Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros à l&#39;Institut national sur la surdité et les troubles de communication. Un soutien supplémentaire a été fourni par NIDCD 5R01 DC007613.

1. Dissection utricule et de la Culture <ol><li> Euthanasier un adulte (âge de 4 semaines ou plus) de la souris en utilisant un protocole approuvé et décapiter. </li><li> Snip le conduit auditif externe sur les deux côtés de la tête et tirer la peau vers l&#39;avant en direction du nez. Bissecter la tête d&#39;arrière en avant et retirez le cerveau des deux côtés de révéler le labyrinthe osseux. </li><li> Coupez le crâne loin de la cochlée osseuse et à transférer le labyrinthe osseux (y compris la bulle) pour une hotte de culture de tissus équipé d&#39;un microscope à dissection (Remarque: le travail adénovirus doit être effectuée dans un cabinet de classe II de la sécurité biologique). </li><li> Dans la hotte, le transfert de chaque cochlée à une boîte de culture de tissu de 35 mm contenant milieux stériles dissection (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figure 1A). </li><li> Si la bulle auditive est encore intact (il est possible d&#39;enlever la bulle lors de la dissection brute en insérant votre vignette entre la bulle et le sommet dela cochlée), utilisez deux pinces (un n ° 3 et un n ° 5) à briser la bulle (figure 1B). </li><li> Identifier les points de repère de la préparation osseuse cochlée: osselets faîtières, de base, et de forme ovale et ronde, les fenêtres de la racine nerveuse, les canaux semi-circulaires VIIIe (figure 1 C, D). </li><li> Placez l&#39;oreille interne dans le plat avec le côté interne vers le haut, de telle sorte que l&#39;ovale et ronde et le sommet sont des fenêtres sur le fond du plat et la racine du nerf VIIIème vers le haut. Maintenez la préparation à l&#39;aide un # 3 pince dans la région des canaux semi-circulaires (figure 1D). </li><li> Avec un scalpel équipé d&#39;une lame n ° 11, couper le sommet de la cochlée juste apicale de la racine nerveuse (figure 1D). </li><li> Activer la préparation de sorte que la partie découpée est tournée vers le haut. Utilisez le canal semi-circulaire antérieure comme une poignée pour stabiliser la préparation (figure 1E). </li><li> En utilisant une pince n ° 5, retirez la cochlée aux modiolus basà la base. Au point où la région crochet de la cochlée tourne vers le bas, utilisez une sonde fine (la moitié d&#39;un cassées # 55 forceps) de lever la dernière tablette osseuse de la lame spirale osseuse (figure 1F), révélant le saccule. Juste en dessous du saccule est la platine de l&#39;étrier, qui est une étape importante. Le utricule est immédiatement adjacente à la platine de l&#39;étrier (figure 1G), et il est entouré par de l&#39;os. Utilisez la sonde pour ébrécher l&#39;os loin suffisant pour révéler au sujet de 1/3 de l&#39;utricule. Retirez soigneusement l&#39;utricule en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1H). Cette procédure se traduira généralement en retrait de l&#39;épithélium pigmenté de toit que l&#39;utricule est tiré de la préparation osseuse. Toutefois, si l&#39;utricule est enlevée avec de l&#39;épithélium toit intact, le toit peut être enlevé en utilisant une pince N ° 55. </li><li> Utricules de l&#39;infection à adénovirus (ou des expériences d&#39;imagerie vivantes) doivent avoir le otoconia enlevé lors de la dissection (avant l&#39;infection).Dans ce cas, utiliser une seringue luer-lock qui est rempli avec les médias de dissection et munie d&#39;une aiguille de petit calibre (généralement 26-28 gauge). Maintenez l&#39;utricule au bord en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1I). Apportez la pointe de l&#39;aiguille à proximité de l&#39;utricule avec le biseau de l&#39;aiguille pointant vers le bas. Utiliser un jet de disséquer les médias pour souffler la otoconia (Figure 1J). Alternativement, otoconia peut être éliminé par les brossant à l&#39;aide d&#39;un outil de cil (Ted Pella, Inc # 113). Utricules qui ne vont pas se soumettre à une infection adénovirale sont normalement cultivées flottant librement dans des plaques 24 puits de culture de tissus intacts à l&#39;otoconia (voir ci-dessous pour le post-fix retrait otoconia, qui est plus facile). </li><li> Une fois tous les utricules sont disséqués, changer les médias de dissection à la culture stérile des médias: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplémenté avec 5% de FBS et 50 U / ml de pénicilline G (Sigma). </li><li> Utricules sont cultivées à 37 ° C et 5% de CO 2. Si les cultures doivent être maintaminé pendant plus de 48 heures, la moitié des milieux de culture doivent être changés tous les jours. Les cultures peuvent être maintenues pendant une semaine ou plus. </li></ol> 2. Infection par un adénovirus de cellules de soutien Important: Travailler avec l&#39;adénovirus exige de niveau de biosécurité 2 (BSL2) les procédures et de certification. Vérifiez auprès de votre Agent de biosécurité institutionnelle d&#39;orientation et de formation sur les procédures BSL2. <ol><li> Disséquer utricules comme ci-dessus dans les médias de dissection (pas de sérum). Retirer otoconia comme ci-dessus. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à infecter, transférer 1 utricule (cellules ciliées le haut) dans chaque puits d&#39;une mini-bac Nunc (Fisher # 12-565-68) contenant 15 uL DMEM sans sérum F12 (ce qui est important, car le sérum peut inactiver le virus) . Ce transfert est plus facile avec un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 à partir des outils des sciences Beaux). </li><li> Notre Ad-GFP est de sérotype 5 avec les gènes viraux E1 et E3 supprimées et le promoteur du CMV humain de conduire l&#39;transgène (GFP). Ce virus a été obtenue à partir Vecteur BioLabs (Philadelphie, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus images sont fournies à des titres de 1,0 à 4,0 × 10 10 PFU / ml. Ajouter 0,5 à 2 pi de stock de virus à chaque puits contenant un utricule (Figure 1L). Le montant réel utilisé varie en fonction du titre du virus et le bouillon. Nous avons l&#39;habitude d&#39;infecter chaque utricule avec de 1,0 à 4,0 × 10 7 UFP. </li><li> Culture des utricules contenant le virus dans les médias à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 2 heures. Après 2 heures, transférer les utricules revenir à la plaque de 24 puits de culture de tissu contenant des milieux de culture avec du sérum. Culture des utricules nuit à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utricules peut être utilisé le lendemain pour des expériences d&#39;imagerie en direct, ou ils peuvent être fixés pour l&#39;immunochimie des cellules ciliées (voir ci-dessous). Virale augmente l&#39;expression du transgène dans le temps, si l&#39;expression du transgène est faible à 24 heures post-infection, il peutbénéfique pour les cellules en culture pendant 24 heures supplémentaires dans le sérum contenant les médias. Si vous voyez la toxicité cellulaire des cheveux, de réduire la quantité de virus utilisée. </li></ol> 3. Fixation utricule, enlèvement otoconia, et d&#39;immunochimie <ol><li> À la fin de la période de culture, fixer utricules dans du paraformaldéhyde 4% pour soit 3 heures à température ambiante (sur une plate-forme à bascule) ou une nuit à 4 ° C. Utricules de lavage (3 fois, 15 min chacune) dans 0,1 M (1X) pH Sorensen tampon phosphate 7,4. Ces étapes sont réalisées dans une plaque de 24 puits de culture de tissu. </li><li> Retrait otoconia: Remarque: otoconia doivent être retirés avant l&#39;infection adénovirus (voir l&#39;étape 1.11 ci-dessus). Cependant, utricules qui ne sont pas à être infecté peut être mis en culture et fixé à la otoconies intacte. Dans ce cas, utilisez les étapes décrites ici pour supprimer le otoconia après fixation. Inspectez utricules pour toute l&#39;épithélium pigmenté de toit restante. Retirez soigneusement tout épithélium toit restante en utilisant deux N ° 55 forceps. Pour retirer le otoconia, remplacer un tampon phosphate de Sorensen avec 750-1000 ul Cal-Ex détartrant (Fisher # CS510-1D). Laissez Cal-Ex sur utricules pendant 1 minute et 40 secondes (ne pas dépasser 2 minutes). Remplacer Cal-Ex avec un tampon phosphate 0,1 M Sorensen et de lavage (5 fois, 5 minutes chacun). </li><li> Incuber utricules dans le borohydrure de sodium (Sigma # 452882, 1% dans de l&#39;eau déminéralisée) pendant 10 minutes. Laver utricules dans un tampon phosphate 0,1 M Sorensen (5 fois, 5 minutes chacun). </li><li> Utricules Placer dans la Blocking Solution (PBS + 2% de sérum albumine bovine + 0,8% sérum de chèvre normal + 0,4% de Triton X-100) pendant 3 heures à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Ajouter des anticorps primaires et incuber une nuit à 4 ° C. Anti-myosine 7a (soit Proteus Biosciences # 25-6790 ou # MYO7A 138-1 du développement de la Banque études hybridome) au 1:100 dans le blocage de toutes les étiquettes solution cellules ciliées. Pour marquer séparément les cellules ciliées et non-striolar striolar, nous avons utilisé un Protoco double-étiquettel avec un anticorps monoclonal anti-calmoduline (Sigma # C 3545; 1:150) et polyclonaux anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, Californie, Etats-Unis; 1:200). Anticorps secondaire (généralement Alexa Fluor anticorps secondaires conjugués de Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis) sont dilués à 1:500 dans une solution de blocage et incubées pendant 4 heures dans l&#39;obscurité, à température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Utricules montage sur lames de verre en utilisant Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, États-Unis). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Utricules cultivés en utilisant cette méthode conserver la totalité des compléments de cellules ciliées et les deux cellules de soutien (Figure 2). Les cellules ciliées dans les cultures en bonne santé montrent rondes profils nucléaires entourées par de minces régions cytoplasmiques qui sont myosine 7a-positif (figure 2, panneau supérieur). Cellules de soutien (étiqueté anti-Sox2) sont plus petits et plus dense que les cellules ciliées (Figure 2, panneau inférieur). Adenovirus infecte 25-50% des cellules de soutien dans l&#39;utricule, et aucun des cellules ciliées sont infectées (figure 2, Ad-GFP panneaux). Il convient de noter que le titre de travail optimal de chaque adénovirus doit être déterminé de manière empirique, depuis la mort de cellules ciliées est possible si le titre viral est trop élevé. En outre, les régions de dommages mécaniques (causé lors de la dissection) aura de grandes quantités de virus. Ces régions de dommages mécaniques sont faciles à distinguer par une ligne continue de cellules avec des niveaux très élevés d&#39;expression de la GFP et les cellules ciliées manquantes. Ceci est en contraste à l&#39;expression de la GFP dans les cellules de soutien dispersée d&#39;une culture en bon état ​​(Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Utricule dissection. A: C La bulle est brisée par deux pinces robustes:. Auditif bulle (AB) B. Bony cochlée (RW = fenêtre ronde, S =. artère stapédienne, C = cochlée, ST = étrier) D: Une lame de scalpel (SB) est utilisé pour couper l&#39;apex de la cochlée apicale du nerf crânien VIII (8 N e) ASC = canal semi-circulaire antérieure E..: la préparation est maintenu fermement à l&#39;aide d&#39;une pince # 3 avec une fourche inséré dans le canal antérieure semi-circulaire (ASC) et l&#39;autre sur l&#39;os extérieur (flèches). Le labyrinthe membraneux est retiré avec une pince F:. Avec le labyrinthe membraneux enlevé, le tour basal de la lame spirale osseuse est visible près de la région du crochet. Une sonde fine est insérée sous ce plateau osseux pour soulever le plateau et retirez-le (la flèche) G:. Après élimination du saccule, utricule (U) est visible immédiatement adjacente à la platine de l&#39;étrier (SF) H:. Utricule (U ) est éliminée en utilisant une pince # 55 (flèche) SF = étrier platine I:.. utricule avec otoconia (O), partiellement éliminé und sensoriels épithélium (SE) au-dessous visibles J:. otoconia (O) sont retirés de la utricule l&#39;aide d&#39;un flux de média rendu par une seringue munie d&#39;une aiguille de calibre 26. L&#39;ombre de l&#39;aiguille (S) est visible au bas de l&#39;image K:. Utricule avec otoconies enlevé et épithélium sensoriel (SE) visibles L:. Infection adénoviral: chaque utricule (U) est placé dans un puits individuel d&#39;un mini- -bac. Cellules de soutien sont infectées par l&#39;adénovirus par pipetage virus dans le puits (P = pointe de la pipette). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Adénovirus infection de cellules de soutien. Utricules ont été infectées par l&#39;adénovirus expression motrice de la protéine fluorescente verte (GFP-annonce). Affichés sont des images confocales de la couche de cellules ciliées, et la couche de cellules de support dans la même zone d&#39;un utricule. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps contre la myosine 7a(Magenta). Cellules de soutien sont marquées avec un anticorps contre Sox2 (rouge). Le schéma suivant montre la structure de l&#39;épithélium sensoriel utricule et les emplacements des cellules ciliées (HC) et les cellules de soutien (SC). Emplacements des confocal (optique) sections indiquées dans la partie supérieure (U) et inférieure (L) des panneaux sont indiqués par des lignes en pointillés dans le schéma. Panneaux supérieurs: En images confocales prises au niveau des noyaux des cellules des cheveux, Ad-GFP signal apparaît dans les espaces entre les cellules ciliées et ne se chevauchent pas avec le 7a cellules ciliées myosine marqueur. Des panneaux inférieurs: Dans les sections confocales au niveau des noyaux cellulaires de support, Ad-GFP signal de colocalisée avec le marqueur de cellules de support Sox-2. L&#39;infection Ad-GFP dans l&#39;expression de la GFP dans des cellules de soutien seulement, et pas les cellules ciliées sont infectés. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Infection adénovirale n&#39;entraîne pas la mort des cellules ciliées ou des cellules de soutien. Utricles ont été infectées avec Ad-GFP à 4 × 10 8 UFP / ml. Utricules ont été marqués avec des anticorps contre la myosine 7a (marqueur des cellules de cheveux) et Sox2 (soutien marqueur de cellule). Des cellules ciliées et numération des cellules de soutien étaient égaux pour utricules de contrôle et Ad-GFP utricules infectés.

<ol>
	<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death.">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li><li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate.">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li><li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+(Danio+rerio)+lateral+line+and+mouse+(Mus+musculus)+utricle.">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li><li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity.">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li><li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death.">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li><li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+death+and+regeneration:+two+halves+of+the+same+equation.">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li><li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail.">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li><li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro.">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li><li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+activation+of+ERK1/2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium.">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li><li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin.">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li><li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo.">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li><li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death.">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li><li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage.">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li><li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia.">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells.">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li><li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+(HSP32).">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors,+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment,+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss.">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li><li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear.">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li><li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury.">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cellules ciliées sensorielles sont sensibles à la mort causée par une variété de stress, notamment le vieillissement, traumatisme sonore, et l&#39;exposition à des médicaments ototoxiques, y compris les antibiotiques aminoglycosides et le cisplatine agent antinéoplasique. Dans les résultats mammifères cheveux de la mort cellulaire dans la perte d&#39;audition permanente et / ou perturbation de l&#39;équilibre. Dans les systèmes de modèle in vitro sont des outils essentiels pour les études...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongLe numéro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdMedium&gt; 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Beaux-pince (# 55)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Beaux-pince (# 5)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pince (# 3)</td&gt;<td&gt; Outils belle science</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La pénicilline G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Le sérum fœtal bovin</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-bac</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adénovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vecteur Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex détartrant</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdBorohydrure de sodium&gt;</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-myosine 7a (polyclonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-myosine 7a (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Études de développement de la Banque d&#39;hybridome</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calmoduline</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tableau 1</strong&gt;. Réactifs et les outils utilisés dans la culture utricule et infection par un adénovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Remarque: Ad-GFP est normalement fournie par Biolabs Vecteur à un titre de stock de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Nous avons demandé une amplification personnalisée afin de fournir le stock de virus à un titre de 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

La perte d&#39;audition et de troubles de l&#39;équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécano, qui sont les cellules réceptrices de l&#39;oreille interne. Comme il n&#39;y a pas de ligne de la cellule qui représente de façon satisfaisante les cellules ciliées de mammifères, de la recherche sur les cellules ciliées se fonde sur les cultures d&#39;organes primaires. Le mieux caractérisé dans le système modèle in vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d&#39;organes de utricules de souris adultes (Figure 1) 1-6. L&#39;utricule est un organe vestibulaire, et les cellules ciliées de l&#39;utricule sont semblables dans les deux à la structure et la fonction des cellules ciliées de l&#39;organe auditif, l&#39;organe de Corti. La préparation utricule souris adultes représente un épithélium sensoriel maturité pour les études des signaux moléculaires qui régulent la survie, l&#39;homéostasie, et la mort de ces cellules. Mammifères cellules ciliées cochléaires sont définitivement différenciés et ne sont pas régénérés quand ils sont perdus. En non-mamvertébrés maliens, auditif ou vestibulaire de la mort des cellules ciliées est suivie d&#39;une régénération robuste qui rétablit les fonctions auditives et l&#39;équilibre 7, 8. La régénération des cellules de cheveux est médiée par la glie-comme les cellules de soutien, qui sont en contact les surfaces basolatérale des cellules ciliées de l&#39;épithélium sensoriel 9, 10. Cellules de soutien sont aussi des médiateurs importants de la survie des cellules ciliées et de la mort 11. Nous avons récemment développé une technique pour l&#39;infection des cellules de soutien dans les utricules cultivées en utilisant des adénovirus. Utilisation adénovirus de type 5 (dE1/E3) pour fournir un transgène contenant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV, nous constatons que l&#39;adénovirus spécifiquement et efficacement infecte les cellules de soutien. Soutenir l&#39;efficacité infection de la cellule est d&#39;environ 25-50%, et les cellules ciliées ne sont pas infectés (Figure 2). Surtout, nous constatons que l&#39;infection adénovirale de cellules de soutien n&#39;entraîne pas de toxicité pour les cellules ciliées ou des cellules de soutien, comme nombre de cellules dans Ad-GFP infutricules ecté sont équivalentes à celles en situation de non-infectés utricules (Figure 3). Ainsi l&#39;expression des gènes adénovirus dans des cellules de soutien de utricules culture fournit un outil puissant pour étudier les rôles des cellules de soutien en tant que médiateurs de la survie des cellules des cheveux, la mort et la régénération.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection at JoVE.com

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l&#39;oreille interne. Le mieux caractérisé<em&gt; In vitro</emSystème modèle&gt; de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d&#39;organes de utricules de souris adultes. Nous présentons la dissection de l&#39;utricule souris adulte, et nous démontrons adénovirus infection de cellules de soutien dans les utricules culture.

La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K vues.  Medical University of South Carolina. Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Le mieux caractérisé In vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes. Nous présentons la dissection de l'utricule souris adulte, et nous démontrons adénovirus infection de cellules de soutien dans les utricules culture.

Vidéo: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Recherche

Neurosciences

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Moulage cérébrovasculaire de la souris adulte pour l&#39;imagerie 3D et l&#39;analyse morphologique

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Dissection cryo-section de la zone sous-épendymaire adulte pour une analyse quantitative précise et approfondie du protéome

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Enrichissement de cultures de neurones ganglionnaires de la racine dorsale de souris adultes par immunopanoramique

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...