Ce protocole peut être utilisé pour optimiser les concentrations de protéines et d’anticorps primaires dans une seule plaque d’analyse, et pour effectuer deux analyses à l’aide d’une seule préparation d’échantillon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de terminer 2 1/2 jours de travail en laboratoire, y compris l’analyse des données, en 3 1/2 heures. Cette technique fournit un format d’analyse à haut débit pour le développement d’un biomarqueur à base de sang pour la SLA et est une méthode idéale pour mener de grands essais cliniques.
Cette méthode peut fournir un aperçu des profils protéiques cibles pendant le pronostic de la maladie et peut faciliter la surveillance des effets des médicaments d’essais cliniques intéressants. Après avoir recueilli 100 microlitres de lysates de plaquettes humaines auprès de patients atteints de SLA et de sujets sains, remplissez des modèles générés à l’interne pour la disposition capillaire et la préparation de l’échantillon. La table de préparation du mélange de l’échantillon est dynamique et calculera automatiquement la quantité de volume à retirer de la source.
Placez tous les reagents d’analyse sur la glace. Sauf le pack standard, qui doit rester à température ambiante. Pour préparer le mélange maître fluorescent, ajouter 40 microlitres d’eau déionisée à un tube clair de TNT, et ajouter 20 microlitres de tampon échantillon 10X.
Et 20 microlitres de la solution préparée 400 millimolar DTT au tube rose du kit d’essai. Pour préparer l’échelle biotinylée, ajouter 16 microlitres d’eau déionisée, deux microlitres de tampon échantillon 10X et deux microlitres de la solution de TNT préparée de 400 milli molaires au tube blanc fourni dans le kit. Après un mélange doux, transférer la solution de l’échelle dans un tube PCR de 200 microlitres avant de lesénaturer.
Ajouter 1,5 microlitres de tampon échantillon 10X et 148,5 microlitres d’eau déionisée à un tube de microcentrifugeuse de 600 microlitres et vortex à mélanger, avant de placer le tube sur la glace. Ajouter les anticorps d’intérêt directement le diluant comme indiqué dans le tableau et rincer la pointe pipette plusieurs fois dans une solution homogène d’anticorps. Pour préparer le mélange d’échantillons capillaires, ouvrez tous les tubes PCR et ajoutez 1,6 microlitre aliquots de tampon d’échantillon fluorescent 5X à chaque tube comme indiqué dans le tableau à l’aide d’une technique de pipetage inversée.
Fermer immédiatement chaque tube au fur et à mesure que le tampon est ajouté. Lorsque tout le tampon a été ajouté, ouvrez tous les tubes et ajoutez un tampon d’échantillon de 0,1 X en volumes comme indiqué dans le tableau, fermant immédiatement chaque tube au fur et à mesure que le tampon est ajouté. Ensuite, ouvrez tous les tubes et ajoutez les échantillons de protéines comme indiqué dans le tableau et fermez immédiatement chaque bouchon de tube.
Lorsque tous les échantillons ont été ajoutés, centrifuger brièvement tous les tubes dans une centrifugeuse benchtop. Vortex pour mélanger et centrifuger les échantillons à nouveau. À la fin de la deuxième centrifugation, placer tous les tubes dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant.
Et dénominatez les échantillons dans les conditions indiquées. À la fin de la dénaturation, centrifugeuse, mélanger et centrifuger à nouveau les échantillons et placer tous les tubes dans une grille à tubes sur la glace. En utilisant la figure comme guide, ajouter 10 microlitres de streptavidine raifort peroxidase au puits D1, 10 microlitres de l’anticorps secondaire approprié aux puits D2 à D5, 10 microlitres d’anticorps diluants à chaque puits dans la rangée B et au puits C1, 10 microlitres de l’anticorps primaire approprié aux puits C2 à C25, cinq microlitres d’échelle biotinylée du tube PCR numéro un au puits A1 , trois microlitres d’échantillon aux rangées A2 à A25 et 15 microlitres de peroxyde de luminol fraîchement préparé à chaque puits de la rangée E.Pipetting le mélange d’échantillon et le reagent dans le petit puits dans les ordres corrects est essentiel au succès de l’expérience, ainsi il devrait être fait très soigneusement.
Ajouter ensuite 500 microlitres de tampon de lavage à chaque puits tampon de lavage désigné. Et faites tourner le contenu de la plaque par centrifugation. Pour effectuer l’analyse capillaire sur la plaque d’analyse, connectez l’analyseur capillaire au système en ligne et cliquez sur Instrument et Connectez-vous dans le logiciel d’analyseur.
Sélectionnez le numéro de série de l’instrument dans le menu popup et cliquez sur Connect. Sélectionnez l’onglet Analyse et sélectionnez Nouvelle analyse, entrez les paramètres d’analyse et enregistrez le nom et l’emplacement du fichier. Ensuite, confirmez que l’indicateur bleu clignotant dans l’analyseur est un bleu massif et retirez la cartouche capillaire de son emballage.
Retirez le joint protecteur de la plaque d’essai et observez visuellement les puits pré-remplis pour les bulles d’air. Placez la plaque d’analyse dans le porte-plaques et maintenez la cartouche capillaire en angle, insérez la cartouche dans la fente capillaire et fermez la porte de l’analyseur. Cliquez ensuite sur Démarrer dans le logiciel analyseur.
L’utilisation d’un mélange entier de lysate de plaquette dans l’essai peut réduire l’intensité de signal des protéines cibles et contribuer à un signal de fond élevé. Par conséquent, dans ce test, supernatant clair a été utilisé après la rupture des plaquettes. Une plage dynamique linéaire pour la concentration de protéine de cytosol de plaquette a été établie à 0.2 à 0.8 milligrammes par millilitre, et un modèle d’essai a été adopté de sorte que la concentration de protéine et la titration primaire d’anticorps aient pu être exécutées dans un essai simple.
Le profil de détection de plage dynamique élevé offre une plage dynamique significativement plus large en raison de la plus grande sensibilité de l’essai capillaire, ce qui permet une meilleure détection et quantification sur une plus grande plage de concentration d’échantillons. Les temps d’exposition individuels peuvent également être définis. En utilisant les conditions optimisées d’analyse, cette analyse des fractions cytosoliques de lysate de plaquette obtenues des patients de SLA utilisant deux ensembles d’anticorps permettent l’identification du TDP-43 spécifique à la maladie et de son dérivé phosphorylated dans les échantillons.
Le TDP-43 total pourrait alors être quantifié à l’aide de la courbe d’étalonnage. Et les variabilités intra et inter-run d’essai ont été examinées dans les fractions cytosolic humaines de plaquette de SLA poolées. Cette méthode permet l’utilisation d’anticorps primaires, facilitant l’identification de jusqu’à cinq protéines cibles différentes dans le même échantillon en une seule analyse.
Non seulement cette technique réduit considérablement le temps d’analyse des protéines, mais elle nécessite des volumes d’échantillons de microlitres et génère des résultats avec un degré élevé de reproductibilité. Certains des produits chimiques utilisés dans cet essai et tous les échantillons humains sont considérés comme biodangereux, de sorte que l’équipement de protection individuelle approprié doit toujours être utilisé lors de l’exécution de ces expériences.
