La recherche oculaire dans les premiers temps reposait principalement sur le tissu oculaire d’individus décédés. Cependant, au fil des ans, de nombreux modèles ophtalmiques de rongeurs ont été développés et le besoin de tissu oculaire humain a diminué. En raison de la petite taille et de la zone d’opérations limitée dans l’œil du rongeur, l’accès effectif aux sous-parties oculaires est sévèrement limité.
Typiquement, pour opérer sur l’œil d’un rongeur, l’œil est immobilisé via le nerf optique et la dissection est effectuée. Cette pratique est ardue et peut endommager le tissu fragile car l’œil sphérique continue de bouger pendant la dissection. Bien qu’elle soit bénéfique pour isoler les différentes sections des couches rétiniennes, cette technique ne peut pas délimiter l’orientation spatiale du tissu lors de la dissection du tissu.
De plus, une intervention ciblée est difficile à localiser après la dissection en raison de l’assemblage cellulaire homogène de la cupule postérieure et antérieure. Dans cette vidéo, une méthode chirurgicale modifiée pour la microdissection est démontrée. La présence de la membrane nictitante attachée, ou troisième paupière, présente des avantages uniques et significatifs.
Dans cette méthode, le globe oculaire est d’abord énucléé avec la troisième paupière, puis la troisième paupière est utilisée pour immobiliser l’œil. Il est suivi par le perçage du globe oculaire à travers le limbe cornéen, et l’incision est utilisée comme point d’entrée. Ensuite, en coupant le long de la circonférence, les œillets antérieurs et postérieurs sont séparés.
En disséquant davantage la coupelle postérieure de l’œillet, la couche translucide de la rétine neurale est identifiée et délicatement décollée. Les couches neuronales et RPE sont ainsi obtenues pour un traitement ultérieur. La troisième paupière nous permettra de délimiter l’orientation spatiale de l’œil après l’énucléation.
Suivons maintenant la procédure détaillée étape par étape. Dilatez les yeux des rongeurs à l’aide d’une goutte de solutions ophtalmiques à 0,8% de tropicamide et à 5% de phényléphrine et placez l’animal dans une zone sombre pendant 30 minutes avant l’intervention. Euthanasier l’animal en lui administrant par voie intrapéritonéale cinq doses d’anesthésie.
Une dose typique est de 200 microlitres de PBS contenant 10 mg de kétamine et un mg de xylazine. Confirmez l’absence totale de réponse au stimulus en examinant le réflexe de pédale. Placez la souris en position couchée latérale pour permettre un accès complet à l’œil.
Gardez une pince de suture Colibri, une pince incurvée, une micro-lame de 15 degrés de taille de trois millimètres, des micro-ciseaux à ressort et un micro-ciseau à ressort incliné prêts pour la procédure. Placez une pince incurvée autour du globe oculaire et pincez pour libérer l’œil des attaches étrangères. La troisième paupière, également connue sous le nom de membrane nictitante, est située vers le coin supérieur de la tangente nasale et peut être identifiée comme une protubérance translucide mineure avec des limites pigmentées.
Ensuite, utilisez un micro-ciseau à ressort et coupez autour du globe oculaire. De petites coupures continues libèrent le globe oculaire des attaches sclérales. Placez un micro-ciseau à ressort incurvé sous le globe oculaire pour libérer l’œil en coupant le nerf optique.
Placez l’œil énucléé dans une boîte de Petri contenant un tampon PBS de sorte que le globe oculaire soit immergé dans le PBS. Certains muscles ou tissus extraoculaires commenceront à flotter loin du globe oculaire. Retirez-les en les coupant du globe oculaire à l’aide de micro-ciseaux à ressort.
Ensuite, retirez le nerf optique de la base du globe oculaire pour permettre une meilleure séparation de la rétine pour les préparations complètes. Il n’est pas nécessaire de retirer le nerf optique pour la section des tissus. Transférer le globe oculaire dans un tube de 1,5 ml contenant un ml de paraformaldéhyde ou PFA à 4%.
Conservez-le pendant deux heures à quatre degrés Celsius pour la fixation des tissus. Il est possible de faire une pause à cette étape en laissant le tissu dans le PFA jusqu’à 12 heures à quatre degrés Celsius. Cependant, pour l’isolement des cellules vivantes, les étapes de fixation ne doivent pas être effectuées et l’ensemble de la procédure doit être effectué en continuum.
Après la fixation du PFA, transférez le globe oculaire dans une boîte de Petri contenant du PBS et placez-le sous un microscope à dissection pour effectuer la procédure suivante. Immobiliser le globe oculaire en maintenant fermement la troisième paupière enfoncée avec la pince à suture Colibri. Le limbe est la jonction sclérale cornéenne.
Faites une petite incision au limbe en le perçant à l’aide d’une microlame. L’incision est faite de préférence en face de la troisième paupière. Ensuite, en utilisant cette incision comme point de départ, avec le micro-ciseau faire de petites coupures continues le long de cette circonférence du limbe scléral cornéen.
Tout d’abord, complétez un demi-cercle de coupures à partir du point d’incision jusqu’à la troisième paupière. Ensuite, complétez le demi-cercle de coupes restant de l’autre côté. Enfin, faites une coupe autour de la troisième paupière pour séparer la coupe postérieure et la coupe antérieure.
Retirez la lentille de la cupule postérieure à l’aide d’une pince pour obtenir la cupule postérieure comprenant la rétine neurale et la couche RPE et la cupule antérieure cornéenne. Si vous travaillez avec des tissus non fixés, les cupules antérieure et postérieure peuvent maintenant être digérées enzymatiquement pour obtenir une suspension unicellulaire cornéenne ou rétinienne. Pour fixer les tissus, transférer ces tasses dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PFA à 4% pendant 12 heures à quatre degrés Celsius.
Après la fixation, le tissu peut être incorporé dans un milieu approprié et une cryosection ou une section de paraffine peut être effectuée pour obtenir des coupes cornéennes ou rétiniennes. Réintroduisez la coupe postérieure dans la boîte de Petri contenant le tampon PBS. Une couche opaque sur la couche pigmentée d’EPR est la rétine neurale.
Décollez la rétine neurale à l’aide d’une deuxième pince. Un mouvement très doux et léger de la main est fortement recommandé pour ne pas endommager le tissu. Au niveau du nerf optique, à la sortie, les ciseaux à ressort incurvés peuvent être insérés sous la rétine neurale, et une coupe peut être faite pour libérer complètement les couches si la rétine neurale reste attachée.
La rétine peut également être libérée ou détachée en la caressant doucement avec une brosse douce. Réintroduisez les coupes antérieure et postérieure dans la boîte de Petri contenant le tampon PBS. Utilisez un micro-ciseau à ressort incliné pour faire une coupe à côté de la troisième paupière de la périphérie perpendiculairement vers le centre optique.
Maintenez une prise de la troisième paupière et faites une coupe à côté de la première coupe. Faites une coupe similaire entre la deuxième coupe et la troisième paupière. Trois ou quatre coupes équidistantes ouvrent les coupes hémisphériques en une forme de fleur, qui tombe à plat et peut être facilement montée.
Ne faites pas de coupes très profondes jusqu’au centre de la tasse, car cela pourrait faire en sorte que les sections de feuilles se désagrègent ou se séparent facilement. Le milieu liquide permet à la coupelle antérieure de l’œil d’atteindre une structure incurvée. Suivez les mêmes étapes que celles données pour faire des coupes sur la coupe postérieure pour faire trois ou quatre coupes équidistantes sur la coupe antérieure.
Les tissus sont maintenant prêts pour une coloration supplémentaire. Dans cette figure, l’ensemble de la coupe antérieure est montré. Le tissu cornéen a été microdisséqué comme décrit pour révéler les vaisseaux lymphatiques dans le tissu conjonctival attaché du feuillet cornéen.
Dans cette figure, l’ensemble de la rétine neurale est montré. Le système vasculaire rétinien de la rétine neurale a été coloré à l’isolectine et est visible sous forme de vaisseaux verts. Dans cette méthode, le globe oculaire énucléé des souris est obtenu avec la troisième paupière attachée pour une manipulation efficace et facile.
La troisième paupière immobilise complètement le globe oculaire et permet à la dissection de se dérouler avec facilité et un minimum d’erreurs. Cette méthode est avantageuse pour la section spécifique du tissu oculaire, l’analyse unicellulaire et les montages entiers. Cependant, la nécessité d’une fixation tissulaire répétitive rend le tissu non viable pour la culture cellulaire ou de telles nécessités de cellules vivantes.
Par conséquent, la procédure doit être effectuée dans un continuum pour l’isolement des cellules vivantes.
