The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Ce protocole suit les directives LUMC et AMC de comité d&#39;éthique de la recherche humaine. 1. Procédure chirurgicale et collecte de tissus Remarque: Bien qu&#39;il existe différentes techniques pour l&#39;excision chirurgicale de la maladie de Dupuytren, l&#39;étalon-or actuel est le fasciectomie partielle 15. La plupart des patients sont traités dans la clinique chirurgie d&#39;un jour. <ol><li> Effectuer la chirurgie sous anesthésie générale ou régionale en fonction des préférences du patient et de l&#39;anesthésiste&#39;S et de co-morbidités du patient. Ces considérations sont au-delà de la portée de ce document. Avant l&#39;incision, toucher la peau avec un objet pointu afin de vérifier que l&#39;anesthésie est satisfaisante. Utilisez un garrot pour faciliter la visualisation chirurgicale dans un champ sans effusion de sang. </li><li> Après apprêter stérile et drapage, marquer l&#39;incision prévue avec un stylo. Inciser la peau avec un scalpel sous loupe grossissement soit longitudinalement or en utilisant des incisions en zigzag à prévenir les contractures supplémentaires et également pour permettre une exposition suffisante. </li><li> Utilisation de ciseaux de dissection, libérer la peau et la couche sous-cutanée de sous-jacents les palmaire fascia contractés. Identifier et protéger le faisceau neurovasculaire du doigt parce que le cordon malade peut le déplacer vers la ligne médiane. Une fois que le tissu fibreux (nodules et / ou cordon) est décrite, exciser fortement et régional (montant) à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Effectuer hémostase méticuleuse sous contrôle de garrot à la fin de la procédure pour éviter la formation d&#39;hématome. </li><li> Pour fermer la peau, utiliser plasties en Z supplémentaires pour obtenir un allongement partielle de la peau. </li><li> Pour ces études utilisent seulement la partie des nodules du cordon fibreux, la partie la plus active et cellulaire de la maladie. Demandez le chirurgien procéder à une identification macroscopique. Les nodules isolés dans la paume de la main sont souvent précurseurs ou une corde, mais ne sont presque jamais résection, car ils ne causent habituellement pas de symptômes.Ceux que nous résection étaient les nodules qui faisaient partie d&#39;un cordon du doigt contractée. Identifier ces nodules par la partie épaisse et dure des cordons dans le handpalm (figure 1A). </li><li> Une fois que le chirurgien retire le tissu, transférer immédiatement à l&#39;aide de pinces stériles dans un tube de 50 ml contenant du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S). Maintenir le tissu pour un maximum de deux heures dans ce milieu sur une zone de la glace humide (4 ° C) (par exemple, le transport du tissu à partir de la salle d&#39;opération de l&#39;outil de culture cellulaire). </li><li> Gardez les échantillons sur de la glace (4 ° C) tout en préparant la prochaine étape. Préparation de la chambre de matériaux et culture cellulaire nécessite de 10 à 20 min. </li></ol> 2. Préparation des instruments, milieu de culture et Culture Inserts Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. <ol><li> Préparer 500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S) et le filtre sterilize. Préchauffer le milieu à 37 ° C. </li><li> Forceps autoclave, une paire de ciseaux Mayo courbes lame (150-170 mm de longueur) et une paire de ciseaux de Metzenbaum et conserver dans un récipient stérile. </li><li> Sous flux laminaire, ouvrez une plaque de 12 puits de culture stérile. Placez un insert de culture (0,45 um taille des pores, 12 mm de diamètre) dans chaque puits de la plaque à 12 puits (figure 1B, panneau inférieur). </li><li> Remplir la plaque 12 puits avec 600 pi de préchauffé (37 ° C) milieux de culture par pipetage sur le bien et non pas directement sur la membrane de l&#39;insert. Placer la plaque dans l&#39;incubateur (37 ° C, CO 2 5%) (figure 1B, panneau supérieur). <ol><li> Vous pouvez également utiliser une plaque de 24 puits et ajouter 300 ul de milieu par puits. Le volume de milieu par puits soit optimale en une couche de ménisque étant formée entre le liquide et la partie inférieure de l&#39;insert de membrane. Remarque: le milieu au fond du puits se diffuse à travers la nitrocellulose membrane former la couche de ménisque comme représenté dans les schémas de la figure 1B (panneau inférieur). </li></ol></li></ol> 3. tissus installation de culture de tissus Préparation et ex vivo Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. <ol><li> Transférer la partie des nodules du cordon du tube de 50 ml sur un plat 100 mm Petri et ajouter 10 ml d&#39;préchauffé (37 ° C) moyenne. Assurez-vous que le tissu est en contact avec le liquide pendant toute la procédure. <ol><li> Retirer la couche de graisse périnodulaire l&#39;aide des ciseaux de Metzenbaum. Jeter le tissu adipeux. Avec l&#39;utilisation de forceps et les ciseaux courbes lame, couper transversalement le tissu en petits morceaux (épaisseur maximale de 200 um). </li></ol></li><li> Transférer la plaque à 12 puits à partir de l&#39;incubateur dans la hotte laminaire. Vérifiez que la membrane de l&#39;insert est devenu transparent (humide) et est donc en contact avec le milieu. </li><li> En utilisant des pincessoulevez délicatement une partie des tissus en touchant la couche externe (ne pas appliquer la tension sur le tissu). Placer une pièce de tissu sur la membrane de l&#39;insert de culture cellulaire de sorte que le tissu reste à l&#39;interphase air-milieu. Culture un maximum de deux pièces de tissu sur le même insert / puits. </li><li> Assurez-vous que le tissu est placé à plat sur la membrane, en contact avec le milieu longitudinal de telle sorte que le tissu ne glisse de la membrane ne est entièrement couvert par le milieu. Éviter les bulles d&#39;air. Remarque: A ce stade, il est possible d&#39;ajouter des facteurs de croissance ou des inhibiteurs d&#39;intérêt pour les médias; par exemple, les composés d&#39;essai (A, B, C, D, E) à répétitions et / ou en courbe de concentration. Inclure au moins deux pièces de contrôle (non traitées) de tissu dans des conditions de croissance normales pour se assurer que l&#39;expérience a été mis en place correctement. Incuber les tissus pendant 3-7 jours dans un incubateur de culture de tissu. </li><li> Infecter le tissu avec soit lentiviral construction ou adénoviral si la surexpression ou assommer eXperiments d&#39;un besoin gène d&#39;intérêt à effectuer (Figure 2). Transférer une partie de tissu à partir de la plaque à 12 puits dans une boîte de 35 mm en utilisant une pince. <ol><li> Utiliser un volume maximum de 10 ul de virus à titre élevé. </li><li> Effectuer l&#39;injection sous un microscope à dissection avec une seringue à insuline chargé avec 50 pl de PBS contenant 10 ul de virus sélectionné. Placez l&#39;aiguille perpendiculaire au centre du tissu. </li><li> Lentement injecter le contenu de la seringue. Ne pas rentrer directement l&#39;aiguille. Quand la perforation du tissu, ne pas laisser passer l&#39;aiguille à travers l&#39;autre côté mais à maintenir l&#39;aiguille dans le tissu lui-même (autour du centre du tissu). </li><li> Transférer le tissu de nouveau dans la plaque de 12 puits, fermer la plaque de culture et le placer dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol></li></ol> 4. totalité montage immunofluorescence et de la reconstruction 3D Remarque: Tous les proprocédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. Le protocole pour toute immunocoloration montage et l&#39;imagerie décrit ci-dessous est une adaptation des méthodes utilisées précédemment rapportées pour d&#39;autres tissus 16-19. Tampons et matériaux sont décrits dans le Tableau 1 et la liste des matériaux. <ol><li> tissus de transfert de la plaque de culture à 2 ml microtubes contenant du PBS. Laver 2x pendant 5 min dans une solution de PBS sur une plate-forme tournante. Fixer tissus dans 4% PFA tamponnée (1,5 ml de solution par le tissu dans 2 ml microtubes), O / N à 4 ° C sur une plate-forme tournante. </li><li> Retirer PFA et laver 3x dans du PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Déshydrater les tissus par immersion dans une solution de methanol à 25% pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante. Augmenter le pourcentage de méthanol progressivement (50%, 75%, 100%) avec les tissus immergés à chaque solution pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante. </li><li> tissus de transfert dans du DMSO / solution méthanolique (étape de perméabilisation) pendant 3 semaines à 4 ° C,18 comme décrit précédemment. Remarque: A ce stade, les tissus peuvent être stockés à long terme à 100% de methanol à -20 ° C. </li><li> Passez à la procédure 16, 17 coloration; réhydrater progressivement les tissus (75% -50% -25% -0% de la série de méthanol). Effectuez chaque étape de réhydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C, sous agitation constante. </li><li> Incuber les échantillons avec des anticorps primaires dans du PBS contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 20% de DMSO O / N à 4 ° C. Utilisation des anticorps selon les rapports suivants en utilisant les stocks commerciaux de PBS: anti-α actine de muscle lisse (1: 500, souris), de type anti-collagène de type I (1: 500, de chèvre) anti-collagène de type III (1: 500, chèvre). </li><li> Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 4 ° C (solution PBS changement de 3 à 4 fois). </li><li> Diluer anticorps secondaire approprié (Alexa 555 anti-souris, Alexa 488 anti-chèvre) à 1: 250 dilution dans du PBS contenant 1% (BSA) et 20% de DMSO. Incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 476; C et incuber avec contre-coloration nucléaire, TO-PRO-3 dilué à 1: 500 dans du PBS à l&#39;étape de lavage final. Remarque: TO-PRO-3 est une émission rouge lointain colorant d&#39;ADN (avec une ligne laser 633 nm He-Ne) et est combiné pour l&#39;imagerie simultanée avec d&#39;autres canaux; dans ce type de type cas collagène I / collagène III (488 nm), α actine musculaire lisse (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). </li><li> Transférer les tissus à une série de methanol (25% -50% -75%) à déshydrater lentement le tissu; exécuter chaque étape de déshydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C sous agitation constante. <ol><li> tissus de transfert dans des tubes en polypropylène. Tissus clairs dans le salicylate de méthyle (de poignée sous hotte chimique) 18 ou une utilisation alternative de solution BABB 19. Incuber à température ambiante sous agitation constante jusqu&#39;à ce que les tissus deviennent transparents. Mont entre lame et une lamelle scellé avec jeu dur milieu de montage (figure 1C, panneau supérieur). </li></ol></li><li> échantillons d&#39;images sur une micro confocal inverséportée équipée avec une grande NA 63X et / ou 100X objectifs à immersion d&#39;huile (figure 1C). <ol><li> Nettoyez l&#39;objectif avec une solution de nettoyage fournies par le fabricant de microscope. </li><li> Appliquer une goutte d&#39;huile sur la lentille d&#39;objectif. Placez la lame avec l&#39;échantillon sur la platine du microscope et de se concentrer sur l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Définissez les configurations sur le microscope pour l&#39;imagerie simultanée de la fluorescence à trois canaux avec des lignes laser 488 nm, 514 nm et 633 nm. </li><li> Acquérir des images simples ou multiples XY images plan focal (Z) de la pile (Figure 3A). Utilisez augmentation de la largeur de la pile Z pour effectuer la reconstruction 3D. Pour obtenir une image à haute résolution utilise à faible vitesse de balayage, nombre de balayages moyenne (≥ 3) et acquérir des images 16 bits de résolution 1024 x 1024 pixels. </li><li> Analyser les images Z pile acquis: d&#39;abord renommer et sauvegarder le fichier d&#39;image (xyz). En utilisant le programme logiciel du microscope confocal, configurer une intensité maximale de projection des images Z de la pile dans un 3D reconstruite image. <ol><li> Sélectionnez le fichier xyz, dans les &quot;Outils de process&quot;, cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D&quot;. Entrez &quot;Maximum&quot; dans la méthode de projection (ou &quot;moyenne&quot; si le signal fluorescent est saturé). Pour une seule projection ne changent pas l&#39;X, Y et Z avions, et appliquer l&#39;outil de projection (figure 3B, r1). </li></ol></li><li> Utilisez les images de la pile Z pour créer une projection 3D avec animation (logiciel confocal) aux fins de visionnement. Sélectionnez le fichier xyz, dans les outils de traitement, cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D&quot;. <ol><li> Cliquez sur &quot;Créer un film&quot;. Saisissez l&#39;angle de rotation Démarrer en degrés (par exemple, 0 ° que le point du film, de l&#39;axe Y départ) et cliquez sur &quot;Démarrer Set&quot;. Saisissez l&#39;angle de rotation en degrés End (axe Y) comme point de fin du film (par exemple, 180 ° ou 3606; pour une rotation complète) et cliquez sur &quot;Fin Set&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Maximum&quot; comme une méthode de projection (ou &quot;moyenne&quot; si le signal fluorescent est saturé). Entrez le «Number of Frames» pour la rotation de la reconstruction 3D (par exemple, 20 rotations ou plus pour réduire la vitesse de rotation). Cliquez sur &quot;Appliquer&quot;. Exporter le film en tant que fichier visuelle (par exemple, &quot;avi&quot;) (Movie supplémentaire 1) ou à l&#39;exportation comme des fichiers &quot;tiff&quot; qui crée un fichier image pour chaque angle de rotation (figure 3B; rotation r4, r10, r18). </li></ol></li></ol> 5. valant deuxième génération d&#39;harmoniques (collagène) et à deux photons de fluorescence excité (élastine) imagerie ex vivo sur des tissus au cours Culture Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. <ol><li> Retirer les plaques transwell de l&#39;incubateur et placer un seul (non fixée) tiquest partie dans une plaque de culture cellulaire de 35 mm contenant 500 ul de milieu. </li><li> Placez le tissu de sorte que le grand axe est à plat sur la plaque. Gardez tissu humide à tout moment cependant, pas flottante. </li><li> Passer objectif immergé dans l&#39;eau du microscope multiphoton directement en contact avec le tissu (Figure 1C). </li><li> Obtenir des images avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 800 nm et de recueillir la lumière émise entre 371 à 425 nm (SHG, le collagène) et de 474 à 532 nm (autofluorescence, élastine) (figure 3C). Effectuer microscopie à deux photons dans un microscope confocal verticale équipé d&#39;un laser femtoseconde au moyen d&#39;un objectif eau d&#39;immersion 20X / NA 1.0. Processus confocale empile avec le logiciel du fabricant. Remarque: Excitation avec un laser infrarouge proche des molécules de collagène crée des images de contraste élevé de structures de collagène natif à différentes profondeurs. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+controls+granulation+tissue+contractile+activity+and+myofibroblast+differentiation.">Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation.</a> The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).</li><li>Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+force+monitor+for+measurement+of+contraction+forces+generated+in+human+dermal+fibroblast+cultures:+evidence+for+cell-matrix+mechanical+signalling.">A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).</li><li>Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

Les auteurs ont déposé une demande de brevet pour de Dupuytren la maladie: la culture d&#39;organes 3D. # GB1307200. Contrats de licence et de services commerciaux sont disponibles.

Les étapes les plus critiques de la culture ex vivo du tissu conjonctif humain sont l&#39;utilisation immédiate du tissu après l&#39;ablation chirurgicale pour assurer la viabilité; le tissu doit rester en solution à moyen ou une solution saline en tout temps; maintenir une culture stérile; des coupes transversales de tissu doivent avoir une épaisseur maximale de 200 um; mise en place du système ex vivo de culture est optimale lorsque le tissu est en contact avec le milieu, mais non totalement ...

La maladie de Dupuytren (DD), une maladie fibroproliférative bénigne provoque la flexion des doigts permanente due à la formation de nodules et les cordons dans la paume de la main. Bien que la propagation de la maladie est particulièrement élevé chez les Caucasiens d&#39;Europe du Nord, l&#39;étiologie génétique sous-jacente de la maladie reste inconnue 1. La principale caractéristique de DD est l&#39;excès de production de matrice extracellulaire (ECM) protéines (par exemple, collagène), qui forment un tissu fibreux dur occupant l&#39;espace entre les tendons et la peau de la paume de la main et des doigts, ce qui perturbe de façon permanente les mouvements fins de la main 2, 3. La récurrence de la maladie suggère altérations génétiques sous-jacents comme une cause de la fibrose 1, 4. Un traitement efficace pourrait être de cibler directement les mécanismes fibrotiques incontrôlables au niveau cellulaire et moléculaire. Notre travail récent sur la fibrose nous a conduit à l&#39;élaboration d&#39;unnouveau système de culture en 3D qui permet la culture à court terme de tissu fibreux humain avec le potentiel de dépistage des drogues. Ce système a contribué à surmonter l&#39;approche limite de cultures de fibroblastes 2D et de définir un rôle pour la régulation à la baisse partielle, réalisée par le saut d&#39;exon, d&#39;activation de la voie TGF dans la médiation de la fibrose 5. Nous avons développé une méthode à la culture ex vivo pièces d&#39;exérèse humaine de patients DD pour étudier l&#39;interaction entre les myofibroblastes et l&#39;ECM entourant 5, 6. L&#39;étude de DD fibrose du tissu conjonctif ainsi que d&#39;autres maladies fibrotiques se appuie sur l&#39;analyse histopathologique de l&#39;excisée chirurgicale spécimens, l&#39;isolement des fibroblastes du tissu et l&#39;établissement de cultures primaires ou de procédures de triage des cellules. Ces approches sont assez statique, car ils ne permettent pas la manipulation exogène des propriétés de la maladie ou une intervention thérapeutique par l&#39;expérimentateur. En outre, CE primairecultures ll ont tendance à se adapter aux conditions de culture et de leurs propriétés d&#39;expression des gènes diffèrent essentiellement de la situation in vivo sur tous les passages, même pendant les premiers passages (parmi passage 3 et 6) 7, 8. Nous avons réussi à maintenir le matériel chirurgical des déchets ex vivo conditions de culture pour une période de temps qui permet l&#39;étude des caractéristiques spécifiques du patient et le criblage de composés médicamenteux anti-fibrotiques ou anti-inflammatoires. Le système est basé sur une membrane de nitrocellulose qui permet un contact du tissu avec le milieu, mais pas avec la matière plastique, par conséquent, la prévention de l&#39;altération du tissu lors de la fixation, comme observé précédemment lors de la mise en culture de fibroblastes de DD ainsi que d&#39;autres types de cellules 9. Aucun gel de collagène ou d&#39;un autre substrat de protéine ECM est nécessaire, étant donné que le tissu DD se produit de grandes quantités de ces protéines. Ce est avantageux pour l&#39;entretien des micro ECM natif et le chiffre d&#39;affaires le péchédes substrats à matrice CE sont régulateur important de l&#39;architecture et de la fonction 10, 11 tissus. Par exemple, les protéines de la MEC telles que la fibronectine, la laminine et le collagène, peuvent influencer polarité avant-arrière de fibroblastes indiqués comme similaire à polarité apicale-basale dans les cellules epitheliales 12, 13 . cellules polarisées ont répartition asymétrique des molécules extracellulaires qui détermine la migration cellulaire et l&#39;expression des gènes, par exemple, l&#39;accessibilité de l&#39;intégrine α1β1 sur la membrane affecte l&#39;adhérence cellulaire de collagène de type I 14. Etant donné que l&#39;objectif principal de ce modèle 3D a été de préserver le micro-environnement natif, aucune substrat de matrice ECM artificielle a été utilisée. En bref: pièces d&#39;exérèse sont également coupés dans un environnement stérile et placés sur des membranes nitrocellular. Si le traitement administré par injection est nécessaire, les tissus sont injectés après qu&#39;ils ont été placés sur la membrane. Si le traitement ne nécessite pas d&#39;être administrés par injection puis le composé est ajouté au milieu de culture (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), avec 1% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine (P / S)). Les cultures sont maintenues pendant un maximum de dix jours, après quoi le tissu est fixé à 4% de paraformaldehyde (PFA), traité par une solution de saccharose à 30%, noyé dans du composé OCT et stocké à -80 ° C, comme décrit précédemment 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

La méthode de l&#39;ex vivo, la culture 3D de tissu conjonctif est un ensemble en place un système robuste et facile à comprendre la relation entre l&#39;ECM et les autres composants de cellules constituant le tissu DD et potentiellement d&#39;autres types de fibrose ainsi. En outre, ce système permet une méthode fiable pour tester les effets de composés sur différents types de cellules et de leurs effets sur la charge fibrotique 20. Les étapes de la collection de...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

La maladie de Dupuytren (DD) est une maladie fibroproliférative de la paume de la main. Ici, nous présentons un protocole à la culture spécimens de résection de DD dans un (3D) système de culture tridimensionnelle. Ce système de culture à court terme permet la préservation de la structure 3D et propriétés moléculaires du tissu fibreux.

Human Dupuytren de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour l&#39;étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K vues.  Leiden University Medical Center.  La maladie de Dupuytren (DD) est une maladie fibroproliférative de la paume de la main. Ici, nous présentons un protocole à la culture spécimens de résection de DD dans un (3D) système de culture tridimensionnelle. Ce système de culture à court terme permet la préservation de la structure 3D et propriétés moléculaires du tissu fibreux. 

Vidéo: Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Recherche

Médecine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un humain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procédure pour saphènes humaines veines<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion et renforcement externe

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Stratégique des cellules endothéliales Tube Formation Assay: Comparaison matrice extracellulaire et le facteur de croissance réduit la matrice extracellulaire

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Étapes de préparation pour la mesure de la réactivité chez les souris des artérioles rétiniennes Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...