עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R01 AI073783 כדי Teter ק. אנו מודים לד&quot;ר שיין מאסי לסיוע בפיתוח של חלוקה פרוטוקול subcellular והלן Burress לקריאה ביקורתית של כתב היד.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השוואה המתודולוגיה הקיימת Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים שרשרת זמין. השיטות הקיימות כדי לפקח על המעבר רעלן לתוך cytosol גם לסמוך על פרוטוקול חלוקה subcellular לתא תמציות לתוך cytosol מחיצה נפרדת שברים קרום 11, 23, 27, 28. שיטות אלה להשתמש כתם המערבי או radiolabels לזהות את הבריכה cytosolic של הרעלן. הגישה לשעבר וכמותיות במקרה הטוב, סובל רגישות נמוכה יחסית. גם פרוטוקולים radiolabeling יכול לקחת שבועות כדי ליצור תוצאה, בשל רמות נמוכות של רעלן אשר מגיעים cytosol. אמנם ניתוח כמותי עם רעלן radiolabeled יכול לקבוע את האחוז היחסישל הרעלן לתא הקשורים אשר נכנס cytosol, גישה זו אינה יכולה ישירות לקבוע את המספר המדויק של מולקולות הרעלן cytosolic. השוואת הרגישות של זיהוי הרעלן SPR כדי זיהוי של רעלן radiolabeled הוא בעייתי ולכן, כמו כמות הרעלן cytosolic יכול להיות מחושב על ידי SPR אך לא על ידי radiolabeling. מבחני טרנסלוקציה אחרים לעקוף סחר הצעדים נגד הזרם רעלן ולספק את הרעלן שרשרת ישירות לחדר המיון או באמצעות פלסמיד מערכות מבוססות ביטוי או במבחנה תעתיק / מערכות תרגום 29-38. בכל אחת מהשיטות רצף אמינו מסוף אות מטרות שרשרת ליבוא שיתוף translational לתוך לומן ER. ייצוא של שרשרת מסונתז מ ER הוא זוהה לאחר מכן על ידי חלוקה subcellular, צנטריפוגה ההפרש, פעילות הרעלן השפלה, cytosol proteasomal של הרעלן translocated, ו / או שינוי cytosolic רעלן ספציפי. קבוצות משנה של גישות אלוcus אך ורק על האירוע טרנסלוקציה, יכול לשמש בניסויים במבחנה הכינון מחדש, לייצר רמות גבוהות של רעלן לגילוי ושיתוף immunoprecipitation מחקרים. עם זאת, מתודולוגיות אינו יכול לקבוע את הקינטיקה או היעילות של משלוח רעלן מפני השטח של התא אל cytosol. ייתכן גם כי שרשרת translocated לא נכנס לחדר המיון במצב קונפורמציה זהה שרשרת holotoxin, נמסר. היבטים אחרים של המארח רעלן אינטראקציות חסרים נהלים אלה, כמו במקרה דיסוציאציה A / B. לפיכך, יש שתי החוזקות והחולשות כדי טרנסלוקציה ניטור עם שרשראות כי מסונתזים ישירות למיון. טרנסלוקציה רעלן מזוהה לעתים קרובות באמצעות מבחני שכרות. ההשפעה ציטוטוקסיות או cytopathic שנוצר על ידי רעלן להחיל exogenously מדגים את רעלן שרשרת הגיע cytosolic היעד שלה. ברור, זה אמצעי עקיף של טרנסלוקציה המנטרת רעלןctivity ב cytosol ולא בנוכחות הפיזית של רעלן cytosolic. לכן, השיטה אינה יכולה לכמת את רמות הרעלן cytosolic ולא ישירות לאתר עיבוד שונה של הרעלן translocated. קיימים גם תרחישים בהם קשר ישיר בין רמות הרעלן cytosolic ופעילות הרעלן אינם קיימים, כגון הצורך אפשרי ריכוז סף של רעל cytosolic לעורר תגובה תאית או כאשר פעילות הרעלן מייצר תגובה הסלולר רווי. עם זאת, מבחני שכרות יכול לספק מתאם תפקודית אשר מבחני ישירות לתעד את האירוע טרנסלוקציה. יש לנו אסטרטגיה זו השתמשו בעבר כדי להדגים עיכוב של טרנסלוקציה שרשרת תואמת עיכוב של שיכרון הסלולר 17-19. לסיכום, ישנן מספר שיטות כדי לזהות משלוח הרעלן cytosol. גישה SPR מבוססי שלנו יש את היתרונות של מתן מהיר, התוצאות רגיש, כמותי. דאתא ניתן גם להשלים עם הניסויים באמצעות אחת האסטרטגיות מבוגרים הנ&quot;ל כדי ליצור מסקנה חזקה. יישומים עתידיים שיטה ללא תווית שלנו לגילוי וכימות של הרעלן cytosolic מספק לחוקרים את הגמישות במטרה לענות על שאלות רבות בנוגע מצטיינים ביולוגיה של התא של שכרות. לדוגמה, אפשר לקבוע את היעילות של שרשרת האספקה ​​כדי cytosol על ידי חישוב אחוז רעלן פני כבול המגיעה cytosol. ניתן גם לכמת את הסכום הכולל של רעלן cytosolic, ובהרחבה, את מספר מולקולות הרעלן cytosolic לכל תא. הוא האמין כי מולקולה אחת של הרעלן דיפטריה cytosolic מספיקה כדי לעורר אפקט להשלים cytopathic / ציטוטוקסיות 39; מודל זה ניתן כעת נבדק עם רעלים אחרים באמצעות assay טרנסלוקציה שלנו מבחני שכרות גומל. לפיכך, assay SPR מבוססי שלנו shoקהילת יוכלו לקבוע כיצד מולקולות רבות של הרעלן cytosolic נדרשים עבור שיכרון פרודוקטיבי. הטכניקה שלנו יכולה גם לעקוב אחר ההתמדה של רעלן cytosolic. השפלה ניכרים של שרשרת translocated תגביל ואולי להפחית cytosolic ריכוז לאורך זמן, אשר מרמזים השפעה של סמים יכול להיות הפוך אם גישה שרשרת cytosol היה מוגבל לאחר החשיפה הראשונית הרעלן. יתר על כן, המדיום תאיים ואת קרום גלולה מתאי שיכורים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר כמות הרעל המופרש או רעלן המתגוררים במערכת endomembrane, בהתאמה. מחקרים השוואתיים של הרעלן, תאיים endomembrane-מקומי, ו cytosolic ניתן להשתמש כדי לבחון כיצד ביולוגיה של התא של שיכרון משתנה ER-translocating רעלים שונים. Assay שלנו יכול לשמש גם כדי לנתח את רעלן ספציפי גורמים הסלולר הנדרש עבור האירוע טרנסלוקציה 19. זה צריך להיות אפשרי להתאים את המתודולוגיה שלנו כדי לעקוב אחרטרנסלוקציה endosome ל-cytosol של רעלים אחרים כגון AB גורם אנתרקס קטלנית הרעלן דיפטריה. לבסוף, כניסה לתוך נגיפי cytosol המארח יכול להיות במעקב עם הליך ניסויי דומה. מגבלות תנאי המעכבות סחר רעלן למיון יהיה גם למנוע מסירה הרעלן cytosol. זה הודגם על ידי בהעדר cytosolic רעלן בתוך התאים שטופלו ב-BFA (איורים 2, 3 א). לפיכך, ניסויים שליטה נוספת נדרשים בעת שימוש בשיטה זו כדי לבדוק בלוקים הפוטנציאל של טרנסלוקציה הרעלן. עבור כמה רעלים AB, הפחתה של קשר דיסולפיד כי רצועות למקטע קטליטי holotoxin שלה מתרחשת בחדר המיון 6, 40-43. מצב חיזור של שרשרת יכולה בהתאם לשמש כאמצעי תחבורה רעלן לחדר המיון 16, 18. רעלים רקומביננטי המכיל את רצף הקונצנזוס עבור glycosylation N-linked, שינוי זה שיזם בחדר המיון, היה גםלשמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך ER 12, 23, 44-46. לבסוף, כפי שפורט לעיל, פרוטוקולים חלופיים הכוללים שיתוף translational הכניסה של הרעלן שרשרת לתוך לומן ER יכול לאמת השפעה מעכבת על האירוע טרנסלוקציה. לדוגמה, assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה הפגינו תפקיד פונקציונלי עבור Hsp90 ב טרנסלוקציה CTA1 כי אושרה פלסמיד עם מערכת מבוססת כי הביע CTA1 ישירות לומן ER 19. שרשראות של ER-translocating רעלים התערוכה הטיה חזקה ארגינין-over-ליזין חומצת אמינו המאפשר את הרעלן translocated להתחמק היוביקוויטין תלויי השפלה proteasomal 47-50. עם זאת, הפירוק של הרעלן cytosolic עדיין מתרחשת על ידי מנגנון היוביקוויטין איטית יחסית עצמאית, proteasomal 51, 52. תנאים המשפרים את פעילות proteasomal יכול להטות כך את תוצאות assay טרנסלוקציה שלנו על ידי הפחתת מאגר של רעלן translocated של פרה cytosolicction. תאים שנחשפו מעכבי פרוטאזום יכול לשמש כדי לשלוט על האפשרות הזאת: עלייה רעלן cytosolic הנובע עיכוב proteasomal יצביע הרעלן יכול בהחלט להגיע cytosol אבל היה מושפל לפני הגילוי. יצוין, כי שיקולים אלה חלים על תת של גישות חלופיות הנ&quot;ל אינם ייחודיים לשיטה שלנו. כפי שהוזכר קודם לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר לאפיון האירוע טרנסלוקציה היא להשתמש בשילוב של טכניקות מבוקר היטב. צעדים קריטיים בעיות הירי הכנה כימית היא צעד קריטי עבור assay. Digitonin לא מתמוססים בקלות, והוא אמור להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי. כמו כן, PBST טרי אמור לשמש לניתוח SPR. EDC: מאגר NHS ההפעלה צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש, זה לא ישמרו על פעילות אם מאוחסן לאחר ערבוב שני פתרונות. However, aliquots נפרד EDC ו - NHS ניתן לאחסן ב -80 ° C ו מופשר פעם לפני השימוש. כל הפתרונות, כולל דוגמאות, יש דה בגז לפני ההזרקה. זה ימנע האוויר הנגרמת דוקרנים האות SPR. סוג התא לשמש assay זה חייב לבטא קולטנים רעלן מספיק כדי לאפשר בריכה לזיהוי הרעלן שרשרת להגיע cytosol. במקרים מסוימים, כגון טיפול מראש של תאים הלה עם GM1 לפני אתגר CT, קולטנים רעלן נוסף ניתן להוסיף את פני השטח של התאים היעד. סוג התא חייב להיות גם רגישים permeabilization סלקטיבית של הממברנה פלזמה עם digitonin. פרוטוקול המתואר במסמך זה יעיל עם הלה ותאי CHO, אך סוגי תאים אחרים ידרוש צעד אופטימיזציה באמצעות ניתוח כתם המערבי לפקח על הפרדה נקייה של אברון לבין שברים cytosolic. אנו שגרתי בעקבות הפצות של isomerase דיסולפיד חלבון (חלבון מסיס ER) ו Hsp90 (א prote cytosolicב) עבור מטרה זו 16-19. מחיצות הבלעדית של isomerase חלבון דיסולפיד לתוך השבר גלולה 16-19 גם מבטיח כי האברונים שנאספו גלולה קרום שלמות. זהו היבט חשוב של השיטה שלנו, כמו הקרע לא מכוונת של אברונים תאיים יציג שגיאה לתוך המערכת על ידי שחרור endomembrane מוגבלת רעלן לתוך השבר cytosolic. SPR מבוססי ניסויים יכול לשמש גם כדי להוכיח את הבריכה cytosolic תוצאות רעלן מאירוע טרנסלוקציה ולא מתוך תמוגה של אברונים תאיים. לדוגמה, הרעלן לא זוהה cytosol של BFA שטופלו בתאים (איורים 2, 3 א) או בתאים שנחשפו רעלן רק 15 דקות (איור 4). כמו כן, למקטע B של ה-CT לא נתגלה השבר cytosolic לאחר חשיפה לרעלן שעתיים (איור 3B). האם פרוטוקול שלנו הביא permeabilization של ממברנות פנימיות, היינו זוהה בריכה cytosolic של רעלן עבור כל אחד שצויינוהתנאים שהוזכרו. קביעת פרוטוקול מתאים permeabilization, לשחזור סלקטיבית של הממברנה הפלסמה צפוי לייצג את שער הגבלת צעד ליישום assay. אפשרויות אחרות permeabilization הממברנה הפלסמטית זמינים, אך מצאנו כי הטיפול digitonin סיפקו תוצאות עקביות יותר מאשר שיטות אחרות כגון טיפול streptolysin O. איכות הנוגדן יהיה גם לקבוע את הרגישות של assay, אשר ניתן להקים עם דילולים הסידורי של תקן רעלן. לדוגמה, אנו יכולים לזהות reproducibly קטנה כמו 0.1 נ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של או PTS1 או CTA רגיל (איורים 2-6). אנטי נוגדנים שרשרת לא אמור לזהות את רעלן למקטע B, ותאי unintoxicated תמיד צריך לשמש מלאה כדי להבטיח הנוגדן אינו חוצה להגיב עם חלבונים בתוך התא המארח. ניסויים ראשוניים יצטרכו לייעל את התנאים הפשטת רעלן מחויב מן הנוגדן, כמו זה יכול להשתנותעבור נגד הרעלן נוגדנים שונים. כאשר ניטור טרנסלוקציה רעלן בתנאים הסלולר שינו, תקני את הרעלן לבין חלק מן cytosolic לתאי קבוצת הביקורת צריכה להיות בתוספת להתאים את התנאים במדגם הניסיוני. לדוגמה, תקנים CTA ואת חלק cytosolic מטופל מ איור 5 נוספו עם DMSO 1% כדי להתאים את ריכוז התרופה הסופי השבר cytosolic מ DMSO שטופלו בתאים. זה מבטל הבדלים אפשריים האותות SPR שעשוי לנבוע הבדלים בהרכב הכימי של שברים שנאספו. השוואות בין cytosolic ושברים אברון היה גם דורשים תוספת של 1% טריטון X-100 לשבר סטנדרטים cytosolic, כמו חומר הניקוי הזה משמש כדי לשחרר את הרעלן קרום עטופה מן השבר אברון לגילוי SPR. ניסויים ראשוניים הראו נוכחות של cytosol לא משנה את התגובה SPR בסטנדרטים רעלן,כך אין צורך להשלים את הסטנדרטים רעלן עם cytosol מתאי unintoxicated. נוגדן מחייב כדי להחליק את החיישן לא תתרחש אם EDC: פתרון NHS ההפעלה הישנה או אם השקופית מוכנס לתוך המכשיר עם הצד הזהב מטה. לאור תהליך הייצור, יהיו כמה השתנות צלחת אל צלחת אשר יכול למנוע EDC נאות: הפעלת שירותי הבריאות, ולכן ללכוד נוגדנים. אם נוגדן מחייב לשקופית הוא עני, כפי שצוין על ידי Riu גבוהות חלושות, הזריקה השנייה יכול להפקיד יותר של הנוגדן על הצלחת. Riu היא יחידה שרירותית משתנה מניסוי אחד למשנהו תלוי כמה נוגדנים נגד הרעלן מופקד על החיישן. עם זאת, שיעורי לסירוגין יישאר קבוע. עדיף להשתמש Refractometer עם חדרי זלוף כפולה ערוץ, כמו ערוץ אחד יכול לשמש מדגם ניסיוני הערוץ השני יכול לשמש חיץ aloנה כדי לתקן עבור סחיפה בסיס אפשרי. בעת השימוש במכשיר תא כפול, להבטיח כי נוגדנים נגד הרעלן הוא הוסיף רק אחד משני הערוצים. דוגמאות יהיה לאחר מכן להתנהל בערוצים שניהם. עם מכשיר ערוץ אחד, את הפיצוי עבור להיסחף הבסיס כרוכה אוסף של נתונים חיץ לבד משקופית נוגדן מצופה לפני הזרקה מדגם. לפני תחילת ניסוי SPR, להבטיח את השקופית חיישן מוגדר היטב במכשיר ואביזרים כל מאובטחים. הדלפות הנובע בנושאים אלה ייצרו קוצים האוויר הנתונים שנאספו. הדלפות גם יכול להיות מזוהים על ידי בהעדר זרימת הפסולת, אשר צריך תמיד להיות נוכח. נפח דגימה גדול יותר בנפח של הלולאה זריקה נחוצה כדי למנוע קוצים אוויר וכן - לדוגמה, אנו עושים שימוש במדגם כרכים 1 מ&quot;ל עם לולאה 500 זריקת μL. כמות הולמת של שמן טבילה על הפריזמה ימנע ייצוב של signa הבסיסיב נושאים אחרים הקשורים למבצע של המכשיר SPR מופנים במדריך משתמשים ו לקטי טכני המסופקים על ידי רייכרט.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> סיגמא </td><td> D141 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> סיגמא </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> סיגמא </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> רשימה </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> לנקב </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> סיGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-80747 </td></tr><tr><td> נוגדן Anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-57639 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> רייכרט </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR חיישן שקופיות </td><td> רייכרט </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> מזרק משאבה </td><td> קול פאלמר </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

רעלים AB מורכב האנזימטית למקטע ו למקטע תא מחייב B 1. רעלנים אלה מופרשים אל הסביבה תאיים, אבל הם פועלים על מטרות בתוך cytosol האיקריוטים. יש רעלים א.ב. לנסוע נושאות שלפוחית ​​מפני השטח של התא אל reticulum endoplasmic (ER) לפני הכניסה cytosol 2-4. ב ER, קטליטי שרשרת מנתק משאר הרעלן ועובר דרך ערוץ חלבון מנהלת להגיע ליעד cytosolic שלה 5. Translocated, cytosolic שרשרת קשה לזהות כי סחר רעלן לחדר המיון הוא תהליך יעיל ביותר: רעלן הפנימו ביותר מנותבת אל lysosomes של השפלה, ולכן רק חלק קטן של רעלן פני הנכנס מגיע מנגנון Golgi ו - ER 6 -12. כדי לפקח על טרנסלוקציה רעלן מ ER כדי cytosol של תאים בתרבית, ששילבנו פרוטוקול חלוקה subcellular עם highly שיטה לגילוי רגיש של plasmon משטח תהודה (SPR) 13-15. קרום הפלזמה של תאים שטופלו הוא רעלן permeabilized סלקטיבי עם digitonin, המאפשר איסוף של שבריר cytosolic אשר perfused לאחר מכן על החיישן SPR מצופה רעלן אנטי נוגדנים שרשרת. החיישן נוגדן מצופה יכולים ללכוד לזהות pg / mL כמויות של רעלן cytosolic. באמצעות פרוטוקול זה, אפשר לעקוב אחר קינטיקה של כניסה רעלן לתוך cytosol ו לאפיין תופעות מעכבות על האירוע טרנסלוקציה. ריכוז של טוקסין cytosolic ניתן גם לחשב עקומת סטנדרט שנוצר עם כמויות ידוע של סטנדרטים בשרשרת כי כבר perfused על החיישן. השיטה שלנו מייצג מערכת מהירה, זיהוי רגיש, כמותי שאינו מחייב radiolabeling או שינויים אחרים רעלן היעד.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

בדו&quot;ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Views.  University of Central Florida. בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

Video: Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.