Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de la Subvention RO1DC002756 Purdue Research Foundation. Nous tenons à remercier Doris Chang Wu et Wiese pour des conseils avec des expériences et McPhail Rodney à l&#39;aide de chiffres.

Recettes Ringers Chick <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Eau (grade de culture de tissus) </td></tr></tbody></table> Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez un volume final de 1000 ml avec de l&#39;eau. PBS 10X <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> Eau DEPC </td></tr></tbody></table> Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez finalesvolume à 500 ml avec de l&#39;eau. La concentration de travail (1X) est obtenue en diluant une partie des stocks 10X à 9 parties d&#39;eau de qualité culture tissulaire, telle que celle obtenue avec un système d&#39;irradiation UV Millipore pour générer de l&#39;eau avec 18 MQ cm conductivité. SAG moyennes explant tenant <ul><li> DMEM/F12 avec L-glutamine, 10 mM Hepes </li><li> L&#39;insuline de 10%, Transfert, Sélénium (STI 1) </li><li> 1% stylo-strep </li></ul> Milieu de culture des explants <ul><li> SAG moyennes explant tenant </li><li> 10 ng / ml neurotrophine-3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) </li></ul> Dissection de la moelle épinière et moyennes tenant <ul><li> L-15 </li><li> 10% sérum de veau foetal </li><li> 1% stylo-strep </li></ul> Incuber les œufs à 37-38 ° C. Stériliser les outils et les disséquer plat Sylgard dissection de l&#39;éthanol à 70%. Disséquer la vaisselle et les outils peuvent également être stérilisée aux UV pendant la nuit. <ol><li> Placez des perles dans un microtube avec 1 ml de PBS stérile, mélanger et attendre que les perles de s&#39;installer au fond du tube. </li><li> Laver les billes plusieurs fois en enlevant le surnageant après les perles se sont installés et remettre en suspension dans du PBS. </li><li> Incuber les billes en protéine purifiée (dilué dans du PBS) ou du PBS seul (contrôle) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincez les perles dans du PBS et de stocker dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS avant d&#39;être placée dans le collagène. </li></ol> 2. La dissection ganglionnaire Statoacoustic <ol><li> Sur E4 retirer l&#39;embryon de l&#39;oeuf et le placer dans un plat avec une solution de Ringer chiches pour enlever les membranes embryonnaires humaines. </li><li> Placez l&#39;embryon dans un plat Sylgard © bordée de Pétri remplie de HBSS froid et la position de l&#39;embryon sur le côté avec la vésicule otique vers le haut. Pin de l&#39;embryon à l&#39;antenne utilisant des goupilles de dissection. </li><li> En utilisant deux broches de dissection, faire une coupe horizontale à travers la peau immédiatement à l&#39;ventralesachets canal, à peu près où il rencontre le conduit cochléaire. Faire une coupe verticale antérieure et postérieure à la SAG. Utilisez une pince ou une épingle à dissection pour soulever et retirer le lambeau de peau bordée par les trois coupes. Remarque: Le SAG est situé au bord de l&#39;antéroventral otocyste, à mi-chemin entre la poche dorsale, qui est facilement visible avec un éclairage de base clair, et le conduit cochléaire ventrale qui projette ventromedially et est obscurci par les arcs branchiaux. Le s&#39;allonge cochléaire conduit donc sa dimension dorsoventral augmentera progressivement sur E4 entre Hamburger-Hamilton phases 23 à 25 septembre. </li><li> Tirez le otocyste dans une direction postérieure à le séparer de la SAG. Déplacer les tissus environnants le SAG avec des épingles de dissection et retirer délicatement le SAG de l&#39;embryon en utilisant # 55 forceps. Retirer de grands morceaux de tissu mésenchymateux et de faisceaux de nerfs sortant de la SAG. </li><li> En utilisant une pointe à large embouchure pipette, transférer l&#39;explant à un24 puits, la plaque avec 0,5 ml explant SAG la tenue moyenne. Gardez explants sur la glace ou à température ambiante pendant 4 heures. </li></ol> 3. Dissection de la moelle épinière <ol><li> Retirez l&#39;embryon E6 de l&#39;œuf et le placer dans un plat contenant une solution de Ringer chiches. Retirer la tête et les membranes embryonnaires humaines. </li><li> Placer le corps dans un plat de Sylgard © dissection froide contenant moyenne vertébrale de dissection du cordon. Position et la broche de l&#39;embryon &quot;bas ventre&quot; et caudale face à l&#39;expérimentateur. Placez broches dissection travers chaque membre et par l&#39;extrémité antérieure. </li><li> En utilisant des pinces et / ou dissection broches, retirez délicatement la peau et des tissus, se déplaçant dans une direction ventrale, jusqu&#39;à ce que la surface dorsale de la moelle épinière est visible. </li><li> Couper la ligne médiane dorsale de la moelle épinière avec une épingle de dissection, dans un postérieur à la direction antérieure, sur toute la longueur de la moelle épinière. Cela crée un «livre ouvert», comme les côtés gauche et droit de la moelle épinière séparée. </li><li&gt; Enlever les tissus environnants, latéralement, à isoler la moelle épinière et d&#39;exposer les ganglions de la racine dorsale (DRG). Retirez le DRG et les méninges en frottant une épingle ou une pince à disséquer entre la moelle épinière et les DRG. </li><li> Retirer la moelle épinière du corps en tenant l&#39;extrémité caudale le plus de la moelle épinière avec une pince de levage et de haut et loin de l&#39;expérimentateur. Retirer DRG restantes et les méninges. </li><li> Tenir une extrémité de la corde spinale l&#39;aide d&#39;une pince (ou la broche à l&#39;antenne) et utiliser des ciseaux pour couper le long Vannas la ligne médiane ventrale, pour bissectrice la moelle épinière. </li><li> Tenir une extrémité de l&#39;explant avec des pinces pour immobiliser le tissu et utiliser des ciseaux pour couper Vannas explants petite (100-500 um de longueur) sur toute la longueur du tissu. La plaque de sol peut être reconnu comme un épaississement des tissus clairs long d&#39;un bord explant. </li><li> Utiliser une pipette à large embouchure de transfert des explants sur une plaque de 24 puits avec 0,5 ml de dissection moyennes froid. Gardez explants sur la glace pour maintenir la viabilité des tissus, fou jusqu&#39;à 4 heures. </li></ol> 4. Explantation de la culture avec des protéines purifiées afin de tester la réactivité des neurites <ol><li> Préparer une solution de collagène 1,5 mg / ml dans un tube de 15 ml conique, sur la glace, selon les instructions du fabricant. </li><li> Vérifier la solution de collagène a un pH de 7 à 7,4 sur le papier indicateur de pH à l&#39;aide. Ajuster le pH en ajoutant du NaOH en volumes de 1 pl. </li><li> Transfert des explants à une plaque de 24 puits en utilisant une pointe large bouche pipette et aspirer le liquide en excès. Explants multiples peuvent être cultivées dans un puits, mais doit être placé à au moins 500 um uns des autres. </li><li> Ajouter 0,5 ml de collagène pour le puits contenant l&#39;explant. Position de l&#39;explant sur la surface du fond du puits. Veillez à régler chaque culture complètement avant de procéder à la même suivant car le collagène commence à polymériser à température ambiante. </li><li> Placer la plaque de culture sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Lorsque le collagène a polymerized qu&#39;il ressemble à un gel. </li><li> Ajouter 0,5 ml de milieu de culture chaleureuse explant soit complétée par des protéines purifiées (dilué dans du PBS) ou de PBS (contrôle) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Effets sur la croissance des neurites doit être visible par les 24 heures. NOTE: Nous avons utilisé le même protocole pour la culture des explants SAG jusqu&#39;à 42 heures. </li></ol> 5. Explantation de co-culture avec des billes recouvertes de protéines pour tester neurites directionnels <ol><li> Commencez avec des étapes de la culture des explants 04/01 au 04/04. </li><li> Aide d&#39;une pipette, transférer les billes de 1-5 PBS pour le puits contenant la solution de collagène et d&#39;explantation. </li><li> Utilisez une pince à la position des billes de 50 à 500 um à partir du bord de l&#39;explant. </li><li> Placer la plaque sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Le tissu ou une bille peut devenir déplacées comme le collagène se polymérise. Vérifiez les cultures et les re-positionner le tissu et perles au cours des 5 premières minutes. </li><li> Ajouter 0,5 mL SAG médias à chaque puits et incuber pendant 24 heures. </li></ol> 6. Visualisation des neurites par immunohistochimie <ol><li> Rincez les cultures dans le PBS et fixer pendant 1 heure à température ambiante dans du paraformaldéhyde 4% dans le PBS. </li><li> Communiqué de gels sur les murs des puits en traçant autour du bord des gels avec l&#39;extrémité arrondie d&#39;une spatule en téflon micro. Effectuez la immunocoloration avec les gels dans les puits. Rincez plusieurs fois dans du PBS. </li><li> Incuber dans 0,5 ml de solution de blocage (10% de sérum de veau, 0,1% de Triton X-100, l&#39;azoture de sodium à 0,1% dans PBS) pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Incuber dans 0,5 ml d&#39;anticorps primaire (anticorps anti-β-tubuline anticorps dilué 1:500 dans une solution de blocage) nuit à 4 ° C. </li><li> Rincez plusieurs fois dans du PBS. Incuber dans 0,5 ml d&#39;anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris 2b anticorps dilué 1:500) nuit à 4 ° C. De ce pas en avant, garder les plaques dans l&#39;obscurité ou envelopper dans du papier, en raison de sensibilité à la lumière desAnticorps secondaires. </li><li> Rincez plusieurs fois dans du PBS et conserver à 4 ° C dans du PBS pendant une semaine au maximum. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figure 1. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion des purifiée NT-3 et NT-3-billes recouvertes sur des explants E4 SAG poussin. SAG corps cellulaires des neurones et les neurites étaient immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un objectif 10x sur un microscope confocal. Après 24 heures in vitro, d&#39;explants SAG affiché excroissance des neurites plus grande en présence de 100 ng / ml humaine purifiée NT-3 ajoutés au milieu de culture cellulaire (1B), comparé aux contrôles (1A). Neurones SAG ont été co-cultivées avec des perles trempés dans 100 ng / ml de NT-3 à démontrer que d&#39;une source ponctuelle de NT-3 peut localement favoriser la croissance des neurites. Les explants affiché plus longtemps et plus dense excroissance des neurites sur le côté de laexplant face du talon par rapport au côté opposé (1D) et par rapport aux cultures témoins avec des perles trempée dans du PBS (1C). Barre d&#39;échelle = 200 pm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion de la purifier et la Wnt5a Wnt5a enduit de perles sur cordon E6 chiches épinière. Explants de la moelle épinière ont été immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un microscope confocal. Après 24 heures de croissance, en présence de la souris purifiée Wnt5a (400ng/ml), la croissance des neurites à partir d&#39;explants de poussins de la moelle épinière a été augmenté (2B) par rapport aux témoins cultivés sans Wnt5a (2A). Perles trempée dans 500 ng / ml Wnt5a, placé 300-500 um à partir du bord des explants de la moelle épinière, a également favorisé la croissance des neurites (2D) par rapport aux cultures témoins (2C). Similaires de co-culture des résultats ont déjà été publiés avec des cellules exprimant Wnt5a 8. Barre d&#39;échelle = 200um.

<ol>
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Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous présentons une méthode de disséquer et de la culture E4 SAG et E6 explants de la moelle épinière, de poussins, sous des conditions sans sérum. Cette procédure est actuellement utilisée dans notre laboratoire pour étudier les effets des différents ligands sécrétés sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. De nouveaux aspects de ce protocole comprennent l&#39;utilisation d&#39;un système sans sérum pour les explants en culture et l&#39;utilisation de billes trempées dans les facteu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Équipement </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td> Nous utilisons un Leica M80 stéréomicroscope avec éclairage fond clair de base </td></tr><tr><td> Glissez chauds </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collagène de polymérisation </td></tr><tr><td> Oeuf de poule couveuse </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% de CO 2 humidifié incubateur de culture cellulaire </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matériaux Dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;copie; revêtement boîte de Pétri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 puits, plaque de culture cellulaire </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Pince Dumont </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Goupilles en acier inoxydable dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Embryon épinglage, la dissection fines </td></tr><tr><td> Moria cuillère perforée </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10370-17 </td><td> La récolte des embryons / transfert </td></tr><tr><td> 200 pi larges embouts de pipettes bouche </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Le transfert des explants </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 et E6 des oeufs de poule </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Chick solution de Ringer </td><td></td><td></td><td> La récolte des embryons </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissection </td></tr><tr><td> Milieu L15 </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Spinal moyenne de dissection du cordon </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Spinal moyenne de dissection du cordon </td></tr><tr><td> Ciseaux Vannas </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501778 </td><td> Dissection de la moelle épinière </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Préparation de collagène </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagène de type I de queue de rat </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> La culture des explants </td></tr><tr><td> PBS 10X (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutralize collagène </td></tr><tr><td> NaOH 1N (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutraliser le collagène </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutraliser le collagène </td></tr><tr><td> papiers indicateurs de pH (de 6.0 à 8.1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Pour vérifier le pH de collagène </td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 ul larges embouts de pipettes bouche </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Pour collagène pipette </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La culture des explants </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Milieu de culture des explants </td></tr><tr><td> SES 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Supplément de milieu </td&gt; </tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> CNTF (rat) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> NT-3 (humain) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> Purifiée de souris Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel perles de gel bleu </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;immunohistochimie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixation </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Rinçages </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> Sodiumazoture </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> De sérum de veau </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> Monoclonaux de souris anti-IgG2b β tubuline 1 + anticorps II </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Les étiquettes des organismes cellulaires et neurites </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG2 anticorps b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> La tubuline β détecte les anticorps </td></tr><tr><td> Téflon micro spatule </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Des gels de collagène Libération de bien </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Les organes sensoriels de l&#39;oreille interne de poulet sont innervés par le processus périphériques du ganglion statoacoustic (SAG) des neurones. Innervation organe sensoriel repose sur une combinaison de signaux de guidage axonal 1 et 2 facteurs de survie situé le long de la trajectoire des axones en croissance et / ou au sein de leurs objectifs organe sensoriel. Par exemple, les interférences fonctionnelles avec une voie de guidage des axones classiques de signalisation, sémaphorine-neuropiline, a généré l&#39;erreur d&#39;acheminement des axones otique 3. En outre, plusieurs facteurs de croissance exprimés dans les objectifs sensorielles de l&#39;oreille interne, y compris la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), ont été manipulées dans des animaux transgéniques, conduisant de nouveau à l&#39;erreur d&#39;acheminement de 4 axones SAG. Ces mêmes molécules promouvoir à la fois la survie et la croissance des neurites de neurones in vitro de la SAG chiches 5,6. Ici, nous décrire et démontrer la méthode in vitro nous sommes actuellement uchantent pour tester la réactivité des neurites SAG chiches aux protéines solubles, y compris morphogènes connus tels que les Wnts, ainsi que les facteurs de croissance qui sont importants pour la promotion de la croissance des neurites SAG et la survie des neurones. L&#39;utilisation de ce système modèle, nous espérons pouvoir tirer des conclusions sur les effets que les ligands sécrétés peuvent exercer sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. Explants SAG sont disséqués au jour embryonnaire 4 (E4) et cultivées dans des gels de collagène en trois dimensions dans un milieu sans sérum pendant 24 heures. Tout d&#39;abord, la réactivité des neurites est testé par des explants de culture avec des protéines complétés moyenne. Puis, de se demander si les sources ponctuelles de ligands sécrétés peuvent avoir des effets directionnels sur l&#39;excroissance des neurites, les explants sont co-cultivées avec des billes recouvertes de protéines et analysés pour la capacité de la perle localement promouvoir ou inhiber le développement. Nous incluons également une démonstration de la dissection (modifié le protocole 7) et la culture des explants E6 moelle épinière. Nousutilisent couramment des explants de moelle épinière pour confirmer la bioactivité des protéines et protéines-trempés perles, et de vérifier les espèces réactivité croisée avec des tissus de poussins, dans les conditions même culture que les explants SAG. Ces tests in vitro sont pratique pour rapidement criblage de molécules qui exercent trophiques (survie) ou Tropic (directionnelle) effets sur les neurones du SAG, surtout avant d&#39;effectuer des études in vivo. Par ailleurs, cette méthode permet de tester des molécules individuelles dans un milieu sans sérum, avec des neurones de survie élevé 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K vues.  Purdue University. Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.

Vidéo: Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurosciences

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induction d’une lésion complète de la moelle épinière de type transection chez la souris

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...