Le financement au Dr Thornton de Pfizer Limited est grandement appréciée.

1. Collecte, stockage et préparation de sérum et les fluides de lavage broncho- <ol><li> Recueillir le sérum à partir d&#39;échantillons sanguins non traités en permettant la coagulation du sang à 4 ° C, et le sérum magasin comme aliquots à -20 ° C avant de les utiliser. Broncho-alvéolaire (LBA fluides) devrait également être stockées sous forme de fractions aliquotes à -20 ° C. Remarque: stockage de sérum et de BAL comme aliquotes limite le potentiel de dégradation de l&#39;antigène cible par la répétition de congélation-décongélation des échantillons au cours des tests répétés. </li><li> Faire dégeler les échantillons et mélanger les échantillons de sérum et de BAL soigneusement au vortex et centrifuger pendant 1 min à 14000 rpm. </li><li> Pour les tests de routine des échantillons de sérum humain, diluer le sérum 01:01 (v / v) avec un milieu de culture de tissus (TCM). TCM est constitué de milieu RPMI-1640, 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 1% (v / v) de la L-glutamine 200 mM solution, et de l&#39;azoture de sodium 0,02% (m / v) en tant que conservateur. Le milieu est préparé à l&#39;avance et peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs mois. Appliquer 100 pi de la DILUTed sérum à la LFD. </li><li> Pour l&#39;homme liquides de LBA, et pour les fluides BAL de modèles animaux, appliquer 100 pi d&#39;échantillon propre à l&#39;écoute des nouvelles orientations, sans pré-traitement. </li><li> Pour le sérum à partir de modèles animaux, diluer le sérum 1:2 (v / v) avec un tampon phosphate salin contenant 4% (p / v) d&#39;EDTA, de la chaleur pour 3min dans un bain d&#39;eau bouillante, centrifugeuse pendant 5 min à 14000 rpm, et appliquer 100 ul de surnageant soignée à l&#39;appareil LFD. </li></ol> 2. Application de sérum et de BAL sur le périphérique latérale-débit <ol><li> Stocker les dispositifs latéraux d&#39;écoulement à la température ambiante (23 ° C). A cette température, les appareils sont stables pendant 12 mois. Supprimez les périphériques de leurs poches et les placer sur une surface plane. </li><li> Utilisation d&#39;un embout de pipette stérile, appliquer 100 pl de pré-traitée échantillon de sérum ou de BAL pur à l&#39;orifice de libération du dispositif. </li><li> Permettre à l&#39;essai pour une durée de 15 min à température ambiante, au moment où les résultats des tests doivent être consignés. Remarque: En quelques secondes, le liquide sera soifr à migrer par capillarité le long de la membrane de nitrocellulose dans la fenêtre d&#39;observation. </li></ol> 3. Enregistrement et interprétation des résultats LFD <ol><li> Le LFD consiste d&#39;une ligne de commande interne (indiquée par la lettre C sur le boîtier en matière plastique) et une ligne de test (indiquée par la lettre T). La ligne de commande doit toujours apparaître, indépendamment de l&#39;antigène Aspergillus dans l&#39;échantillon de sérum ou de BAL. Cela montre que le test a fonctionner correctement. </li><li> Si l&#39;antigène Aspergillus est présent dans l&#39;échantillon de sérum ou de BAL, la ligne de test apparaît également dans 15min d&#39;application d&#39;échantillon. Parce que l&#39;intensité de la ligne de test est proportionnelle à la quantité d&#39;antigène présente dans l&#39;échantillon d&#39;Aspergillus, la ligne de test peut apparaître en tant que faiblement positif (+), une moyenne positif (+ +) ou comme une forte positif (+ + +) . Toutefois, aucune ligne de test positif, quel que soit l&#39;intensité, d&#39;indiquer la présence de l&#39;antigène Aspergillus dans l&#39;échantillon. En el&#39;absence de l&#39;antigène e Aspergillus, aucune ligne de test s&#39;affiche, et le résultat est enregistré comme négatif (-). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Des exemples représentatifs de négatifs, faiblement positif, positif modéré, et fort des résultats positifs avec des échantillons LFD BAL et le sérum sont présentés dans la figure 1. Résultats de l&#39;antigène de tests positifs pour RAJ (faible et forte) ou négatifs des tests utilisant des fluides LFD BAL de leucémie myéloïde aiguë (LMA) patients diagnostiqués selon l&#39;EORTC / MSG critères diagnostiques sont indiqués dans le tableau 1. Inclus dans ce tableau sont les correspondants clinique et mycologique (galactomannane et de la culture) de données, et les résultats d&#39;un test de PCR spécifique d&#39;Aspergillus mis au point à Saint-Barthélémy Hôpital 8, pour chaque patient. Le diagnostic de la maladie a été fondée sur des facteurs d&#39;accueil (neutropénie, l&#39;utilisation prolongée de corticostéroïdes, le traitement avec d&#39;autres reconnus des cellules T immunosuppressants), les critères cliniques et de positivité pour GM BAL (définie ici comme une valeur d&#39;indice GM&gt; 0,8). Sous les 2002 EORTC / MSG lignes directrices 10, 12 patients, 13 et 16 ont été diagnostiqués avec «possible» IA sur la base de facteurs de l&#39;hôte et les critères cliniques ou de positivité GM. Selon la version révisée (2008) EORTC / MSG directives 2, facteurs de l&#39;hôte et la positivité GM seuls ou facteurs de l&#39;hôte et les critères cliniques ne suffiraient pas à indiquer «possible» infection fongique invasive moins d&#39;être accompagné par les pièces justificatives à partir de données cliniques et mycologiques, respectivement. Patient 6 a été diagnostiqué avec «probable» IA dans les deux 2002 et 2008 des lignes directrices en raison de facteurs de l&#39;hôte, majeurs et mineurs des caractéristiques cliniques et la positivité GM. Notez que tandis que ni la LFD, ni PCR sont actuellement inclus dans les lignes directrices EORTC / MSG, il ya une grande concordance entre les deux tests et le test commercial galactomannane indiquant la présence de l&#39;antigène Aspergillus et de l&#39;acide nucléique dans l&#39;échantillon BAL<html> s de patients 6 et 12. D&#39;autres résultats d&#39;essais démontrant l&#39;efficacité des tests LFD et PCR dans le diagnostic IPA peuvent être trouvés dans Johnson et al 8. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figure 1. Négatif (ligne de commande uniquement) et positif (contrôle et test en ligne) les résultats des tests de LFD utilisant du sérum et BAL. Les intensités des réactions de ligne de test sont proportionnelles à la concentration de l&#39;antigène cible dans les échantillons de sérum et BAL. Réactions varient généralement de faible (+) par le biais modérée (+ +) à forte (+ + +). Indépendamment de l&#39;intensité de ligne de test, tous trois sérum réaction positive indique invasif maladie pulmonaire aspergillose due à la présence d&#39;antigènes circulants dans le sang d&#39;Aspergillus. Des réactions positives BAL (faible, modérée ou forte) indiquerait la germination des spores et le développement des hyphes potentiellement pathogène dans les poumons. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Aucun patient. </td><td> Patient l&#39;information </td><td> Les critères cliniques 1 </td><td> La culture BAL 2 </td><td> GM EIE indice 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR résultat </td><td> Résultat LFD </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Principaux signes TDM (nodule et halo) et une mineure </td><td> Négatif </td><td> 0,9 (positif) </td><td> Probable </td><td> Probable </td><td> Positif </td><td> Faiblement positif (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Présumé infection fongique précédente </td><td> Aucune modification importante, un mineur </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (très positif) </td><td> Possible </td><td> Aucun </td><td> Positif </td><td> Fortement positive (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Staph à coagulase négativeylococcus et E. coli dans le sang </td><td> Aucune modification importante, deux mineures </td><td> Négatif </td><td> 0,25 (négative) </td><td> Possible </td><td> Aucun </td><td> Négatif </td><td> Négatif (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Infection à la poitrine </td><td> 3 critères mineurs, y compris épanchement pluriel nouvel infiltrat en plus </td><td> Négatif </td><td> 0,16 (négative) </td><td> Possible </td><td> Aucun </td><td> Négatif </td><td> Négatif (-) </td></tr></tbody></table> 1 nodules ou des halos sur une tomodensitométrie est évocatrice d&#39;une infection fongique 2 Candida glabrata dans le liquide BAL serait considérée comme un contaminant, en est la levure deuxième plus fréquemment isolé dans le cadre de la flore normale de l&#39;homme 9 3 Un indice de&gt; 0,8 dans le test de GM EIE du BAL est révélatrice de l&#39;infection Aspergillus 4 Basé sur les 2002 EORTC / MSG critères diagnostiques pour &#39;possible »,« probable »ou« prouvée »la maladie fongique invasive 10 5 Basé sur la version révisée (2008) EORTC / MSG critères diagnostiques de la «possible», «probable» ou «prouvée» la maladie fongique invasive 2 Tableau 1. Les résultats des tests d&#39;échantillons LFD BAL de la leucémie myéloïde aiguë avec IPA probable et de patients atteints de LAM de contrôle (aucun signe d&#39;infection) et l&#39;EORTC / MSG diagnostic de l&#39;infection.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;identification définitive de l&#39;IPA ne peut vraiment être atteint par l&#39;isolement de l&#39;agent étiologique à partir d&#39;échantillons de biopsie, mais la récupération des échantillons appropriés n&#39;est souvent pas possible chez les patients très malades et Aspergillus est rarement récupérable à partir du sang. Si des progrès considérables ont été accomplis dans l&#39;utilisation de la tomodensitométrie à balayage de la poitrine dans le diagnostic IPA, caractéristiques qui sont suggestifs de l&#39;IPA pulmonaires chroniques telles que le &quot;halo&quot; ou &quot;air-Croissant-Rouge&quot; signes sont soit transitoire ou peut être attribué à des artefacts respiratoires ou d&#39;autres infections fongiques 11,12. Ces données sont donc complétées par des techniques sérologiques visant à identifier des molécules de signature (GM et β-glucane) à partir de champignons qui circulent dans le sérum du patient ou qui sont présents dans les fluides, les expectorations ou BAL échantillons d&#39;urine 13. Bien que ces essais montrent une sensibilité satisfaisante, ils manquent de spécificité suffisante ou qui souffrent d&#39;interférences, sous certaines conditions 1,6 </sup&gt;. Le test LFD pour la détection IPA présentée ici permet de diagnostiquer le «point-of-care» de la technologie IAP et les exploits qui a été utilisé à ce jour dans les tests pour la détection de virus, bactéries, parasites et toxines 14-19 et, le plus célèbre, pour la grossesse à la maison teste la première fois par Unipath en 1988. Dans le LFD Aspergillus décrit ici, le Aspergillus AcM spécifique JF5 est immobilisé sur une zone de capture (la ligne de test) sur une membrane de nitrocellulose poreuse. Immunoglobuline anti-souris immobilisé sur la membrane dans une zone séparée servi comme témoin interne (conduite de commande). Le addition de sérum ou le liquide BAL à l&#39;orifice de relâchement, conjugué anticorps monoclonal or JF5-colloïdale dans le tampon de libération se lie à l&#39;antigène cible et le complexe passe ensuite le long de la membrane poreuse par action capillaire. AcM JF5 immobilisé dans la zone de capture se lie à l&#39;JF5-or colloïdal-antigène complexe résultant en une ligne de mesure rouge. Toute non liée JF5-or colloïdalconjugué se lie aux procédures de contrôle interne qui indique que le test a fonctionner correctement. Il en résulte une ligne de contrôle rouge. Le test est rapide, ne prenant que 15 minutes pour effectuer, n&#39;est pas cher par rapport à des tests sériques et BAL sur la base de GM et β-glucane de détection, et ne nécessite pas de matériel coûteux ou des installations de laboratoire approfondies à courir. En outre, MAb JF5 ne pas de réaction croisée avec les médicaments ou les contaminants qui ont été montrés pour causer de faux-positifs de réaction dans le MM et le β-glucane essais 1,4,6. Un avantage supplémentaire majeur par rapport aux tests de diagnostic actuels, c&#39;est la capacité SMMO pour détecter l&#39;activité qui est indicative de la croissance invasive des espèces d&#39;Aspergillus. Une étape cruciale dans la procédure LFD est la nécessité de lire les résultats 15 minutes après l&#39;application de l&#39;échantillon de sérum ou de BAL à l&#39;appareil. Le test ne doit pas être laissé pour plus de 15 minutes avant d&#39;enregistrer les résultats, car cela pourrait entraîner biais interpretatile. Une faible réaction ne sera pas renforcée par l&#39;extension de la période d&#39;incubation. Le traitement thermique de sérum à partir de modèles animaux d&#39;infection n&#39;a été trouvé pour améliorer la sensibilité du test. Une limitation de l&#39;essai, c&#39;est qu&#39;il est de nature qualitative, et s&#39;appuie sur l&#39;opérateur de procéder à une évaluation subjective de la positivité. L&#39;intensité de la ligne d&#39;essai varie selon les teneurs en antigènes d&#39;échantillons de sérum et BAL (Figure 1). Cependant, une réaction positive (déterminée par comparaison aux négatifs connus) indique la présence de l&#39;antigène d&#39;Aspergillus et donc l&#39;infection. Pour limiter la subjectivité des tests de LFD, les appareils portatifs sont disponibles qui permettent la quantification des intensités des raies LFD de test et de permettre à l&#39;établissement de valeurs seuils pour 20 détection de l&#39;antigène. Les développements futurs de la LFD comprennent sa commercialisation et le développement d&#39;un LFD multiplex qui permet la détection simultanée de pathogènes fongiques invasives autresen utilisant anticorps monoclonaux très spécifiques 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Université d&#39;Exeter </td><td></td><td> Disponible auprès de l&#39;auteur correspondant à la demande </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Autres sources de sérum de veau foetal peut être utilisé dans la préparation de la MTC </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

Aspergillose pulmonaire invasive (API) est une des principales causes de morbidité et de mortalité chez les patients une hémopathie maligne et hématopoïétiques bénéficiaires greffe de cellules souches 1. Détection de l&#39;IPA représente un formidable défi de diagnostic et, en l&#39;absence d&#39;un «gold standard», repose sur une combinaison des données cliniques et microbiologiques et l&#39;histopathologie lorsque cela est possible. Diagnostic de l&#39;IPA doit être conforme à l&#39;Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer et l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses Groupe d&#39;étude mycologie (EORTC / MSG) définissant un consensus &quot;prouvées&quot;, &quot;probable&quot;, et &quot;possible&quot; maladies fongiques invasives 2 . Actuellement, aucune base d&#39;acides nucléiques tests ont été validés à l&#39;externe pour la détection IPA et ainsi la réaction en chaîne par polymérase (PCR) n&#39;est pas inclus dans les critères diagnostiques actuels EORTC / MSG. Identification d&#39;Aspergillus dans les coupes histologiques est problématique en raison de Similarités des morphologies des hyphes avec d&#39;autres agents pathogènes fongiques invasives 3, et l&#39;identification éprouvée exige l&#39;isolement de l&#39;agent étiologique en culture pure. Culture des approches fondées sur compter sur la disponibilité d&#39;échantillons de biopsie, mais ceux-ci ne sont pas toujours accessibles chez les patients malades, et ne donnent pas toujours des propagules viables pour la culture lorsqu&#39;elle est obtenue. Une caractéristique importante dans la pathogenèse d&#39;Aspergillus est angio-invasion, un trait qui offre des possibilités pour suivre le champignon immunologiquement en utilisant des tests qui détectent caractéristiques antigéniques des molécules signatures dans le sérum et broncho-alvéolaire (LBA) des fluides. Cela a conduit à l&#39;élaboration de la immuno-enzymatique Platelia (GM-EIA) qui détecte Aspergillus galactomannane et un «pan-fongique&quot; test (test Fungitell) qui détecte la composante conservée paroi cellulaire des champignons (1 → 3)-β-D- glucane, mais pas dans les mucorales qui n&#39;ont pas cette composante dans leurs parois cellulaires 1,4. Estpoursuit autour de l&#39;exactitude de ces tests de 1,4-6 a conduit à la mise au point récente de la prochaine génération d&#39;anticorps monoclonaux (AcM) basés sur des tests qui détectent des marqueurs de substitution de l&#39;infection 1,5. Thornton 5 a récemment décrit la génération d&#39;un anticorps monoclonal spécifique d&#39;Aspergillus (JF5) en utilisant la technologie des hybridomes et son utilisation pour développer une immuno-chromatographie en phase latérale débit périphérique (LFD) pour le point-of-care (POC) le diagnostic de l&#39;IAP. Un avantage majeur de la LFD est sa capacité à détecter les activités du MAB depuis JF5 se lie à un antigène de glycoprotéine extracellulaire qui est sécrétée pendant la croissance active du champignon seulement 5. C&#39;est une considération importante lors de l&#39;utilisation des fluides tels que BAL du poumon pour le diagnostic de l&#39;IPA depuis spores d&#39;Aspergillus sont une composante commune de l&#39;air inhalé. L&#39;utilité de l&#39;appareil dans le diagnostic de l&#39;IAP a été démontrée en utilisant un modèle animal d&#39;infection, où le LFD affiché une sensibilité accrue et spécificationsificity par rapport à la GM Platelia et Fungitell (1 → 3)-β-D-glucane essais 7. Ici, nous présentons une procédure simple LFD pour détecter l&#39;antigène Aspergillus dans le sérum et les fluides humains BAL. Sa vitesse et sa précision fournit un complément roman au point de soins de test pour le diagnostic de l&#39;IPA chez les patients une hémopathie maligne.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Un rapide et précise au point de soins de test pour l&#39;aspergillose pulmonaire invasive est présentée. Il tire parti de la technologie de flux latéral en utilisant un anticorps monoclonal spécifique qui se lie à un<em&gt; Aspergillus</emAntigène&gt; sécrétée au cours des infections pulmonaires. Le dosage est compatible avec le sérum et le lavage brochoalveolar et représente un test complémentaire de roman pour le diagnostic des maladies.

Détection de l&#39;aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.8K vues.  University of Exeter. Un rapide et précise au point de soins de test pour l'aspergillose pulmonaire invasive est présentée. Il tire parti de la technologie de flux latéral en utilisant un anticorps monoclonal spécifique qui se lie à un Aspergillus sécrétée au cours des infections pulmonaires. Le dosage est compatible avec le sérum et le lavage brochoalveolar et représente un test complémentaire de roman pour le diagnostic des maladies.

Vidéo: Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Recherche

Immunologie et infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Technologie IgY: Extraction d&#39;anticorps de jaune d&#39;œuf de poulet par polyéthylène glycol (PEG) Précipitations

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

Détection de l&#39;antigène leucocytaire humain biomarqueurs du cancer du sein Utilisant la technologie des biocapteurs Sans étiquette

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Histologique Quantification pour déterminer la charge fongiques dans les poumons dans l’aspergillose expérimentale

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Base de détection ultrasensible des biomarqueurs à l’aide d’une empreinte moléculaire biocapteur capacitif

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...