Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 AI073783 para K. Teter. Agradecemos ao Dr. Shane Massey para obter assistência no desenvolvimento do fracionamento subcelular de protocolo e Helen Burress para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação de digitonina <ol><li> Adicionar 500 mL de etanol a 100% para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo em um bloco de aquecimento fixado em 80 ° C por 10 min. </li><li> Dissolver 2,5 mg de digitonina em 250 mL de etanol aquecido para produzir uma solução estoque de 1% do digitonina. </li><li> Para gerar uma solução de trabalho de digitonina 0,04%, adicionar 40 mL da solução estoque para 960 mL digitonina de HCN tampão (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-etilmaleimida, e um inibidor de protease cocktail). </li></ol> 2. Intoxicação celular e permeabilização Nosso ensaio translocação pode ser aplicado a uma variedade de toxinas e linhas celulares. Abaixo, fornecemos um protocolo detalhado para a detecção de toxina da cólera (CT). Uma visão geral do processo é fornecido na Figura 1. <ol><li> Células HeLa são semeados em 6 bem-placas contendo 1 mL DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibiótico antimicóticopara alcançar 1x10 6 células / poço após uma incubação overnight a 37 ° C. Para gerar a toxina citosólica suficiente para a detecção reprodutível, poços triplicado são necessários para cada condição. </li><li> Após uma incubação durante a noite, substituir o meio de cultura com 1 mL DMEM contendo 100 ng / mL de gangliosídeo GM1. Isso aumenta o número de sítios de ligação para CT, como o receptor GM1 de CT irá intercalar na membrana plasmática das células expostas a uma solução de GM1. </li><li> Após incubação de 1 hora a 37 ° C, remova a mídia contendo GM1 e lavar as células duas vezes com DMEM. Em seguida, coloque as células a 4 ° C por 30 min em 1 mL DMEM contendo 1 mg / mL de CT. </li><li> Remover o meio-toxina contendo, lave as células duas vezes com DMEM, e incubar as células em 1 mL DMEM a 37 ° C para o intervalo de tempo desejado (s). </li><li> No final de cada período de perseguição, lavar as células com PBS e incubar cada poço com 250 mL de 0,5 mM EDTA em PBS. Permitir que as células se sentar por 10<html> min à temperatura ambiente e depois removê-los da placa de 6 poços por trituração com um vigoroso Pipetman p1000. Depois de um bem de células tiver sido coletado, combiná-lo com o segundo eo terceiro, em seguida, bem de mesma condição. Raspadores de células também pode ser usado para coletar as células. </li><li> Coloque a suspensão de células combinadas dos três poços replicar (750 mL de volume total) em um tubo de microcentrífuga único, e girá-lo em uma microcentrífuga de mesa por 5 min a 5.000 x g. Pellets de células de tamanho equivalente deve ser obtido para todas as condições. </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 mL da solução de trabalho de 0,04% digitonina. Coloque a suspensão de células em gelo por 10 min. </li><li> Spin the células digitonina-permeabilizadas a 16.000 xg por 10 min em uma microcentrífuga de mesa. Alienar a fração citosol contendo sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e manter a organela contendo fração pellet. </li></ol>título de &quot;preparação&gt; 3. Sample <ol><li> Citosol contendo frações sobrenadante são diluídos em tampão HCN para um volume final de 1 mL. Volumes de amostra de pelo menos 1 mL são necessários para assegurar o ar é extraído do loop de amostra 500 mL antes da injeção. </li><li> Frações organela contendo pellet ressuspenso estão em 1 mL de HCN tampão contendo 1% Triton X-100. Além de detergente é necessário para liberar o pool de membrana-nham de toxina. </li><li> Padrões de toxina em concentrações de 100, 10, 1 e 0,1 ng / mL são preparadas em tampão HCN. </li><li> Conjuntos paralelos de frações citosólica e organela estão preparados para um experimento de controle para confirmar a fidelidade do processo de fracionamento. Frações gerados conforme descrito na Seção 2 são ressuspenso em 20 mL de tampão de amostra 4x (fração citosólica) ou 120 mL de 1x tampão de amostra (fração organela). Volumes equivalentes de cada fração são resolvidos por eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil poliacrilamida e sondado by análise de Western blot para demonstrar a separação de uma proteína citosólica na fração sobrenadante e um solúvel, proteína ER residente na fração pellet 16-19. </li></ol> 4. SPR preparação da lâmina <ol><li> A Reichert SR7000 Refratômetro SPR é usada para experimentos SPR. </li><li> Definir uma lâmina de vidro banhado a ouro com uma monocamada auto-montada no instrumento SPR. Para ativar o slide sensor, perfundir de 1:1 (v: v) solução de 0,4 M EDC e 0,1 M NHS sobre a lâmina por 10 min a uma vazão de 41 mL / min. Todas as perfusões subsequentes irão utilizar o mesmo caudal. </li><li> Para remover o EDC: NHS tampão de ativação, lavar a placa por 5 minutos com PBS contendo 0,05% Tween 20 (PBST). A placa contém agora amarras amida reativa devido a desoperculação pela EDC: solução NHS. </li><li> Perfundir um anticorpo anti-CTA sobre o slide sensor ativado com uma diluição de 1:20.000 em 20 mM de acetato de sódio (pH 5,5) por 15 min. Uma queda inicial na refração emdex unidade (RIU) serão vistos devido à mudança de pH. Isto será seguido por um aumento no RIU como o anticorpo é capturado pelos amarras amida-reativa no slide sensor. </li><li> Remover os anticorpos não ligados a partir do slide sensor com uma lavagem PBST 5 minutos. RIU o sinal produzido pelo anticorpo captada planalto e estabilizar, fornecendo um sinal de nova linha de base. </li><li> Perfundir 1 M etanolamina (pH 8,5) sobre o slide sensor para 5 min. Este bonés e inativa qualquer amarras unbound esquerdo no slide sensor. </li></ol> 5. SPR análise de amostras <ol><li> Para estabelecer uma leitura inicial, PBST perfundir sobre o sensor de anticorpos revestido por 5 min. </li><li> Perfundir uma amostra ou padrão experimental da toxina sobre o sensor de 300 seg. Remover o ligante do buffer e PBST perfundir sobre o sensor para outra sec 200. </li><li> Após cada perfusão, a toxina ligada é removida do sensor por uma lavagem sec 100 com PBST, pH 5.0. Isso irá retornar o sinala sua leitura inicial básica, permitindo assim uma outra amostra a ser processada no mesmo sensor. </li><li> Antes de carregar uma nova amostra, empurrar uma pequena quantidade de ar através do loop de amostra para expulsar qualquer líquido residual da amostra anterior. Usando o procedimento descrito em 5,2-5,4, temos executado até 12 amostras em um slide sem perda substancial do sinal de linha de base. </li><li> A análise dos dados é realizada com o 2 Scrubber software, eo software Igor é usado para a preparação de figura. </li></ol> 6. Resultados representante Toxina pertussis (PT) é uma toxina AB que se move a partir da superfície da célula para o ER antes de sua Uma cadeia (PTS1) entra no citosol 3, 12. Conforme mostrado na Figura 2, o nosso ensaio de translocação SPR baseado poderia detectar PTS1 no citosol de células CHO intoxicado. Nenhum sinal foi gerado a partir do citosol de células unintoxicated, que confirmou o anticorpo anti-PTS1 não reagem de forma cruzada com um componente do citosol host. Ofração citosólica das células intoxicadas na presença de brefeldin A (BFA) também não conseguiu produzir um sinal positivo. BfA impede o transporte de toxinas para a translocação ER 6-8 site, 12, 20-25 e, assim, uma cadeia de fornecimento para o citosol. No final de cada execução, a toxina ligada é despojado do slide sensor. Este amostras permitiu múltiplas para ser exibido em um slide único sensor e, assim, desde uma comparação direta entre os resultados obtidos com diferentes condições experimentais. CT é um outro tipo AB-, ER-translocação de toxinas 4. Na Figura 3A, CTA1 foi detectada na fração citosólica das células HeLa CT-tratados. Este enfatizou que a nossa metodologia trabalha com vários tipos de células e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anticorpo anti-A cadeia está disponível. Nenhum sinal foi detectado quando a fração citosólica de CT células tratadas foi perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTB (Fig. 3B), demonstrando assim que o CTA1subunidade, mas não a célula-binding CTB pentâmero entra no citosol. Figura 3C mostra o sinal da fração organela é fora de escala em comparação com o sinal mais fraco da fração citosólica. Isto foi consistente com a ineficiência conhecida de CT transporte para o local de translocação ER 6, 7, que por sua vez limita a quantidade de toxina que pode chegar ao citosol. Além disso, a fração organela contém CT holotoxin bem como ER-CTA1 localizada, de modo que o sinal resultante SPR para a fração organela é inflado pela massa adicional do holotoxin associado CTB pentâmero. Assim, não é prático para plotar dados das frações organela e citosólico na sensorgram mesmo. Nosso ensaio pode monitorar o acúmulo dependente do tempo de toxina, translocado citosólica (Fig. 4). As células foram expostas à CT a 4 ° C, uma temperatura que permite a ligação da toxina para a membrana plasmática, mas impede a internalização da toxina associados a células. Após a removal de toxina não ligada, as células foram aquecidos a 37 ° C. Tanto o transporte de toxinas para o ER e A translocação da cadeia para o citosol pode ocorrer nesta temperatura. Nenhuma toxina foi detectado no citosol 15 minutos após o aquecimento a 37 ° C. Isso é reflexo do tempo de atraso necessário para (i) tráfico holotoxin ao ER, (ii) A / dissociação da subunidade B na ER, e (iii) Uma cadeia de exportação para o citosol. A piscina pequena de toxina citosólica foi detectada após 30 minutos a 37 ° C, e as quantidades progressivamente maiores de toxina citosólicas foram detectados após o 45 e 60 minutos de intervalo perseguição. Níveis ainda maiores de toxina citosólicos foram detectados após um intervalo de cinco horas de perseguição 17, demonstrando assim um contínuo, entrega a longo prazo de células associadas a toxina para o citosol host. Nosso ensaio também pode detectar a inibição da translocação de toxinas para o citosol (Fig. 5). Células tratadas com 10% de dimetil sulfóxido (DMSO), uma chaperone químico que impede a Disord térmicaEring da subunidade CTA1 isolado (T. e K. Banerjee Teter, observações não publicadas), apresentaram níveis baixos de CTA1 citosólica em comparação às células não tratadas. Desdobramento da toxina A cadeia é um pré-requisito para a translocação para o citosol 16-18, para a estabilização DMSO induzida de CTA1 consequentemente impedido o seu movimento a partir do ER para o citosol. A taxa de associação constante (k a) calculado a partir de experimentos SPR é diretamente proporcional à concentração de ligante no buffer de perfusão 14, 15, 26. Assim, é possível determinar a concentração de toxina citosólica a partir de um gráfico que traça o k a valores para os padrões de toxinas como uma função da concentração de toxina. Este procedimento foi utilizado para quantificar o bloco DMSO induzida por toxina de translocação apresentados na Figura 5: a curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de toxina foi utilizada para calcular uma citosólica CTA1 concentration de 0,3 ng / mL para células não tratadas e 0,1 ng / mL para células tratadas com DMSO (Fig. 6). A inibição da CTA1 desdobramento de DMSO, portanto, gerou uma redução de 3 vezes na translocação ER-to-citosol de CTA1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo Geral. (A) As células são incubadas com a toxina AB a 4 ° C, uma temperatura que permite a ligação da toxina à superfície da célula, mas impede endocitose toxina. As subunidades A e B da toxina são representados por círculos vermelho e azul, respectivamente. (B) A toxina não ligado é removido do meio, e as células são aquecidas a 37 ° C, a fim de promover o transporte endocitose e retrógrada da holotoxin ao pronto-socorro. Holotoxin dissociação ocorre na ER, o que permite que a corrente Um isolado para entrar no citosol pela passagem através de um canal condutor de proteína (s) na membrana ER. (C) As células são tratadas com digitonina seletivamente, a fim de permeabilizar o plasmamembrana. (D) A centrifugação é usada para particionar as células em separado frações citosólica e organela. O citosol é espremido para fora da célula através dos poros digitonina gerado e está localizado no sobrenadante. O intactos, ligada à membrana organelas são encontradas na fração pellet. (E) Para detectar a piscina translocado da cadeia de toxina no citosol anfitrião, a fração sobrenadante é perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anti-A cadeia de anticorpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de PTS1 translocação para o citosol host. Células CHO foram de pulso marcado com a 4 ° C por 30 min com 1 mg / mL da PT. As células foram então perseguidos por 3 hr a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilização da membrana plasmática com digitonina foi usado para extratos de células partição em separado e organela fracti citosólicaons. Um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-PTS1 foi usado para detectar a piscina citosólica de PTS1 a partir de células não tratadas ou BfA-tratada. PTS1 padrões foram perfundidos sobre o sensor como controle positivo, enquanto a fração citosólica das células unintoxicated foi perfundido sobre o slide do sensor como controle negativo. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Figura 3. Detecção de CTA1 translocação para o citosol host. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 2 horas a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilização da membrana plasmática com digitonina foi usado para extratos de células partição em separado organela e frações citosólica. (A) As frações citosólica foram perfundidos por um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Conhecidoquantidades de CTA foram utilizados como controle positivo, enquanto o citosol das células unintoxicated foi usada como controle negativo. (B) A fração citosólica das células intoxicadas na ausência de BfA foi perfundido durante um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTB. A purificada CTB pentâmero foi perfundido sobre o slide como um controle positivo. (C) A fração organela foi solubilizado com 1% Triton X-100 antes de perfusão mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Para fins comparativos, a fração citosólica (1 volume mL final) a partir do extrato mesma célula e um padrão CTA também foram perfundidos sobre o sensor. Para todos os painéis, a amostra foi obrigado despojado do sensor no final de cada execução. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Figura 4. Cinética de CTA1 entrada no citosol. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 15, 30, 45 ou 60 min a 37 ° C em toxina-livre medium. Para detectar a piscina translocado da toxina, frações citosólica de digitonina-permeabilizadas células foram perfundidos mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. Padrões CTA foram perfundidos sobre o sensor também. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Figura 5. Inibição da translocação CTA1 pelo DMSO. Células HeLa pulso marcado com a 4 ° C com 1 mg / mL de CT foram perseguidos por 2 horas a 37 ° C em meio livre de toxinas que não contenham adições (embriagado) ou DMSO 10% (+ DMSO intoxicado). Para detectar a piscina translocado da toxina, frações citosólica de digitonina-permeabilizadas células foram perfundidos mais de um sensor de SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. CTA padrões (100, 10, 1 e 0,1 ng / mL) foram perfundidos sobre o sensor como controle positivo, apenas a 1 e 0,1 ng / mL padrões são apresentados para fins de dimensionamento. Citosol de unintoxicated células foi usada como controle negativo. No final de cada execução, a amostra foi obrigado despojado do slide sensor. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Figura 6. Cálculo do CTA1 citosólica. K a valores das normas CTA da Figura 5 foram plotados em função da concentração da toxina. A curva resultante padrão foi usado para determinar, com base nos valores k uma das amostras experimentais da Figura 5, a concentração de CTA1 citosólico em células não tratadas e tratadas com DMSO. Padrões de toxinas são apresentados como círculos preenchidos; citosol não tratada é apresentado como uma praça aberta, eo citosol DMSO-tratada é apresentado como um círculo aberto. As médias ± intervalos de dois experimentos independentes são mostrados.

Não há conflitos de interesse declarados.

Comparação com a metodologia existente Nosso ensaio translocação SPR baseado representa um método rápido, sensível, e quantitativa para detectar entrega toxina no citosol host. A técnica não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina, e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anti-toxina Um anticorpo cadeia está disponível. Métodos existentes para monitorar a passagem de toxinas para o citosol também dependem de um protocolo de fracionamento subcel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliosídeo GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Perfurar </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolamina </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA de anticorpos </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anticorpos anti-PTS1 </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refratômetro </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor de slides </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Toxinas AB consistem de uma subunidade enzimática A e uma célula de ligação da subunidade B 1. Estas toxinas são secretadas para o meio extracelular, mas agir de acordo com as metas dentro do citosol eucarióticas. Algumas viagens AB toxinas pelas transportadoras vesícula da superfície da célula para o retículo endoplasmático (ER) antes de entrar no citosol 2-4. Na ER, o dissocia catalítico Uma cadeia do resto da toxina e se move através de um canal condutor de proteína para atingir o seu objectivo citosólica 5. O translocados, a cadeia A citosólica é difícil de detectar porque o tráfico de toxinas para o ER é um processo extremamente ineficiente: a toxina mais internalizado é encaminhado para a lisossomos para degradação, portanto, apenas uma pequena fração da superfície-bound toxina atinge o aparelho de Golgi e ER 6 -12. Para monitorar a translocação da toxina da ER para o citosol em cultura de células, nós combinamos um protocolo de fracionamento subcelular com o highly método de detecção sensível de ressonância plasmon de superfície (SPR) 13-15. A membrana plasmática das células tratadas com a toxina é seletivamente permeabilizadas com digitonina, permitindo cobrança de uma fração citosólica que posteriormente é perfundido durante um sensor de SPR revestido com uma toxina anti-Um anticorpo cadeia. O sensor de anticorpos revestido pode capturar e detectar pg / mL quantidades de toxina citosólica. Com este protocolo, é possível acompanhar a cinética de entrada de toxinas para o citosol e caracterizar efeitos inibitórios sobre o evento de translocação. A concentração de toxina citosólica também pode ser calculado a partir de uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de A cadeia de padrões que foram perfundidos sobre o sensor. Nosso método representa uma resposta rápida, sensível sistema de detecção e quantitativas que não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina alvo.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K visualizações.  University of Central Florida. Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Imunologia e Infecção

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...