그림 준비에 사용됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 백일해 독소 (PT)는 체인 (PTS1)는 cytosol 세, 12를 입력하기 전에 응급실로 세포 표면에서 이동 AB 독소입니다. 그림 2에 표시된 우리 SPR 기반 translocation 분석은 음주 CHO 세포의 cytosol에 PTS1를 검색할 수 있습니다. 신호는 안티 - PTS1 항체는 호스트 cytosol의 구성 요소와 교차 반응하지 않았 확인 unintoxicated 세포의 cytosol에서 생성되지 않았습니다.brefeldin (BfA)의 존재에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 또한 긍정적인 신호를 생성하지 못했습니다. BfA는 ER의 translocation 사이트 6-8, 12, 20-25, 그리고 따라서, cytosol에 체인 전송 독소 전송을 방지합니다. 각 실행의 끝에 행 독소는 센서 슬라이드에서 제거됩니다. 이 허용되는 복수의 샘플은 하나의 센서 슬라이드 상영함으로써 다양한 실험 조건에 얻은 결과 사이에 직접적인 비교를 제공합니다. CT도 다른 AB 형, ER - translocating 독소 4. 그림 3A에서 CTA1는 CT - 치료 HELA 세포에서 cytosolic 분수에서 발견되었다. 이것은 우리의 방법론은 여러 세포 유형에서 작동하고 방지 체인 항체를 사용할 수있는 모든 독소에 적용할 수 있습니다 강조했다. CT - 처리된 세포에서 cytosolic 분수가 안티 CTB 항체 (그림 3B)로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused 때 아무 신호 따라서 그런 CTA1에게 보여주는 감지되지 않았습니다subunit는하지만 셀 바인딩 CTB pentamer는 cytosol를 입력하지 않습니다. 그림 3C는 organelle 분획에서 신호가 cytosolic 분수에서 약한 신호에 비해 오프 규모입니다 보여줍니다. 이것은 차례로 cytosol에 도달할 수있는 독소의 양을 제한 ER translocation 사이트 6, 7에 중부 표준시 교통의 알려진 비효율과 일치했다. 또한, organelle 분율은 중부 표준시의 holotoxin뿐만 아니라 ER -화된 CTA1가 있으므로, organelle 분율에 대한 결과 SPR 신호 holotoxin - 관련 CTB pentamer의 추가 질량에 의해 증가됩니다 포함되어 있습니다. 그러므로, 그것은 같은 sensorgram에 organelle과 cytosolic 분수에서 데이터를 계획하기 위해 실용적되지 않습니다. 우리의 분석은 translocated, cytosolic 독소 (그림 4)의 시간 의존 축적을 모니터링할 수 있습니다. 전지는 4 중부 표준시에 노출되었습니다 ° C, 플라즈마 막에 독소가 구속 수 있지만 휴대 관련된 독소의 내면화를 방지 온도를. remo 후언바운드 독소의 발은, 세포는 37 ° C.에 따뜻하게했다 응급실에 독소 운송 및 cytosol에 체인 translocation 모두는이 온도에서 발생할 수 있습니다. 아무도 독소는 온난 후 37 ° C.에 cytosol 15 분만에 감지되지 않았습니다 이것은 응급실에은 (i) holotoxin 거래에 필요한 지연 시간을 반영하며 응급실에서 (2) A / B의 subunit의 분리 및 cytosol에 (3) 체인 내보낼 수 있습니다. cytosolic 독소의 작은 수영장이 C는 37 ° 30 분 후에 발견되었고, cytosolic 독소 점차적으로 큰 수량은 45 60분 체이스 간격 이후에 발견되었다. cytosolic 독소의 더욱 수준 때문에 호스트 cytosol로 휴대 관련된 독소의 지속, 장기적인 납품을 보여주는, 5시간 추격 간격 17 이후에 발견되었다. 우리의 분석은 또한 cytosol에 독소의 translocation의 억제 (그림 5) 검색할 수 있습니다. 세포 10 % 디메틸 sulfoxide (DMSO), 열 disord을 방지하는 화학 보호자로 치료격리 CTA1 subunit (T. Banerjee와 K. Teter, 관찰되지 않은)의 ering, 치료 제어 세포에 비해 cytosolic CTA1의 낮은 수준을 전시. 독소의 전개 체인은 cytosol 16-18로 translocation을위한 필수 조건이다, CTA1의 DMSO 유발 안정화가 따라 응급실에서 cytosol하기 위해 운동을 방해하므로. SPR 실험에서 계산 협회 속도 상수 (K)는 재관류 버퍼 14, 15, 26 리간드의 농도에 직접 비례합니다. 그러므로, 그것은 그래프에서 cytosolic 독소의 농도를 결정하기 위해 가능한 것을 플롯 K 독소 농도의 함수로 독소 표준 값. 이 절차는 그림 5에 제시 독소의 translocation의 DMSO 유도 블록을 계량하는 데 사용되었습니다 독소 알려진 농도에서 생성된 표준 곡선은 cytosolic CTA1 concentrat를 계산하는 데 사용되었다의 이온 0.3 치료 세포와 DMSO - 대우 전지 0.1 NG / ML (그림 6) NG / ML. DMSO에 의해 전개 CTA1의 억제 따라서 CTA1의 ER - 투 - cytosol translocation의 3 배 감소 생성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요. (A) 세포 4 AB 독소와 incubated 아르 ° C, 세포 표면에 독소가 구속 수 있지만 독소의 endocytosis을 방지하는 온도. 독소 A와 B subunits는 각각 빨간색과 파란색 동그라미로 표시됩니다. (B) 언바운드 독소가 미디어에서 제거하고, 세포 ° C 응급실에 holotoxin의 endocytosis와 역행 수송을 촉진하기 위해 37 기까지입니다. Holotoxin 분리는 절연 체인 ER 막에 단백질 실시 채널 (S)를 통해 전달하여 cytosol를 입력할 수 응급실에서 발생합니다. (C) 세포 선택적으로 플라즈마를 permeabilize하기 위해 digitonin로 취급됩니다막. (D) 원심 분리는 별도의 cytosolic 및 organelle 분수로 파티션 세포를하는 데 사용됩니다. cytosol은 digitonin 생성 모공을 통해 세포 밖으로 압착하여 뜨는에 위치하고 있습니다. 그대로, 멤브레인 바인딩된 organelles은 펠렛 분획에서 발견됩니다. (E) 호스트 cytosol에서 독소 체인의 translocated 수영장를 검색하려면, 뜨는 분수는 안티 - 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> 그림 2. 호스트 cytosol에 PTS1 translocation의 감지. CHO 세포되었습니다 펄스 분류 4 ° 1 μg / 태평양 표준시의 ML 30 분 C. 세포는 다음 37 3 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic fracti로 파티션 세포 추출물에 사용된기능. 안티 PTS1 항체로 코팅된 SPR 센서는 치료 또는 BfA - 처리 세포에서 PTS1의 cytosolic 수영장를 검색하는 데 사용되었다. unintoxicated 세포에서 cytosolic 분율이 대조군으로 센서 슬라이드를 통해 perfused 동안 PTS1 기준은, 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> 그림 3. 호스트 cytosol에 CTA1 translocation의 감지. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic 분수로 파티션 세포 추출물로 사용되었습니다. (A) cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. 알려진unintoxicated 세포의 cytosol가 대조군으로 사용하는 동안 CTA의 수량은 긍정적인 컨트롤로 사용되었습니다. (B) BfA의 부재에서 술에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTB 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused되었습니다. 정화 CTB pentamer은 긍정적인 제어로 슬라이드를 통해 perfused되었습니다. (C) organelle 분율이 함께 solubilized했습니다 1% 트리톤 X - 100 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 재관류 전에. 비교 목적을 위해, 동일한 세포 추출물 및 CTA 표준에서 cytosolic 분수 (1 ML 최종 볼륨)도 센서를 통해 perfused했다. 모든 패널, 행 예제는 각 실행의 끝에 센서에서 뺏겼어요. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> 그림 4. cytosol에 CTA1 항목의 속도론. HELA 세포 펄스 표시 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML과 C 15, 30, 45 추격, 또는 37 60 분되었습니다 ° C 독소 무료 mediu 4시M. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 표준뿐만 아니라 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> 그림 5. DMSO에 의해 CTA1 translocation의 억제. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 또는 10% DMSO를 (+ DMSO 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 기준은 (100, 10, 1, 0.1 NG / ML) 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused 있었다, 오직 1과 0.1 NG / ML 표준 확장 목적으로 표시됩니다. unintoxicate에서 cytosolD 세포는 대조군으로 사용되었다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> 그림 6. cytosolic CTA1의 계산. 그림 5에서 CTA 표준 값 K 독소 농도의 함수로 꾸몄다되었습니다. 그 결과 표준 곡선은 K에 따라 결정하는 데 사용되었다 그림 5, 치료 및 DMSO - 처리 세포에서 cytosolic CTA1의 농도에서 실험 샘플의 값. 치료 cytosol은 열린 광장으로 제시되며, 독소 기준은 채워진 동그라미로 표시되며 DMSO - 대우 cytosol은 오픈 원으로 제공됩니다. 평균 ± 범위 두 개의 독립적인 실험이 표시됩니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기존의 방법론 비교 우리 SPR 기반 translocation 분석은 호스트 cytosol에 독소 전송을 감지하는 빠른, 민감한, 그리고 양적 방법을 나타냅니다. 기술 radiolabeling이나 독소에 다른 수정을 요구하지 않으며, 그것은 체인 항체를 사용할 수있는 해독제에 대한 독소를 적용할 수 있습니다. cytosol에 독소 통로를 모니터링하는 기존 방법은 별도의 cytosol과 막 분수 11, 23, 27, 28으로 파티션 세포 추출물에 subcellular 분획화 프로토콜에 의존. 이러한 방법은 독소의 cytosolic 수영장를 검색 서양 얼룩이나 radiolabels를 사용합니다. 이전 접근 방식은 최상의 반 양적이고 상대적으로 가난한 감성을 앓고. 도 radiolabeling 프로토콜 때문에 cytosol에 도달 독소의 낮은 수준으로, 결과를 생성하는 주가 소요될 수 있습니다. radiolabeled 독소와 정량 분석​​은 상대적인 비율을 결정할 수 있지만cytosol를 입력 셀 관련된 독소, 이러한 방식은 직접 cytosolic 독소 분자의 정확한 숫자를 확인할 수 없습니다. radiolabeled 독소의 검출에 SPR 독소 검출의 감도를 비교하는 것은 cytosolic 독소의 수량에 의해 SPR 아니라 radiolabeling에 의해 계산할 수로, 따라서 문제가있다. 기타 translocation의 assays는 업스트림 독소 거래 단계를 무시하고 플라스미드 기반의 표현 시스템 또는 체외 전사 / 번역 시스템을 29-38을 사용 응급실에 체인 직접 독소를 제공합니다. 어느 방법, 아미노 터미널 신호 시퀀스는 응급실 루멘에 공동 translational 수입에 대한 체인을 대상으로하고 있습니다. 응급실에서 합성 체인의 수출은 다음 subcellular 분류, 차등 원심 분리, translocated 독소의 cytosol, proteasomal 저하의 독소 활동 및 / 또는 cytosolic 특정 독소의 수정에 의해 감지됩니다. 이러한 접근의 하위 집합오직 translocation 이벤트에 cus는 체외의 reconstitution 실험에 사용하고, 탐지 및 공동 연구를위한 immunoprecipitation 독소의 높은 수준을 생산할 수 있습니다. 그러나, 방법론은 세포 표면에서 cytosol에 독소 전달의 속도론이나 효율성을 확인할 수 없습니다. 그것은 translocated 체인 holotoxin - 전달 체인과 같은 conformational 상태로 응급실을 입력하지 않는 수도 있습니다. 호스트 독소의 상호 작용의 다른 측면에는 A / B 해리 이벤트로이 절차에서 누락되었습니다. 따라서, 응급실에서 직접 합성하는 체인과 함께 모니터링 translocation에 모두 강점과 약점이 있습니다. 독소의 translocation는 종종 중독의 assays를 통해 감지됩니다. exogenously 적용 독소에 의해 생성되는 세포 독성이나 cytopathic 효과는 체인는 cytosolic 목표를 도달 독소를 보여줍니다. 분명히, 이것은 독소를 모니터링 translocation의 간접적인 측정이다오히려 cytosolic 독소의 물리적 존재보다 cytosol에 ctivity. 따라서 기술 둘 다 cytosolic 독소의 수준을 계량 수 없습니다 않고 직접 translocated 독소의 변경 처리를 감지합니다. 세포 반응하거나 독소 활동은 포화 세포 반응을 생산을 이끌어내는 이러한 cytosolic 독소의 한계 농도에 사용할 수있는 필요로 cytosolic 독소 수준 및 독소의 활동 사이에 직접적인 상관 관계가 존재하지 않는 시나리오도 있습니다. 하지만, 중독증의 assays 직접 translocation 이벤트를 문서 assays하기위한 기능적 상관 관계를 제공할 수 있습니다. 우리는 이전에 체인 translocation의 억제 세포 중독증 17-19의 억제에 해당 입증이 전략을 사용했습니다. 요약에서 cytosol에 독소 전달을 감지하기 위해 여러 가지 방법이 있습니다. 우리 SPR 기반의 접근 방식은 빠른, 민감한, 그리고 양적 결과를 제공하는 장점이 있습니다. DATA는 강력한 결론을 생성하기 위해 위에서 언급한 기존의 전략 중 하나를 사용하여 실험을 보충하실 수 있습니다. 미래의 애플 리케이션 cytosolic 독소의 탐지 및 부량위한 레이블이없는 방법은 중독의 세포 생물학에 관한 많은 훌륭한 질문을 해결하기 위해 유연성과 수사관을 제공합니다. 예를 들어, cytosol에 도달 표면 행 독소의 비율을 계산하여 cytosol에 체인 전달의 효율성을 설정할 수 있습니다. 그것은 cytosolic 독소의 총 양을 계량하는 것도 가능하며, 확장하여 셀 당 cytosolic 독소 분자의 수를. 그것은 cytosolic 디프테리아 독소 중 하나 분자가 완전한 세포 독성 / cytopathic 효과 39 이끌어내는 충분한는 것을 믿는 것입니다,이 모델은 지금 우리의 translocation 분석 및 상호 중독증의 assays를 사용하는 다른 독소와 함께 테스트할 수 있습니다. 따라서, 우리 SPR 기반 분석 슈uld는 생산 중독증에 필요한 몇 분자 cytosolic 독소 확인할 수 있습니다. 우리의 기술은 cytosolic 독소의 지속성을 추적할 수 있습니다. translocated 체인의 상당한 저하는 cytosol에 체인 액세스가 초기 독소 노출 후 제한 있었다면 반대 수 중독증의 영향을 암시하는 것이, 시간이 경과함에 따라 cytosolic 농도를 제한하고 가능한 줄이는 것입니다. 또한, 음주 세포에서 세포외 매체와 멤브레인 펠렛은 분비 독소 또는 각각 endomembrane 시스템에 거주하는 독소의 수량을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 세포외, endomembrane -화된, 그리고 cytosolic 독소의 비교 연구는 중독의 세포 생물학 다른 ER - translocating 독소에 대한 차이가 어떻게 검토하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 분석도 translocation 이벤트 19 필요한 특정 세포 독소 요소를 해부하다하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 추적하기 위해 방법론을 적응 수 있어야한다이러한 탄저균 치명적인 요소와 디프테리아 독소와 같은 다른 AB 독소의 endosome - 투 - cytosol translocation. 마지막으로, 호스트 cytosol에 바이러스 항목을 가능성이 비슷한 실험 절차 모니터 수 있습니다. 제한 응급실에 독소 거래를 억제 조건도 cytosol에 독소 배달을 방지할 수 있습니다. 이것은 BfA - 처리 세포에서 cytosolic 독소의 부재 (Figs. 2, 3A)에 의해 입증되었습니다. 독소의 translocation의 잠재적인 블록을 검사하기 위해이 방법을 사용하는 경우 따라서 추가 제어 실험이 필요합니다. 일부 AB 독소 들어, tethers의 holotoxin하는 촉매 subunit는 ER 6, 40-43에서 발생되는 이황화 결합의 감소. 체인의 산화 환원 상태 따라 ER 16, 18 독소 전송의 척도로 사용할 수 있습니다. N - 연결된 글리코 실화에 대한 합의 시퀀스, 응급실에서 시작되는 수정을 포함하는 재조합 독소도있다ER 12, 23, 44-46로 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다. 마지막으로 응급실 루멘에 체인이 translocation 이벤트에 대한 억제 효과를 확인할 수있는 독소의 공동 translational 삽입과 관련된 이상 대체 프로토콜을 논의했다. 예를 들어, SPR 기반 translocation 분석은 응급실 루멘 19 직접 CTA1을 표현 플라스미드 기반 시스템을 확인했습니다 CTA1 translocation에서 Hsp90의 기능 역할을 보여주었다. ER - translocating 독소의 체인은 translocated 독소가 ubiquitin 의존 proteasomal 열화 47-50를 피할 수있는 강력한 아르기닌 오버 - 리신 아미노산 편견을 나타냅니다. 그러나 cytosolic 독소의 저하는 여전히 비교적 느린, ubiquitin 독립 proteasomal 메커니즘 51, 52에 의해 발생합니다. proteasomal 활동을 강화 조건 수있는 cytosolic FRA에 translocated 독소의 수영장을 감소하여 translocation 분석의 결과는 따라서 스큐ction. proteasomal 억제로 인한 cytosolic 독소 증가는 독소가 실제로 cytosol에 도달할 수 나타내는 것이지만, 감지하기 전에 저하되었다; proteasome 억제제에 노출 세포는이 가능성에 대해서도 제어하는​​ 데 사용할 수 있습니다. 그것은 이러한 고려 사항은 상기 대체 접근법의 하위 집합에 적용 및 방법에 고유 아니라는 것을인지해야합니다. 앞에서 언급한 바와 같이, translocation 이벤트를 특성화를위한 최선의 전략은 잘 제어 기술의 조합을 사용하는 것입니다. 중요 단계와 문제 해결 화학 준비는 분석을위한 중요한 단계입니다. Digitonin 쉽게 분해되지 않으며, 그것은 모든 실험에 대한 새로운 준비를해야합니다. 마찬가지로, 신선한 PBST는 SPR 분석에 사용해야합니다. EDC : 보건국 활성화 버퍼는 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다, 두 솔루션을 혼합 후 저장하면 그것은 활동을 유지하지 않습니다. HoweveR, EDC와 NHS 별도의 aliquots는 -80 ° C에 저장하고 사용하기 전에 한번 해동 수 있습니다. 샘플 포함한 모든 솔루션은, 주입하기 전에 드 기름해야합니다. 이것은 SPR 신호에 공기 유도 스파이크를 방지할 수 있습니다. 이 분석에 사용되는 세포 유형은 독소 cytosol에 도달하는 일련의 감지 풀 수 있도록 충분한 독소 수용체를 표현합니다. 등 중부 표준시에 도전하기 전에 GM1과 HELA 세포의 전처리와 같은 일부 경우에서는 추가 독소 수용체는 표적 세포의 표면에 추가할 수 있습니다. 세포 유형은 또한 digitonin와 플라즈마 막의 선택 permeabilization에 감염될해야합니다. 프로토콜 언급된이 HELA 및 CHO 세포와 효과적인 설명하지만, 다른 세포 유형 organelle과 cytosolic 분수의 깨끗한 분리를 모니터링하는 서양 얼룩 분석을 사용하여 최적화 단계가 필요합니다. 우리는 정기적으로 단백질 이황화 아이 소 머라 아제의 배포판 (가용성 ER 단백질)와 Hsp90 (cytosolic prote를 따르십시오이러한 목적을 위해 16-19) 인치 펠렛 분획 16-19로 단백질 이황화 아이 소 머라 아제의 전용 파티션도 막 펠렛에서 수집한 organelles가 손상되지 않도록 보장합니다. 세포 organelles의 의도 파열은 cytosolic 분수에 endomembrane 제한 독소를 방출하여 시스템에 오류를 소개하는 것처럼 이것은 우리의 방법의 중요한 측면이다. SPR 기반 실험도 입증하는 데 사용할 수있는 translocation 이벤트가 아닌 세포 organelles의 용해에서 독소 결과의 cytosolic 수영장. 예를 들어, 독소는 15 분 (그림 4) 독소에 노출 BfA - 처리된 세포 (Figs. 2, 3A) 또는 세포의 cytosol에서 발견되지 않았습니다. 마찬가지로, CT의 B subunit는 2 시간 독소의 노출 (그림 3B) 후 cytosolic 분수에서 발견되지 않았습니다. 우리의 프로토콜 내부 점막의 permeabilization 결과다면, 우리는 afore 각각의 독소 cytosolic 수영장을 발견했을조건을 언급했다. 플라즈마 막의 재현성, 선택 permeabilization에 대한 적절한 프로토콜을 구축하는 것은 분석 구현을위한 속도 - 제한 단계를 대표하는 가능성이 높습니다. 플라즈마 막 permeabilization 다른 옵션을 사용할 수 있지만, 우리는 digitonin 치료 이러한 streptolysin O. 치료와 같은 다른 방법보다 일관성있는 결과를 제공하는 것을 발견 항체의 품질 또한 독소 표준의 시리얼 dilutions 설립 수있는 분석의 감도를 결정합니다. 예를 들어, 우리는 reproducibly PTS1 또는 CTA 표준 (Figs. 2-6) 중 하나로서 작은 0.1로 NG / ML를 검색할 수 있습니다. 안티 체인 항체는 독소의 B subunit을 인식하지 말아야하고, unintoxicated 세포는 항상 항체가 숙주 세포의 단백질과 교차 반응하지 않는지 확인하기위한 컨트롤로 사용해야합니다. 이 다를 수 있으므로 예비 실험은 항체에서 바운드 독소가 벗겨진에 대한 조건을 최적화해야합니다다른 안티 독소에 대한 항체. 변경된 조건 하에서 세포 독소의 translocation을 모니터링하면 독소 표준과 치료 컨트롤 세포에서 cytosolic 분획은 실험 샘플의 조건에 일치하는 보충해야합니다. 예를 들어, CTA 표준과 그림 5에서 치료 cytosolic 분수는 DMSO - 처리된 세포에서 cytosolic 분수에서 최종 약물 농도에 맞게 1 % DMSO로 보충했다. 이것은 수집된 분수의 화​​학 성분의 차이에서 발생할 수있는 SPR 신호의 가능한 차이를 제거합니다. cytosolic 및 organelle의 분수 사이 비교 역시 1 %의 추가를 요구이 세제는 SPR 감지 organelle 분획에서 멤브레인 - 쌌다는 독소를 공개하는 데 사용됩니다으로서 트리톤 cytosolic 분율 및 표준 X - 100. 예비 실험 cytosol의 존재가, 독소 표준 SPR 응답을 변경하지 않습니다 보였습니다그래서 unintoxicated 세포의 cytosol과 독소 기준을 보완하기 위해 필요하지 않습니다. 센서 슬라이드에 바인딩 항체는 EDC 경우 발생하지 않습니다 보건국 인증 솔루션은 오래하거나 슬라이드 아래 황금 측면 얼굴과 함께 악기에 삽입하는 경우. 보건국 활성화하고, 따라서 항체 캡처 : 제조 공정 감안할 때, 적절한 EDC를 방지 수있는 판 - 투 - 플레이트 변화가있을 것입니다. 슬라이드에 바인딩 항체가 가난한 경우로 약하게 고가 RIU로 표시, 두 번째 주사는 접시에있는 항체를 더 입금하실 수 있습니다. RIU ​​한 실험에서 다른 해독제 항체가 센서에 예금이 얼마나에 따라 다릅니다 임의의 단위입니다. 그러나 켜거나 가격은 지속적으로 유지됩니다. 하나의 채널이 실험 시료에 사용할 수 있으며 다른 채널이 버퍼 무조건 사용할 수 있습니다대로 그것은 듀얼 채널 재관류의 챔버와 굴절계를 사용하는 것이 바람직합니다NE 가능한 기준 드리프트에 대한 수정하기 위해서. 듀얼 챔버 악기를 사용하는 경우, 해독제 항체에만 두 채널 중 하나에 추가되었는지 확인하십시오. 샘플은 이후 두 채널을 통해 실행됩니다. 단일 채널 악기와베이스 라인 드리프트에 대한 보상은 혼자 샘플 주입하기 전에 항체 - 코팅 슬라이드에서 데이터를 버퍼의 컬렉션을 포함합니다. SPR 실험의 시작하기 전에 센서 슬라이드가 악기에 꽉 설정하고 모든 부속품이 안전한지. 이러한 문제로 인한 누수는 수집된 데이터에 공기 스파이크를 생성합니다. 누수도 항상 존재해야 폐기물 흐름의 부재에 의해 감지가 가능하다. 사출 루프의 볼륨보다 큰 샘플의 볼륨뿐만 아니라 공기 스파이크를 방지하는 것이 필요합니다 - 예를 들어, 우리는 500 μL 주입 루프 1 ML 샘플 볼륨을 사용합니다. 프리즘에 침지 기름의 부적 절한 금액 기준 signa의 안정화를 방지할 수 있습니다나 SPR 악기의 작동과 관련된 다른 문제는 사용자 가이드 및 Reichert에서 제공하는 기술 게시판에서 해결됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> 시그마 </td><td> D141 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> 시그마 </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> 시그마 </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> 목록 </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N - Hydroxysuccinimide) </td><td> 찌르다 </td><td> 24,500 </td></tr><tr><td> EDC (1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide) </td><td> 써모 과학 </td><td> 22,981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> 시GMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> 안티 CTA 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td> 안티 CTB 항체 </td><td> Calbiochem </td><td> 227,040 </td></tr><tr><td> 안티 PTS1 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR 센서는 슬라이드 </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 콜 팔머 </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB의 독소 subunit 효소와 세포 결합의 B subunit 1로 구성되어 있습니다. 이러한 독소는 세포 환경으로 분비하지만, 그들은 진핵세포 cytosol 내의 대상에 따라 행동하고 있습니다. 세포 표면에서 cytosol 2-4 들어가기 전에 endoplasmic reticulum (ER)에 소포 항공사에 의해 일부 AB 독소 여행. 응급실에서 독소와 이동의 나머지 부분에서 단백질 실시 채널을 통해 촉매 체인 dissociates은 cytosolic 목표 5에 도달합니다. 응급실에 독소 거래가 매우 비효율적 프로세스이기 때문에 translocated, cytosolic 체인은 감지하기가 어렵습니다 : 대부분의 내면 독소는 잠돌군 Zz 장치 및 ER 6에 도달 표면 바운드 독소의 작은 파편 때문에 전용 저하에 대한 lysosomes로 라우팅됩니다 -12. 응급실에서 교양 세포의 cytosol에 독소의 translocation을 모니터하기 위해, 우리는 highl과 subcellular 분획화 프로토콜을 결합표면 plasmon 공명 (SPR) 13-15의 Y 민감한 검출 방법. 독소 - 치료 세포의 플라즈마 막은 선택 후 해독제 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused하는 cytosolic 분수의 컬렉션을 수 있도록 digitonin와 permeabilized 있습니다. 항체 - 코팅 센서 cytosolic 독소의 PG / ML 수량을 캡처하여 검색할 수 있습니다. 이 프로토콜로, 그것은 cytosol에 독소 항목의 속도론를 수행하고 translocation 이벤트에 대한 억제 효과를 특성화 수 있습니다. cytosolic 독소의 농도는 또한 센서를 통해 perfused되었습니다 체인 표준의 알려진 수량과 생성된 표준 곡선으로부터 계산하실 수 있습니다. 우리의 방법은 radiolabeling 또는 대상 독소 다른 수정을 요구하지 않는 빠른, 민감한, 그리고 양적 탐지 시스템을 나타냅니다.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K 조회수.  University of Central Florida. 이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.