EQUIPEMENT <ul><li> Culture tissulaire incubateur, 37 ° C, 5% de CO 2 </li><li> Centrifugeuse </li><li> Jeu de micropipettes (100, 100 ul) </li><li> 37 ° C Bain-marie </li><li> Bain-marie 90 ° C pour être source de vapeur d&#39;eau </li><li> Microscope à contraste de phase </li></ul> PREMIÈRE ÉTAPE Traitant les cellules avec colcémide Dans cette procédure, nous avons utilisé la ligne H9 de CSEh cultivés sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) inactivé à la mitomycine C (Sigma) et maintenu en DMEM/F12 (Invitrogen) complémenté avec de remplacement KO 20% de sérum (KSR, Gibco) et des 8ng/mL facteur de croissance des fibroblastes (FGF-2, R &amp; D). Afin d&#39;obtenir un grand nombre de métaphases propage, il est recommandé d&#39;utiliser des cultures avec l&#39;index mitotique élevé dans lequel il ya beaucoup de cellules qui se divisent. <ol><li> Prenez le flacon de culture de l&#39;incubateur et, dans le flux laminaire, ajouter Colcemid à une concentration finale de 0,1 g / mL. </li><li> Retourner le flacon dans l&#39;incubateur et attendre 3 heures pour l&#39;inhibiteur peut provoquer un arrêt mitotique sur métaphase, quand les chromosomes sont bien condensée et peut être facilement visualisés au microscope. </li></ol> Fixation des cellules <ol start="3"><li> Sortez le moyen et ajouter trypsine / EDTA 0,05% suffisante pour couvrir la surface des cellules. Laisser les cellules à incuber pendant 5 minutes à température ambiante, puis inactiver l&#39;enzyme soit en ajoutant un milieu de culture contenant du sérum ou en ajoutant simplement du sérum pour les cellules. NOTE: Il est important de s&#39;assurer que la suspension seule cellule est réalisée pour obtenir une bonne propage métaphase. </li><li> Transférer les cellules dans un tube à centrifugation de 15 ml et centrifuger à 122 g pendant 5 minutes. </li><li> Jeter le surnageant, laissant environ 200 ml, et remettre le culot délicatement en tapotant le tube, comme le montre la vidéo. Assurez-vous que les cellules sont bien dissociés, de sorte que vous ne pouvez pas visualiser les grumeaux dans la solution. </li><li> Ensuite, vous aurez besoin d&#39;ajouter 5 ml de solution hypotonique (KCl 75mm) pré-chauffé à 37 ° C, lentement, par la paroi du tube comme dans la description suivante. Premièrement, ajoutez 3 ml, inverser le tube dans une position horizontale juste de mélanger les cellules avec la solution hypotonique puis ajouter le reste, soit 2 ml et garder au chaud à 37 ° C pendant 15 minutes. NOTE: A ce point la solution hypotonique entraîne une augmentation du volume cellulaire et aider à démêler les chromosomes. Le temps d&#39;incubation est important d&#39;acquérir des étalements de chromosomes bon. Si le timing est trop long, la membrane cellulaire peut éclater trop tôt et les chromosomes sont perdus. S&#39;il est trop court, il peut être difficile d&#39;obtenir étalements de chromosomes, car la membrane cellulaire peut ne pas perturber. </li><li> Ajouter 3 gouttes de la solution de fixateur (méthanol / acide acétique glacial 3:1), inverser le tube délicatement pour mélanger la solution de fixation avec les cellules et centrifuger à 122 g pendant 5 minutes sans pause. REMARQUE: La solution de fixation doit être fraîchement préparé. NOTE: Il est important d&#39;utiliser la centrifugation sans rupture pour éviter attrition des cellules, empêchant la perte de la matière. </li><li> Jeter le surnageant, laissant environ 200 ml, et remettre le culot délicatement en tapotant le fond du tube. REMARQUE: Encore une fois, assurez-vous que les cellules sont bien dissociés, de sorte que vous ne pouvez pas visualiser les grumeaux dans la solution. </li><li> Ajouter le premier 3 mL de la solution de fixation, lentement par la paroi du tube, tandis que vous faites pivoter le tube. Inverser le tube en position horizontale juste pour mélanger les cellules, puis ajouter plus de 2 mL de la solution de fixation par la paroi du tube de prendre les cellules vers le bas. Stock à 4 ° C pendant la nuit. REMARQUE: Les cellules fixées peuvent être stockées dans la solution de fixation pour les mois à 4 ° C. Outre la protection des cellules dans leur état gonflé, la solution de fixation élimine lipides et des protéines dénature. Ces événements font la membrane cellulaire fragile et, par conséquent, faire le chromosome répandre facilement. </li></ol> NETTOYAGE les lames de verre Avant de commencer de faire votre étalements de chromosomes faire en sorte que vos diapositives sont correctement nettoyées ou vous risquez de perdre certains noyaux et les métaphases aussi. Cette étape est aussi bien important si vous voulez essayer une technique 9 hybridation. <ol><li> Placer les lames dans un bécher contenant HCl 6M pendant au moins 3 h à température ambiante. </li><li> Après ce temps, laver les lames à l&#39;eau courante pendant 10 minutes. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau distillée et laisser leur sec à température ambiante. </li><li> Maintenant, les diapositives peuvent être stockés dans l&#39;éthanol 96% et séché avec un chiffon non pelucheux immédiatement avant l&#39;utilisation. </li></ol> REMARQUE: Pour des méthodes d&#39;hybridation in situ, les diapositives peuvent pas être stockés pendant plus de 2 jours dans 96% d&#39;éthanol DEUXIÈME ÉTAPE Le lavage des cellules <ol start="10"><li> Le lendemain, centrifuger les cellules à 122 g pendant 5 minutes sans pause. </li><li> Discard le surnageant en laissant environ 200 ml. Reprendre le culot par un léger effleurant le tube puis ajouter 5 ml de solution de fixateur frais (méthanol / acide acétique glacial 3:1), lentement par la paroi du tube tout en tournant le tube. Répétez cette étape de lavage 2 fois plus pour un total de trois lavages. REMARQUE: La solution de fixation doit être fraîchement préparé. </li></ol> Préparation de la glisse <ol start="12"><li> À l&#39;étape de centrifugation dernière laissez quantité suffisante de solution d&#39;homogénéiser le culot cellulaire et d&#39;obtenir une densité suffisante de cellules dans les lames (voir figure 1). </li><li> Ajouter 20 à 30 uL de suspension cellulaire sur une lame propre et sec en déplaçant la pipette très proche et parallèle à la surface. Comme l&#39;évaporation la solution de fixation, la surface de glissement devient granuleuse. </li><li> Immédiatement, d&#39;exposer la diapositive, face vers le haut, dans la vapeur d&#39;eau chaude (90 °) pendant 30 secondes pour provoquer les cellules exploser. REMARQUE: En ce moment, le méthanol à partir de l&#39;évaporation de la solution de fixation, résultant en une augmentation de la concentration d&#39;acide acétique, qui, ensemble avec l&#39;eau stimule le chromosome se propager. </li><li> Regardez un microscope à contraste de phase juste pour vérifier si la concentration ainsi que la distribution des cellules est bonne (voir figure 1). </li><li> Maintenant, les diapositives sont prêts à être utilisés pour vérifier l&#39;ensemble des chromosomes par des approches cytogénétique comme le G-banding (Giemsa), le poisson, le ciel ou la CGH. </li></ol> Conseils importants Comment choisir un métaphase suffisante pour être analysés Choisir métaphases ronde et isolée (figure 2D), vous pouvez éviter de considérer aneuploïdies fausse que le gain de chromosomes générés par deux ou plusieurs planches mélangés entre eux ou la perte de chromosomes générés par un chromosome lancé. Donc, évitez de choisir métaphases proximité des noyaux car certains chromosomes peuvent être cachés par eux (figure 2A et 2B). En outre, chercher des métaphases rond et être sûr que tout le chromosome est séparé de la métaphase (figure 2C). Cellules nourricières et le caryotype des CSEh Pour G-banding et de l&#39;analyse SKY, la présence de cellules nourricières dans la culture des CSEh ne pas interférer avec les résultats, parce que des cellules nourricières ne sont pas dans un état de division (inactivé par la mitomycine C ou irradiation) et ne fera pas partie de la population en métaphase. Cependant, pour l&#39;application de la technique FISH dans les noyaux interphasiques, il est préférable de séparer la population de CSEh à partir des cellules nourricières par la récolte des colonies manuellement avant trypsinisation pour l&#39;analyse FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Comment connaître la densité cellulaire appropriée, dans les diapositives. Les images de microscopie à contraste de phase dans l&#39;objectif 10x. (A) La densité cellulaire est trop élevée. Les flèches indiquent la métaphase propage trop près des noyaux. (B) Un diaporama avec une bonne densité cellulaire. Les cercles indiquent propage métaphases isolés à partir des noyaux ou métaphases d&#39;autres. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Comment choisir une métaphase suffisante pour être analysés. Les chromosomes sont colorés avec DAPI et les images obtenues par un microscope à fluorescence dans l&#39;objectif 100x. (A) (B) Éviter métaphases proximité des noyaux (indiqué par les flèches) (C) et métaphases pas rond que les chromosomes présents séparés (cercle). (D) A la métaphase ronde est une bonne métaphase pour être analysés. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La préparation des étalements de chromosomes est une étape critique pour une analyse réussie de l&#39;état génétique des cellules souches embryonnaires par des techniques couramment comme le G-banding et des techniques plus sophistiquées telles que le poisson, SKY et CGH. Cette procédure peut être appliquée pour de nombreux types cellulaires en faisant varier la période d&#39;incubation colcémide, qui dépend de la longueur du cycle cellulaire. Pour des colonies de cellules souc...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Colcemid Karyo MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15212-012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>104.931.000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioslide</td>
<td>7105-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tripsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4799</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

Bien cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été montrés à présenter un caryotype diploïde stables 1, de nombreuses études ont rapporté que, selon les conditions de culture, ils deviennent sujets à acquérir des anomalies chromosomiques telles que l&#39;addition de tout ou parties de chromosomes. En effet, durant culture à long terme, les altérations chromosomiques sont observées lors de dissociation enzymatique ou chimique sont utilisés 2,3,4, tandis que la dissection manuelle des colonies pour repiquage conserve un caryotype stables 5. Par ailleurs, des changements dans l&#39;environnement telles que la suppression de cellules nourricières semblent également compromettre l&#39;intégrité génétique des CSEh 3,6. Une fois altérations chromosomiques peuvent affecter la physiologie cellulaire, la caractérisation de l&#39;intégrité génétique des CSEh in vitro est cruciale CSEh considérant comme un outil essentiel dans les études de l&#39;embryogenèse et de dépistage des drogues. Par ailleurs, pour l&#39;avenir à des fins thérapeutiques modifications chromosomiques sont une réelle préoccupation car elle est souvent associée à la cancérogenèse. Ici, nous montrons une méthode simple et utile pour obtenir une haute qualité pour les étalements de chromosomes analyse subséquente du chromosome fixé par G-banding, FISH, le ciel ou les techniques de CGH 7,8. Nous vous recommandons de vérifier le statut chromosomique régulièrement avec des intervalles de 5 passages afin de surveiller l&#39;apparition de translocations et aneuploïdies Priscila Britto et Rafaela Sartore contribué de façon égale sur le papier.

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Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Caryotype est une technique simple et utile largement utilisé pour détecter les altérations génétiques. Nous décrivons ici une étape par étape pour la préparation du protocole propagation de chromosomes de cellules souches embryonnaires humaines pour la surveillance du statut chromosomique de ces cellules maintenues en culture.

Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.5K vues.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Caryotype est une technique simple et utile largement utilisé pour détecter les altérations génétiques. Nous décrivons ici une étape par étape pour la préparation du protocole propagation de chromosomes de cellules souches embryonnaires humaines pour la surveillance du statut chromosomique de ces cellules maintenues en culture.

Vidéo: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.