Les auteurs tiennent à remercier Lloyd Ung pour contribuer de façon constructive dans les premières versions de cette technique, le Dr Jeremy Agresti pour obtenir des conseils de conception de chapeau de pression, et le Dr Dongping Qi pour son aide dans la fabrication du bouchon de pression. Nous sommes reconnaissants envers les laboratoires de M. Teitell et P. Gunaratne pour fournir une variété d&#39;échantillons de cellules pour des tests. Nous sommes reconnaissants à la National Science Foundation (CARRIÈRE Prix DBI-1254185), l&#39;UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, et le UCLA clinique et translationnelle Science Institute pour soutenir ce travail.

1. microfluidique périphérique Conception REMARQUE: La conception de l&#39;appareil dispose de quatre zones fonctionnelles de base: port d&#39;entrée, filtre cellulaire, matrice de constriction, et les ports de sortie (Figure 1). La conception générale peut être appliquée à un large éventail de types de cellules, avec des modifications mineures aux dimensions. Pourvu voici quelques recommandations de conception de base ainsi que les paramètres de l&#39;appareil qui sont efficaces pour une sélection de deux cellules primaires et immortalisés. <ol><li> Sélectionner la largeur de la matrice de canaux d&#39;étranglement (figure 1B) à environ 30 à 50% du diamètre moyen des cellules; cette taille résultats constriction rapport à cellule à cellule de déformation importante mais encrassement minimal. Compte tenu d&#39;un type de cellule qui n&#39;a pas encore été testé, il est prudent de concevoir une gamme de largeurs de constriction de ~ 30-50% du diamètre de la cellule pour trouver la largeur optimale. Comme pour de nombreux types de dispositifs microfluidiques, plus de 120 moules maîtres de l&#39;appareil peuvent être modelés sur un péchégle tranche de silicium de 4 pouces, ce qui permet une gamme de différents modèles d&#39;appareil devant être fabriqué dans un processus de fabrication unique. </li><li> Sélectionner la hauteur du canal à au moins 50% du diamètre de la cellule; ce qui garantit la cellule est limitée en 2 dimensions. Pour empêcher l&#39;effondrement de canal pendant la liaison, à ce que le rapport d&#39;aspect du canal n&#39;est pas inférieure à 01 heures 10 (hauteur: largeur) à travers le dispositif. Pour les canaux qui doivent dépasser ce ratio d&#39;aspect, ajouter les messages de soutien pour éviter l&#39;effondrement. soutien de l&#39;espace postes à une distance qui est au moins deux fois le diamètre de la cellule pour ne pas empêcher l&#39;écoulement de cellules. </li><li> Inclure un filtre dans les ports d&#39;entrée pour éliminer les débris et ventiler les amas de cellules (figure 1B). Ajuster la taille et l&#39;espacement des postes de filtre de sorte que la distance séparant les postes est sensiblement égale à un diamètre de la cellule. REMARQUE: La limite inférieure de la taille de l&#39;élément est définie par la résolution à laquelle le masque de lithographie est imprimée. Veiller à ce que toutes les fonctions sont dans les reslimite de olution spécifiée par le fournisseur de masque. </li></ol> 2. fournitures et préparation REMARQUE: Avant de commencer toute expérience, les éléments suivants doivent être préparés. Un schéma de l&#39;ensemble de l&#39;installation est donné dans la figure 1. <ol><li> Fabriquer le maître de l&#39;appareil en utilisant des techniques standard de micro-usinage lithographique 14,15. Vérifiez la hauteur des fonctions répétées à l&#39;aide d&#39;un profilomètre. NOTE: Bien que les maîtres peuvent être facilement fabriqués dans une salle blanche, certains laboratoires ont développé des méthodes de lithographie peu coûteux pour une utilisation dans un environnement semi-propre 16,17. </li><li> Préparez la source d&#39;air pour un débit commandé par la pression, en utilisant un réservoir d&#39;air et la séquence des régulateurs d&#39;air et les raccords (figure 1A) comprimé. <ol><li> Mettre en place un réservoir d&#39;alimentation en air et le régulateur manuel. Remarque: Une composition de 5% de CO 2 dans l&#39;air maintient un environnement similaire à un incubato typique de culture de cellulesr, mais d&#39;autres mélanges de gaz peuvent également être utilisés. </li><li> Mettre en place un régulateur de pression à commande électronique en ligne avec le régulateur manuel. Utilisation d&#39;un convertisseur électro-pneumatique pour réguler et maintenir une chute de pression à travers les canaux stable, avec une fluctuation de moins de 2 kPa de pression. Utilisez le code simple écrit en LabVIEW (Renseignements supplémentaires) à l&#39;entrée de la pression désirée. NOTE: Le convertisseur électro-pneumatique utilise une boucle de réaction interne pour régler la pression de sortie de la vanne en fonction de la pression déterminée dans le dispositif microfluidique. </li><li> Mettre en place une chambre sous pression pour entraîner l&#39;écoulement de la suspension de cellules. Assembler une chambre de suspension cellulaire sur un cytomètre de flux type tube et un bouchon usiné qui crée un joint étanche à la pression sur le tube. Remarque: le couvercle de la chambre de pression contient deux orifices: un orifice d&#39;entrée qui relie le réservoir d&#39;air comprimé, et une sortie par laquelle les cellules s&#39;écouler de la chambre sous pression dans le dispositif (Figure 2). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une caméra qui a un taux d&#39;acquisition d&#39;au moins 100 images par seconde pour capturer des images de cellules s&#39;écoulant à travers la matrice d&#39;étranglement. Interface de l&#39;appareil photo avec une carte de capture vidéo et un ordinateur. </li><li> Préparer une solution mère de l&#39;agent tensio-actif de 10% en poids / poids de Pluronic F-127 dans du tampon phosphate salin (PBS), que l&#39;ajout d&#39;une petite quantité de F127 à la solution de milieu cellulaire permettra de réduire au minimum l&#39;adhésion des cellules aux parois PDMS. Pour préparer la solution de F127, vortex et chauffer doucement à 37 ° C pour dissoudre le F127. Avant l&#39;utilisation, passer la solution à travers un filtre seringue de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer la solution de tensioactif à l&#39;avance que vortex et le filtrage va générer des bulles qui persisteront pendant plus de 24 heures. </li></ol> 3. microfluidique fabrication de périphériques <ol><li> Fabriquer bloc PDMS avec des canaux microfluidiques. <ol><li> Mix PDMS bien unta rapport de 1:10 (p / p) d&#39;agent de durcissement à base. </li><li> Verser le mélange sur la base de l&#39;appareil (étape 2.1). Degas dans une cloche sous vide appliquée jusqu&#39;à ce que les bulles piégées disparaissent, ou pour environ 10-20 min. REMARQUE: Passé ce délai, il peut encore être bulles à l&#39;interface air-PDMS, ce qui est normal; ceux-ci seront généralement dissiper pendant la cuisson. Il est plus important de s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles adjacentes pour les canaux restants. </li><li> Cuire le dispositif dégazé à 65 ° C pendant 4 heures. Pour empêcher l&#39;effondrement de canaux, le dispositif de cuisson pendant une nuit pour réticuler davantage les PDMS pour un dispositif ayant un module élastique plus élevé qui est plus résistant à l&#39;effondrement canal. Toutefois, notez que la cuisson prolongée fragilise également les PDMS et peut conduire à la fissuration lors de la perforation des trous (étape 3.3). </li></ol></li><li> Retirer des dispositifs microfluidiques du moule maître. Couper dispositifs microfluidiques individuels sur le bloc de PDMS avec une lame de rasoir et retirez l&#39;appareil du mâter. Commencez par soulever délicatement un coin du dispositif; pelage doux et lent, par opposition à la levée du bloc de PDMS vers le haut, réduit le stress sur les deux PDMS et le maître. </li><li> Percez des trous dans le dispositif PDMS afin de créer des ports de connexion pour l&#39;accès des tubes et des microcanaux. Créer trous à l&#39;aide d&#39;un poinçon de biopsie, et le punch d&#39;un côté de la voie par le biais de la face extérieure de l&#39;appareil. REMARQUE: Un poinçon de biopsie avec un diamètre d&#39;alésage de 0,75 mm crée des trous que l&#39;interface parfaitement avec la polyétheréthercétone (PEEK), un tube (diamètre extérieur = 1/32 &quot;ou 0,79 mm) ou un tube de polyethylene (PE-20, diamètre extérieur = 0,043&quot; ou 1,09 mm ). Utilisez un anneau de lumière pour aider à visualiser des trous dans les dispositifs de canaux peu profonds 18. Assurez-vous que le poinçon de biopsie est forte; après usage répété la fine pointe s&#39;émousse et le poinçon de biopsie doit être jeté et remplacé. </li><li> Rincer le dispositif PDMS avec de l&#39;isopropanol (qualité HPLC) pour enlever la poussière et déposées morceaux de PDMS. Assurez-vous que laperforations sont libres de débris en dirigeant un flux régulier de l&#39;isopropanol pur à partir d&#39;un flacon souple à travers les trous. Sécher avec de l&#39;air filtré. Après le nettoyage, placer des cales PDMS avec chaînes face vers le haut dans un plat propre Petri pour maintenir la propreté de l&#39;appareil. Si nécessaire, des dispositifs de stockage sous cette forme jusqu&#39;à liaison. </li><li> Nettoyer le substrat de verre par un rinçage avec du méthanol (qualité HPLC), sécher avec de l&#39;air filtré, et le placer sur une plaque de cuisson à 200 ° C pendant 5-10 min à assurer la vitre est bien propre et sec avant traitement par plasma. NOTE: Le substrat de verre formant le fond de chaque canal. Typiquement, une lame de verre suffit, car un objectif 10X ou 20X est idéal pour l&#39;imagerie de plusieurs canaux en parallèle. Aux images à haute résolution, lier l&#39;appareil à une lamelle (# 1.5 épaisseur). </li><li> Coller le dispositif PDMS sur le substrat de verre. <ol><li> traiter le plasma d&#39;oxygène du côté de canal du bloc PDMS et d&#39;une face d&#39;une lame de verre. REMARQUE: Wvec un dispositif de décharge à main, en utilisant un temps de 1 min de traitement, mais optimiser le temps de traitement pour chaque appareil de plasma d&#39;oxygène. </li><li> Placer le côté du canal de PDMS sur le dessus de la face traitée du verre immédiatement après le traitement. </li><li> Maintenez avec une légère pression pour ~ 10 sec pour favoriser la liaison. Cuire l&#39;ensemble du dispositif à une température élevée (60-80 ° C) pendant au moins 15 min pour améliorer la force de liaison. </li></ol></li></ol> 4 Déformation cellules par des canaux rétrécie <ol><li> Inspectez le dispositif microfluidique sous un microscope. Veiller à ce que les canaux ne sont pas effondrés ou cassées et que les deux trous d&#39;entrée et de sortie se connectent directement dans les canaux de l&#39;appareil en utilisant un objectif de faible puissance (10X). Désigner les appareils défectueux en marquant la surface du PDMS avec une lame de rasoir et ne pas les utiliser pour des expériences. </li><li> Préparation des échantillons de culture cellulaire à doser. des cellules de culture en utilisant des conditions standard. <ol><li> Faou par exemple, la culture des cellules HL-60 dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec une solution de pénicilline-streptomycine à 1% et du sérum de veau fœtal à 10% dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C. </li><li> Pour les cellules adhérentes, les récolter par traitement à la trypsine et remettre en suspension dans un milieu de croissance frais. Utilisez un protocole de traitement à la trypsine norme; par exemple, ajouter environ 0,5 ml de trypsine dans un ballon de 25 cm 2 de la culture, et remettre en suspension dans ~ 30 ml de milieu frais. Différencier les cellules HL-60 en cellules de type neutrophile par tout-trans rétinoïque (ATRA) à une concentration finale de 5 uM à 1 x 10 5 cellules / ml comme décrit précédemment 19,20. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min, soigneusement aspirer les cellules du surnageant et remettre en suspension à la densité finale appropriée dans un milieu de culture frais, avec 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur Coulter, hématimètre, ou cytomètre de flux. Ajuster la suspension de cellules à une densité de 1 x 10 6 à 5 x 10 <sup&gt; 6 cellules / ml. Une fois que la densité de la suspension est réglée, supplément à environ 0,1% v / v F-127. REMARQUE: La densité cellulaire et la concentration en agent tensio-actif peut être nécessaire de modifier en fonction des systèmes de cellules particulières, le tableau 1 fournit un enregistrement des concentrations de cellules utilisés précédemment et F-127 pour les différents types de cellules. </li><li> Placez suspension cellulaire dans un cytomètre de flux tube et se connecter au bouchon de pression. Avant de raccorder le tuyau au dispositif microfluidique, ajuster la pression à environ 14 à 21 kPa et de rinçage jusqu&#39;à ce que la suspension cellulaire se dégage de l&#39;extrémité du tube. Cela aidera à réduire les bulles d&#39;air dans le tube et le dispositif. </li><li> Insérer l&#39;extrémité du tube contenant la suspension cellulaire dans l&#39;entrée du dispositif. Si le dispositif est collé sur une lamelle, de placer le dispositif sur une surface plane, solide, tel que la platine du microscope avant de raccorder la tubulure; la lamelle est fragile et peut casser contraire. </li><li> Insérez un morceau de tuyau into l&#39;orifice de sortie et l&#39;acheminer dans un tube vide pour la collecte des déchets, tel qu&#39;un tube Falcon vide collé sur le côté de la platine du microscope. Pour assurer la cohérence de la résistance fluidique totale du dispositif entre les expériences, en sorte que les tubes d&#39;entrée et de sortie sont de même diamètre et approximativement de la même longueur pour chaque expérience. </li><li> Rampe doucement la pression à environ 28 kPa ou jusqu&#39;à ce que les cellules passent par les canaux. Positionner le dispositif de sorte que plusieurs canaux sont dans le champ de vision et sont perpendiculaires à la partie inférieure de l&#39;écran. Si l&#39;appareil est limitée par la taille des données, d&#39;acquérir plusieurs vidéos afin de générer un nombre suffisant de points de données indépendants. Régler la vitesse nécessaire à la production de données d&#39;image souhaitée. Pour tenir compte des changements dans la forme des cellules, utiliser l&#39;imagerie à haute vitesse à 300 images par seconde (fps); pour mesurer le temps de transit des cellules, utiliser des taux de trame d&#39;environ 100 fps. </li></ol> Analyse 5. données <ol><li> Ouvrez le fichier de mâter_script.m (téléchargeable de fichier supplémentaire) et exécuter le programme. </li><li> Sélectionnez la première vidéo à analyser à partir de la fenêtre de l&#39;Explorateur Windows qui s&#39;affiche. Spécifiez le taux de trame pour la vidéo sélectionnée et appuyez sur Entrée. REMARQUE: Un chiffre apparaît pour demander à l&#39;utilisateur de sélectionner une fenêtre rectangulaire de culture pour la première vidéo. </li><li> Sélectionner une fenêtre qui englobe tous les canaux de gauche à droite et de coupe juste au-dessus des canaux de la première ampoule de la matrice de canaux à partir du haut et du bas (figure 3). </li><li> Sélectionnez les régions de constriction de l&#39;image recadrée. Portez une attention particulière à maintenir une distance de pixels fixe entre la fenêtre limite supérieure et inférieure pour chaque vidéo sélectionnée. REMARQUE: La fenêtre bord supérieur définit la fenêtre supérieure et la constriction bord inférieur indique la constriction la plus inférieure (figure 4); constrictions intermédiaires sont estimés à partir de cette entrée de l&#39;utilisateur. Ensuite, l&#39;algorithme affiche les segmentation de cellules pour les 50 premières images de chaque vidéo (Figure 5). </li><li> Surveillez l&#39;image en haut à gauche (figure 5A) en étroite collaboration afin de déterminer si l&#39;algorithme est de localiser avec précision les cellules; une image binarisée est superposée à la source vidéo à montrer l&#39;emplacement des cellules identifiées. REMARQUE: Les différentes fenêtres, (figures 5B-5D) sont pour le diagnostic de code et montrent les images de la vidéo après les opérations spécifiques de traitement d&#39;image. </li><li> Sélectionnez la vidéo suivante à traiter de la fenêtre de l&#39;Explorateur Windows. NOTE: L&#39;algorithme va répéter les étapes 5.2 à 5.5 pour chaque vidéo sélectionnée. </li><li> Sélectionnez annuler une fois toutes les vidéos désirées ont été ajoutés par la fenêtre de l&#39;Explorateur Windows pour charger la fonction que la liste des vidéos est terminée. NOTE: L&#39;algorithme effectue les opérations restantes sans intervention de l&#39;utilisateur. Cela prendra environ 1-2 heures selon le nombre de vidéos transformés et pe informatiquesrfo rm a n. À la fin, l&#39;algorithme va produire un histogramme des données de temps de transit et de sauvegarder les données dans le répertoire comme un fichier .mat MATLAB et un fichier xls Microsoft Excel. </li></ol>

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M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+surface+wettability+of+poly(dimethyl)+siloxane+(PDMS)+and+glass+under+oxgen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength.">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+poly(dimethylsiloxane)+surface+modification+to+control+cell+adhesion.">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Ici nous fournissons une procédure expérimentale complet d&#39;analyse de la déformation des cellules qui transitent par des canaux microfluidiques constriction en utilisant un écoulement commandé par la pression. Un script MATLAB permet le traitement automatique des données (matériel supplémentaire); une version mise à jour du code est maintenue ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). De façon plus générale, les techniques présentées ici peuvent ?...

Les changements dans la forme des cellules sont essentielles dans de nombreux contextes biologiques. Par exemple, les erythrocytes et les leucocytes se déforment à travers des capillaires plus petits que leur diamètre 1. Dans les métastases, les cellules cancéreuses doivent se déformer à travers des espaces interstitiels étroites ainsi que des vaisseaux sinueux et des réseaux lymphatiques pour ensemencer à deux sites secondaires. Pour sonder le comportement physique des cellules individuelles, des dispositifs microfluidiques présentent une plate-forme idéale qui peut être personnalisé pour étudier une gamme de comportements cellulaires, y compris leur capacité à migrer à travers espaces étroits 3 et à déformer passivement à travers les constrictions micrométriques 3- 9. Polydiméthylsiloxane (PDMS) des dispositifs microfluidiques sont optiquement transparent, ce qui permet les déformations de la cellule pour être visualisées par microscopie à la lumière et analysées à l&#39;aide des outils de base de traitement d&#39;image. En outre, les tableaux de rétrécissements peuvent être définis avec précision, permettant l&#39;analyse de plusieurs cellules simultanément avec unedébit qui dépasse de nombreuses techniques existantes 10,11. Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour sonder la déformabilité de la cellule en utilisant un dispositif microfluidique la «cellule de Deformer &#39;PDMS. Le dispositif est conçu de telle sorte que le passage à travers les cellules successives des étranglements; cette géométrie est commun dans les contextes physiologiques, tels que le lit capillaire pulmonaire 12. Pour mesurer la déformabilité de la cellule, le temps de transit fournit une mesure commode qui peut être facilement mesurée par le temps nécessaire à une cellule individuelle de transit à travers une seule de 4,6 constriction. Afin de maintenir une chute de pression constante à travers les canaux rétrécis pendant le transport de cellules, on utilise le débit commandé par la pression. Notre protocole comprend des instructions détaillées sur la conception de l&#39;appareil et la fabrication, le fonctionnement du dispositif de flux, la préparation axée sur la pression et l&#39;imagerie des cellules, ainsi que le traitement d&#39;image pour mesurer le temps pour que les cellules se déforment à travers une série d&#39;étranglements. Nous incluonsdeux modèles d&#39;appareil et le code de traitement des données de vision en tant que fichiers supplémentaires. Comme un échantillon représentatif de données, nous montrons cellule de temps de transit à travers une série d&#39;étranglements en fonction du nombre de constrictions à des passages. Analyse de l&#39;échelle de temps de transit à travers les cellules à des constrictions étroites d&#39;un dispositif microfluidique peut révéler des différences dans la capacité de déformation d&#39;une variété de types de cellules 4,5,13. Le dispositif montré ici recense unique cellule de transit à travers une série de rétrécissements l&#39;échelle du micron; cette conception émule le chemin tortueux que les cellules subissent en circulation et permet également sonder les caractéristiques physiques supplémentaires des cellules telles que les temps de relaxation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8409400</td>
			<td style="width:167px;">Produced by BASF, also available through Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">PDMS base and crosslinker</td>
			<td style="width:71px;">Essex Brownell</td>
			<td style="width:119px;">DC-184-1.1</td>
			<td style="width:167px;">Product commonly named Sylgard 184 Elastomer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Oxygen plasma discharge unit</td>
			<td style="width:71px;">Enercon</td>
			<td style="width:119px;">Dyne-A-Mite 3D Treater</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight Ferrule, 1/32&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight III Fitting, 10-32</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-300X</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32&#34;or 0.79 mm</td>
			<td style="width:71px;">Valco</td>
			<td style="width:119px;">TPK.515-25M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyethylene (PE-20) tubing, 0.043&#34; or 1.09 mm</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pressure regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas or Praxair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Polyurethane tubing, 5/32&#8221; OD</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5648K284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Push-to-connect fittings</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5111K91</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">IP413-020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI PCI 6225-779295-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Analog Connector Block-Screw Terminal</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SCB-68-776844-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">LabView System Design Software</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Matlab Software</td>
			<td style="width:71px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2012a</td>
			<td style="width:167px;">Code requires the Image Processing Toolbox</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:216px;">Shielded Cable</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SHC68-68</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic technique to probe cell deformability

Ici, nous décrivons la conception, la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;un dispositif microfluidique pour évaluer l&#39;aptitude à la déformation d&#39;un grand nombre de cellules individuelles d&#39;une manière efficace. Généralement, les données pour ~ 10 2 cellules peuvent être acquises dans le cadre d&#39;une expérience de 1 heure. Un programme d&#39;analyse d&#39;image automatisée permet une analyse efficace post-expérience de données d&#39;image, permettant un traitement pour être terminée en quelques heures. Notre géométrie du dispositif est unique en ce que les cellules doivent se déformer à travers une série de rétrécissements l&#39;échelle du micron, ce qui permet la déformation initiale et la détente en fonction du temps de cellules individuelles à doser. L&#39;applicabilité de cette méthode de leucémie promyélocytaire humaine (HL-60) cellules est démontrée. Cellules conduire à déformer par des constrictions l&#39;échelle du micron en utilisant débit commandé par la pression, nous observons que promyélocytaire humaine (HL-60) cellules occlusion momentanément le premier étranglement pour une durée médiane de 9,3 msec avant repiquage plus rapidement à travers la constriction ultérieureions avec un temps de transit moyen de 4,0 ms par constriction. En revanche, (de type neutrophile) tout-trans rétinoïque traité à l&#39;acide cellules HL-60 occlusion de la première constriction seulement 4,3 msec avant repiquage à travers les étranglements ultérieures avec un temps de transit médian de 3,3 msec. Cette méthode peut donner un aperçu de la nature viscoélastique des cellules, et finalement révéler les origines moléculaires de ce comportement.

Pour étudier la capacité de déformation de différents types de cellules, des cellules de leucémie myéloïde humaine (HL-60), les cellules neutrophiles différenciées, des cellules de lymphocytes de souris et des lignées de cellules de cancer ovarien humain (OVCAR8, HEYA8) sont évalués en utilisant la technique microfluidique la &#39;cellule Deformer. Les résultats représentatifs pour le temps de transit des cellules HL-60 et de type neutrophile HL-60 montrent le délai pour une seule cellule de transit à tr...

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A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Nous démontrons un dosage à base de microfluidique pour mesurer les délais pour les cellules de transiter par une séquence d&#39;étranglements l&#39;échelle du micron.

Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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11.2K vues.  University of California, Los Angeles.  Nous démontrons un dosage à base de microfluidique pour mesurer les délais pour les cellules de transiter par une séquence d'étranglements l'échelle du micron. 

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Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Analyse systématique des<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellule de roulement en utilisant un système microfluidique plaque multi-puits

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-étape Hauteur variable photolithographie pour dispositifs microfluidiques à valve Multilayer

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.