Le test matrice de collagène a été développé et amélioré par le travail de nombreux groupes de recherche différents au cours des deux à trois dernières décennies. Les approches décrites ici pour explants dopaminergiques du striatum et grandement bénéficier de ces études. En outre, les auteurs tiennent à remercier Asheeta Prasad pour son aide dans la mise en place des cultures d&#39;explants du striatum. Les travaux dans le laboratoire a été financé par l&#39;Organisation Human Frontier Science Program (Prix du développement de carrière), l&#39;Organisation néerlandaise de recherche en santé et le développement (ZonMw-VIDI et ZonMw-TOP), l&#39;Union Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (à RJP), et l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (TopTalent; à ERES).

1. Préparation de collagène de queue de rat <ol><li> Recueillir 6-10 queues de rats adultes (il est possible de stocker les queues à -20 ° C jusqu&#39;à son utilisation). </li><li> Faire tremper les queues dans de l&#39;éthanol à 95% du jour au lendemain à la température ambiante (RT). </li></ol> Dissection de la queue de rat (dans la hotte de culture tissulaire): (Ranger les outils dans l&#39;éthanol à 70% quand il n&#39;est pas de les utiliser et assurez-vous que toutes les solutions, les outils et la verrerie utilisés tout au long de cette procédure sont stériles) <ol start="3"><li> Pour recueillir des tendons de la queue, couper l&#39;extrémité de la queue. Tenez gros bout de la queue avec une paire de pince. Utilisez une autre paire de pinces pour tenir, plier et casser la queue près de la pince d&#39;autres. Séparez les tendons et seront laissés derrière (figure 1A, B). </li><li> Recueillir les tendons dans stérile H 2 O et après avoir recueilli tous les tendons les déplacer vers un nouveau PetriDish stérile H 2 O. </li><li> Prendre 2-3 tendons et les déchiqueter à l&#39;aide de 2 paires decèpes dans un boîte de Pétri stérile nouveau H 2 O. Retirez non-tendon tissus tels que les veines (tissu tendineux est brillant et réfléchi; la figure 1C). Après le retrait de tous les tissus non-tendon, chaque queue donne environ 100-150 mg de tendons. </li><li> Transfert des tendons à 300 ml de solution stérile d&#39;acide acétique à 3% et remuer doucement pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Ajouter un supplément de 200 ml de solution stérile d&#39;acide acétique à 3% et remuer doucement pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Centrifuger la solution d&#39;acide acétique contenant les tendons à ~ 2700 xg pendant 120 min à 4 ° C à granulés non-dissous les tendons et les non-tendon tissus. </li><li> Lors de la centrifugation de préparer un tube de dialyse: <ul><li> couper des morceaux de 40 cm </li><li> faire bouillir dans 500 uM EDTA pendant 5 min </li><li> cool dans stérile H 2 O </li></ul></li><li> Attacher un noeud à une extrémité de la tubulure de dialyse et remplir le tube avec le surnageant de la solution du tendon centrifugé sur de la glace dans la hotte de culture tissulaire utilisant une machine automatique pipette et 25 ml d&#39;une pipette. Eviter la production de bulles. Noeud l&#39;autre extrémité de la tubulure et la tuyauterie magasin sur feuille d&#39;aluminium stérile sur la glace jusqu&#39;à ce que tous les morceaux de tube sont remplis (figure 1D). </li><li> Préparer 10 litres de solution stérile de 0,1 X MEM, pH 4,0, dans la hotte de culture tissulaire. Ajouter flotteur à des morceaux de tuyaux et les ajouter à la solution pré-refroidie MEM 0,1 X dans un bécher de 10 l. Dialyser une nuit à 4 ° C tout en remuant lentement. Cette dialyse élimine l&#39;excès d&#39;acide tout en maintenant le pH le plus bas. </li><li> Remplacez-la par une nouvelle pré-refroidi 10 l à 0,1 X MEM et agiter pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Répétez l&#39;étape précédente en remplaçant avec le nouveau pré-refroidi 10 l à 0,1 X MEM et agiter pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Solution de collagène Aliquoter dans stériles tubes de 50 ml. Aliquotes conserver à 4 ° C. Gardez les 6-12 mois, seulement gérer le stock de collagène dans la hotte de culture tissulaire. </li><li> Il est important de vérifier si le collagène purifié doit être dilué (en 0.1x MEM) pour obtenir des résultats optimaux dans le matr collagèneix dosage. Par conséquent, générer une série de dilution de collagène (collagène pur, 1:1, 1:2 et 1:5 dilué) et effectuer des essais de la matrice de collagène comme décrit ci-dessous pour déterminer la dilution optimale du collagène. </li></ol> 2. Dissection du mésencéphale dopaminergique 7,8 <ol><li> Disséquer E14.5 embryons de souris de l&#39;utérus de la mère et de garder dans du milieu L15 sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> Toutes les étapes suivantes sont effectuées dissection dans du milieu L15 sur la glace. <ol start="2"><li> Disséquer le cerveau. </li><li> Retirez le télencéphale en coupant le long de la partie médiane de chaque vésicule télencéphalique (utiliser les vésicules télencéphaliques pour explants striatum). </li><li> Retirer la gaine méningée. </li><li> Faites une coupe dorsoventral juste rostrale de la flexion mésencéphalique. </li><li> Faire une autre coupe dorsoventral juste caudale de la flexion mésencéphalique. </li><li> Faire une entaille le long rostrocaudal la ligne médiane dorsale en utilisant un microdissection couteau pour exposer le tissu sous-jacent du mésencéphale ventral. Soyez prudent de ne pas frapper le tissu mésencéphale ventral, car il contient les neurones dopaminergiques (figure 2). </li><li> Effectuer deux coupes rostrocaudal latérale et parallèle à la ligne médiane ventrale pour enlever les tissus du mésencéphale dorsal. </li><li> Diviser le tissu mésencéphale ventral restant dans des explants aide d&#39;un couteau de microdissection. </li><li> Conserver les explants dans du milieu L15 contenant FBS 5% sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Dissection du striatum Toutes les étapes de dissection sont réalisées dans du milieu L15 sur la glace. <ol><li> Utilisez vésicules télencéphaliques disséqués lors de la dissection du mésencéphale. </li><li> Retirez le thalamus en coupant entre le thalamus et le striatum en utilisant une pince. </li><li> Faites une coupe médio-latérale rostrale dans le striatum de supprimer les structures rostrales tels que le bulbe olfactif. Répétez cette étape pour le tissu situé caudalement dans le striatum. </li><li> Positionla tranche restante pour obtenir une vue coronale du striatum (figure 2). </li><li> Le striatum peut être reconnue comme une partie un peu moins dense (plus transparent) de tissu. Disséquer le striatum et le couper en explants aide d&#39;un couteau de microdissection. Eviter la fermeture des tissus légèrement plus foncée à la ligne médiane, qui contient des neurones migrent de l&#39;éminence ganglionnaire latérale et médiale. </li><li> Conserver les explants dans du milieu L15 contenant FBS 5% sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. Assemblée de collagène essais de Matrix Préparation du collagène (toutes les étapes sur la glace, utilisez refroidi pointes de pipette) <ol><li> Mélanger 860 pi de collagène dilué avec 100 ul de MEM 10x et 40 pi de bicarbonate de sodium 1M (NaHCO 3) et de garder sur la glace. Si, à ce point, le collagène se réchauffe, elle va se solidifier. </li><li> Ajouter une goutte de 20 pl (environ 5 mm de diamètre) de collagène préparés à une lamelle dans un puits d&#39;un plat à 4 puits Nuncet laissez reposer dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 min (ambiante concentration d&#39;O 2 est suffisant). Au cours de cette incubation, le collagène gélatiniser. </li></ol> Configuration de co-culture en gel de collagène <ol start="3"><li> Après le collagène a gélatinisé, utiliser une pipette avec une pointe de 200 pi de transférer un explant dopaminergique striatale ou au collagène. </li><li> Déplacer les explants à proximité immédiate de l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;une aiguille. Gardez-les en dehors à une distance d&#39;environ le diamètre d&#39;un explant (environ 200-300 um) (Figure 2). </li><li> Retirer excès du milieu et ajouter 20 ul de collagène préparé au-dessus des explants. Ce sera souvent la cause des explants de se déplacer. Repositionner les explants à l&#39;aide d&#39;une aiguille, comme décrit au paragraphe 4.4. </li><li> Laissez-le collagène solidifier pendant 15 min à température ambiante puis 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après le collagène a mis, ajouter 400 ul de emoyennes xplant et de grandir pendant 2-3 jours dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 5. Analyse par immunohistochimie et la quantification Immunohistochimie <ol><li> Pour fixer des explants, doucement ajouter 400 ul de paraformaldéhyde 8% (PFA) dans du PBS à 400 pi de milieu (ce qui dilue la PFA à 4%) et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver 3x 15 min dans du PBS à la température ambiante. </li><li> Incuber dans un tampon bloquant (BB; PBS + 1% de FBS + 0,1% de Triton X-100) pendant 2 heures. </li><li> Incuber une nuit avec l&#39;anticorps primaire en BB à 4 ° C. Pour les axones dopaminergiques utilisent anticorps anti-tyrosine hydroxylase (1:1000) 7, pour les axones striataux anti-DARPP32 anticorps (1:500) 9 et pour la visualisation de tous les axones anti-tubuline βIII (1:3000) 7. </li><li> Laver 5x 1 heure dans du PBS à la température ambiante. </li><li> Incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorophore approprié (1:500) dans la nuit à 4 BB° C A partir de cette étape sur le minimiser l&#39;exposition des explants à la lumière (par exemple les couvrir de papier d&#39;aluminium). </li><li> Laver la nuit dans du PBS à 4 ° C suivie de plusieurs lavages pendant la journée suivante. </li><li> Montez sur les explants lames de microscope à l&#39;aide Prolongez réactif Antifade milieu de montage. Ajouter une goutte de ~ 10 pi sur une lame de microscope en verre. Prendre la lamelle et la placer délicatement sur la goutte de milieu de montage avec le côté explant vers le bas. Évitez de piéger l&#39;air sous la lamelle de par de très abaissant doucement sur la goutte de milieu de montage. </li></ol> Quantification par le calcul de P / D <ol start="9"><li> Acquérir des images numériques des explants en utilisant un microscope à épifluorescence (Figure 3). </li><li> L&#39;utilisation des images, diviser chaque explant en quadrants pour générer un quadrant proximale (à savoir une partie de l&#39;explant la plus proche de l&#39;explant adjacente) et un quadrant distale (partie de l&#39;explant plus éloignée de l&#39;explication adjacentent) (figure 2, 4). </li><li> Mesurer la longueur de la plus longue de 20 neurites émergents de l&#39;explant la fois dans les quadrants proximale et distale. </li><li> Utilisez la longueur moyenne des 20 plus longs neurites pour calculer le ratio P / D pour chaque explant individuelle. AP / rapport D&gt; 1 indique attraction axone, tandis qu&#39;un ratio &lt;1 indique la répulsion des axones. </li><li> Dans certains cas, la croissance des neurites dense empêche l&#39;évaluation de la longueur des neurites individuelle. Dans ces situations, la quantification peut être réalisée en mesurant la distance entre le bord de l&#39;explant et le front avancé de la croissance des axones dans les quadrants proximale et distale. </li></ol> 6. Images représentatives Après la culture réussie des explants dopaminergiques du striatum et un grand nombre d&#39;axones sont visibles en utilisant la microscopie en champ clair ou visualisée par immunocytochimie anti-tubuline βIII (non représentée). Un sous-ensemble de ces axones sera dopaminergique ou s<html> axones triatal que immunocytochimie à l&#39;aide visualisées (figure 3). En divisant les explants en quadrants telle que décrite et la détermination de P / D ratios, un effet axone putatif attractive ou répulsive peut être quantifiée (Figure 3E). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Figure 1. Photos illustrant la préparation du collagène de tendons de rats. A) tirer en dehors de la queue de rat expose les tendons. B) Les tendons sont visibles que de corde comme des paquets. C) Les tendons sont faciles à distinguer des veines par leur aspect blanc brillant. D) après dissolution des tendons dans l&#39;acide acétique, la solution est transférée à un tube de dialyse. Pour garder le froid collagène dissous, les tubes sont placés sur une feuille d&#39;aluminium stérile sur la glace. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Schématique indiquant les différentes étapes de la procédure. Régions du cerveau appropriées sont disséqués et coupés pour générer des explants. Un mésencéphale unique et explant striatale sont positionnés à proximité immédiate dans une matrice de collagène et de gauche à se développer pendant 48-72 heures à 37 ° C. Axones sont visualisés par immunohistochimie fluorescence et un rapport P / D est calculée à quantifier les réponses chimiotactique. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Figure 3. Les résultats représentatifs montrant la croissance des axones dans une culture matrice de collagène. A) explant Mésencéphale colorées avec un anticorps anti-tyrosine hydroxylase révélant la croissance axonale. La ligne pointillée indique explant adjacente. B) Grossissement d&#39;une neurites montrant individuels et des cônes de croissance (flèches). C) explant striatale colorées avec des anticorps anti-DARPP32. D) Grossissement de C montrant neurites individuels. E) Exemple deLa quantification du ratio P / D. Les explants sont divisés en quadrants égaux. Le quadrant proximale est confrontée à l&#39;explant adjacente tandis que le quadrant distale est opposé à lui. Barres d&#39;échelle indiquent 100 um.

<ol>
	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le test matrice de collagène décrit ici a été utilisé et amélioré par de nombreux laboratoires différents dans les dernières décennies pour étudier une variété de molécules de guidage axonal et des systèmes neuronaux (par exemple voir les références 5-8). Ces études ont montré que ce test est un outil puissant pour étudier les effets et la régulation des molécules de guidage axonal sécrétées par différents tissus cibles (intermédiaire). Toutefois, il convient de no...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> La glutamine (200mm) </td><td> AAP </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez réactif Antifade Or </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Un tube de dialyse </td><td> Labs Spectrum </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> De lapin anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> De lapin anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-tubuline βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticorps marqués secondaires </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

Dopamine du mésencéphale (MDDA) neurones du projet via le faisceau médian du cerveau antérieur vers plusieurs domaines dans le télencéphale, y compris le 1 striatum. Réciproquement, à moyen neurones épineux du striatum qui donnent lieu à l&#39;striatonigrale (directe) voie innervent la substantia nigra 2. Le développement de ces secteurs axone dépend des actions combinatoires d&#39;une pléthore de croissance des axones et des signaux de guidage, y compris des molécules qui sont libérées par neurites ou par régions cibles (intermédiaire) 3,4. Ces facteurs solubles peuvent être étudiés in vitro par MDDA culture et / ou des explants de striatum dans une matrice de collagène, qui fournit un substrat en trois dimensions pour les axones mimant l&#39;environnement extracellulaire. En outre, la matrice de collagène permet la formation de gradients relativement stables de protéines libérées par des explants d&#39;autres cellules ou placés dans le voisinage (par exemple voir les références 5 et 6). Nous décrivons ici les méthodes pour les finsification du collagène de queue de rat, de microdissection des explants dopaminergiques du striatum et, de leur culture dans des gels de collagène et après analyse immunohistochimique et quantitative. Tout d&#39;abord, le cerveau des embryons de souris E14.5 sont isolées et dopaminergiques du striatum et les explants sont microdisséqué. Ces explants sont alors (co) cultivées dans des gels de collagène sur des lamelles de 48 à 72 heures in vitro. Par la suite, les projections axonales sont visualisées en utilisant des marqueurs neuronaux (par exemple la tyrosine hydroxylase, DARPP32, ou la tubuline βIII) et la croissance des axones et des réponses axonales attractives ou répulsives sont quantifiés. Cette préparation neuronale est un outil utile pour les études in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale et mesostriatal striatonigrale et d&#39;orientation au cours du développement. L&#39;utilisation de ce test, il est également possible d&#39;évaluer d&#39;autres (intermédiaire) pour les cibles des axones dopaminergiques du striatum et de tester ou de signaux moléculaires spécifiques.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Explants du système dopaminergique mésencéphale et le striatum sont utilisés dans un essai de matrice de collagène pour la<em&gt; In vitro</em&gt; L&#39;analyse du développement et de la voie striato mesostriatal. Dans cet essai la croissance axonale et d&#39;orientation peuvent être manipulés et quantifiés. Il peut également être modifiée pour évaluer d&#39;autres régions ou d&#39;indices moléculaires.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K vues.  University Medical Center Utrecht. Explants du système dopaminergique mésencéphale et le striatum sont utilisés dans un essai de matrice de collagène pour la In vitro L'analyse du développement et de la voie striato mesostriatal. Dans cet essai la croissance axonale et d'orientation peuvent être manipulés et quantifiés. Il peut également être modifiée pour évaluer d'autres régions ou d'indices moléculaires.

Vidéo: Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

L&#39;isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Connexions à la fibre de la zone de moteur supplémentaire revisitée: Méthodologie de la dissémination des fibres, de la DTI et de la documentation tridimensionnelle

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...