Nous avons développé un protocole rapide et efficace pour générer des organoïdes du cancer de la vessie via l’édition génique ex vivo de cellules urothéliales normales de souris porteuses d’allèles floxés dans des gènes d’intérêt. Cette méthode ex vivo a un flux de travail d’une à deux semaines au lieu d’années d’élevage de souris, et elle est très efficace dans la transduction des adénovirus sur les délétions de gènes médiées par Cre. Pour commencer, préparez tous les instruments et réactifs stériles, y compris les ciseaux, les pinces, le DPBS dans des plats de culture de 35 millilitres, l’éthanol à 70%, la gaze et les serviettes en papier propres.
Ensuite, nettoyez toutes les surfaces de la zone de dissection et couvrez la zone de dissection avec une serviette en papier propre. Placez la souris euthanasiée sur la gaze dans la zone de dissection et vaporisez de l’éthanol à 70% sur l’abdomen de la souris, puis à l’aide de ciseaux de dissection stériles, faites une incision abdominale médiane inférieure pour exposer la vessie. Maintenant, utilisez la pince pour saisir et tirer doucement la vessie vers le haut pour identifier la jonction urétérovésicale bilatérale.
À l’aide de ciseaux, retirez le fond d’œil de la vessie, en suivant la ligne de démarcation entre les deux ouvertures de l’uretère et transférez la vessie dans un plat stérile contenant 2 millilitres de DPBS, puis retirez le tissu adipeux et conjonctif et mettez la vessie dans un nouveau plat contenant 2 millilitres de DPBS. Retirez également l’adénovirus de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius et conservez-le sur la glace. Pour la dissociation cellulaire, préparez tous les instruments et réactifs stériles tels que décrits dans le manuscrit, puis dans une armoire de biosécurité, transférez la vessie dans un plat de 35 millimètres et lavez-le avec 2 millilitres de DPBS stérile.
Recueillir les tissus de la vessie de quatre souris dans un plat avec un millilitre de milieu de culture complet sans FBS dépouillé de charbon de bois. Ensuite, à l’aide d’une lame chirurgicale, hachez chaque vessie en quatre morceaux égaux, puis à l’aide d’une pince, dépliez la vessie pour exposer la surface de l’urothélium au milieu. Transférer les morceaux de vessie et le milieu dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Lavez le plat deux fois avec 2 millilitres de milieu de culture complet sans FBS dépouillé de charbon de bois et ajoutez le lavage au tube de centrifugeuse, ce qui porte le volume total à 5 millilitres. Ensuite, ajoutez un mélange de collagénase et de hyaluronidase et placez le tube horizontalement dans un incubateur à agitateur orbital de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 200 tr / min. Après la digestion des tissus, ajouter un volume égal de FBS et de DPBS dépouillés à 10% de charbon de bois dans le tube et centrifuger à 200 fois g pendant 5 minutes.
Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 2 millilitres de substitut de trypsine dans la pastille cellulaire et mélangez bien, puis incubez le tube à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 4 minutes. Après l’incubation, pipettez les cellules de haut en bas 10 fois avec une pointe P1000 standard et ajoutez 5 millilitres de FBS et DPBS dépouillés à 10% de charbon de bois. Filtrer les cellules dissociées à travers une passoire cellulaire stérile de 100 micromètres et recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 200 fois g pendant 5 minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de culture complet. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquer 0,5 fois 10 à la 6ème cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 0,5 millilitre de milieu de culture complet frais.
Ensuite, retirez les extraits matriciels de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm du stockage à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les sur la glace. En outre, préchauffer une plaque de 6 puits dans un incubateur de cellules de 37 degrés Celsius. Pour la transduction adénovirale, ajouter 2 microlitres d’adénovirus dans la plaque de 24 puits et bien mélanger avec les cellules urothéliales dissociées.
Pour améliorer l’efficacité de la transduction, effectuez la spinoculation en centrifugant la plaque à 300 fois g pendant 30 minutes, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 1 heure. Transférer les cellules et le milieu du puits dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 200 fois g pendant 5 minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 50 microlitres de milieu de culture complet et mélangez bien avec les cellules au fond.
Ensuite, ajoutez 140 microlitres d’extrait de matrice et mélangez bien doucement pour éviter les bulles d’air, puis créez des dômes pour les organoïdes en ajoutant rapidement 50 microlitres de la solution par dôme dans la plaque préavertée à 6 puits. Incuber la plaque et laisser les dômes se solidifier pendant 5 minutes. Après 5 minutes, retournez la plaque à 6 puits à l’envers et poursuivez la solidification pendant 25 minutes supplémentaires.
Après l’incubation, ajouter 2,5 millilitres de milieu de culture complet à chaque puits et placer la plaque dans un incubateur pour la culture organoïde. La protéine fluorescente verte a été détectée dans près de 100% des cellules, suggérant une grande efficacité de la transduction de l’adénovirus. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et l’immunohistochimie des tumeurs organoïdes triple knockout ont montré la morphologie du carcinome urothélial de haut grade avec une expression protéique positive des marqueurs de sous-type basal de CK5 et p63.
Les allèles floxés non recombinés ont été détectés dans les cellules urothéliales, non traités avec l’adénovirus, tandis que les allèles recombinés ont été observés dans les organoïdes triples knockout. En général, 2 à 3 semaines ont été nécessaires pour former une tumeur sous-cutanée de 2 centimètres. L’immunohistochimie des organoïdes triple knockout, les xénogreffes in vivo, a montré une expression positive des protéines CK7, CK5 et p63.
Une expression négative a été détectée pour les protéines CK8 et uroplakine. Le marqueur de mésenchyme, la vimentine, n’a été détecté que dans la capsule tumorale ou stroma. La dissociation de la vessie de la souris ne doit pas dépasser 30 minutes.
Un temps de dissociation plus long peut augmenter dans le pourcentage de cellules stroma, telles que les cellules endothéliales et les fibroblastes Cette approche peut être combinée avec le tri cellulaire ou le type cellulaire d’un adénovirus spécifique pour générer le type cellulaire d’organoïdes spécifiques, tels que la lumière par rapport aux organoïdes basaux.
