Nous remercions le Cystic Fibrosis Foundation (CFF) pour le financement de ce travail par le biais de son Consortium Structure CFTR 3D (numéro de subvention FORD08XX0). Nous reconnaissons l&#39;énorme contribution de tous nos collègues au sein du Consortium à ce travail, en particulier dans la conception des gènes CFTR. Nous reconnaissons également la contribution inestimable des Drs. James Birtley (CNRS Demokritos, Grèce), Mark Young (Université de Cardiff, Royaume-Uni) et David Drew (Imperial College, Londres, Royaume-Uni) dans les premiers stades du travail. Nous remercions tout particulièrement le Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) pour la lecture critique du manuscrit.

<ol>
	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. 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Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce document fournit une méthode pour l&#39;expression de la protéine CFTR murin des cellules de levure, ce qui devrait faciliter la recherche sur la fibrose kystique. L&#39;objectif est de relier le présent document avec la sortie de la souris CFTR construction d&#39;ADN, qui sera disponible à travers le Cystic Fibrosis Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Autre orthologues devrait être disponible plus tard. Transformation des cellules de levure avec le vecteur contenant la protéine CFTR est simple, mais il est important à l&#39;écran pour les colonies exprimant des niveaux élevés de la protéine CFTR. Les niveaux d&#39;expression variables peuvent provenir de plusieurs facteurs, mais le nombre de copies de la cellule plasmide par représente probablement un degré significatif de la variation. Les étapes critiques décrites ici devrait permettre la production de la protéine CFTR des cellules exprimant la protéine CFTR et de levure contenant des membranes microsomales. Une fois la transformation, la croissance, la récolte et la lyse des cellules de levure ont été maîtrisées, Purification de la protéine devrait être possible, et à la figure 3, nous avons donné un exemple de la pureté qui devrait être réalisable dans ce cas comme une référence utile. Ce n&#39;est pas notre intention dans ce manuscrit de fournir une méthodologie détaillée pour la purification de la protéine. Cependant, il ya certaines étapes critiques de purification en aval qui sont spécifiques au système d&#39;expression S.cerevisae, tels que la lyse cellulaire et de purification des microsomes, et ceux-ci ont été inclus en détail dans ce manuscrit. Il convient de mentionner, cependant, qu&#39;en dehors des deux méthodes que nous avons utilisés, des méthodes alternatives de cellules de levure de perturbation peuvent être employées, telles que l&#39;utilisation d&#39;une cellule de pression française. La protéine recombinante a un domaine VET-clivable GFP C-terminal qui permet à la protéine à être suivis après induction (fig. 4). Levure ont une protéine intrinsèque 70kDa (probablement succinate déshydrogénase 12) qui entre en fluorescence dans les mêmes conditions 11, ce qui peut fournir une inter utileétalon interne pour les niveaux d&#39;expression relatifs des CFTR dans des extraits cellulaires ou des microsomes entiers (fig. 3). Il est clair à partir des données présentées dans la figure 4 que le moment de la récolte des cellules après induction par le galactose est crucial. Les rendements de baisse CFTR précipitamment après environ 16 heures d&#39;induction, de sorte que il n&#39;y a guère CFTR détectable dans les cellules de levure après 24 heures d&#39;induction. Le rendement de la protéine purifiée est d&#39;environ 1-2mg protéine CFTR par 15 litres culture du fermenteur. La récupération peut être estimée à environ 70% du total CFTR-protéine GFP jusqu&#39;au stade microsomes, et la récupération d&#39;environ 25% de protéine purifiée. Caractérisation de la S. cerevisiae a exprimé la protéine CFTR est en cours. Comme on le voit dans la figure. 4, emplacement de la protéine dans la cellule peut être contrôlée par microscopie de fluorescence. Bien que une grande partie de la fluorescence se trouve autour de la périphérie de la cellule en tant 10 attendue, une partie de la protéine présente une localisation ponctuée, soit dans, oujuste à l&#39;intérieur de la membrane plasmique, qui pourrait être due à CFTR de recyclage grâce à une fin de Golgi / endosome voie 14 ou peut-être un peu en aval du compartiment de le bourgeonnement des vésicules de transport de l&#39;ER 4. Le traitement par PNGaseF, une enzyme qui deglycosylates protéines, ont montré des changements minimes dans la migration de la bande protéine CFTR sur SDS-PAGE, ce qui implique qu&#39;il est non glycosylé, ou a glycosylation minime 15. Expériences sur l&#39;état de phosphorylation de la protéine sont en cours. Dans quelques-unes des détergents testés jusqu&#39;à présent, la protéine purifiée présente une activité ATPase (qui est inhibée par un inhibiteur de la protéine CFTR spécifique 16) à des taux qui sont semblables à ceux publiés antérieurement 2,15. Mesure de l&#39;activité du canal CFTR, il faudra la reconstitution de la protéine purifiée, ce qui impliquerait une étape de purification finale dans un détergent qui a un niveau relativement élevé concentration micellaire critique (cmc) 17. Levure microsomes containing CFTR peut être solublised avec plusieurs détergents couramment utilisés, y compris 18 des détergents tels que le dodécyl maltoside 2, qui sont généralement considérées comme «douces». Cependant, la plupart des détergents haute cmc se sont avérés inefficaces pour solubilsation, jusqu&#39;à présent, ce qui suggère que l&#39;échange dans ces détergents devraient être examinées à un stade tardif de tout régime de purification.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / équipements </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue Pas </td></tr><tr><td> FGY217 souche S. cerevisiae, avec suppression pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base azotée de levure sans acides aminés </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Remplissez mélange supplément sans uracile </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Agar agar bactériologique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactose </td><td> Pêcheur </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pêcheur </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatine A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Fluorure Aminoethylbenzenesulfonyl (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de benzamidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothréitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Pêcheur </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pêcheur </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodécyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler plus les normes de protéines précolorés </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-gly gels de gradient 4-20% </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instantanée Bleu de Coomassie Stain </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Perles de verre, lavé à l&#39;acide </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml stériles Tubes Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlStériles vis-top flacons </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Erlenmeyer stérile dérouté </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2l Erlenmeyer stérile dérouté flacons </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Microtubes 2ml </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0,2 um filtre à seringue </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> tubes ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> tubes à centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> Des pots à centrifuger 1l </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital incubateur agitateur avec contrôle de température </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision RMicroscope de restauration T </td><td> Applied Vision </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse de paillasse </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Paillasse microcentrifugeuse </td><td> Pêcheur </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Labs étoile </td><td></td></tr><tr><td> Scanner Trio Typhoon </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> Système d&#39;imagerie LAS3000 </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> La cuve de fermentation 20l et l&#39;unité de contrôle </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Constant perturbateur des systèmes à pile </td><td> Systèmes constants </td><td></td></tr><tr><td> Perturbateur cellule Beadbeater </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 Ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotor 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal chlorure, que lorsqu&#39;il est muté, peut donner lieu à la fibrose kystique dans humans.There est donc un intérêt considérable dans cette protéine, mais les efforts pour étudier sa structure et l&#39;activité ont été entravés par la difficulté d&#39;exprimer et de purification de quantités suffisantes de la protéine 1-3. Comme beaucoup de &#39;difficiles&#39; protéines membranaires eucaryotes, l&#39;expression dans un organisme en pleine croissance est souhaitable, mais difficile, et dans la levure S. cerevisiae, dans la mesure de faibles quantités ont été obtenues et de la dégradation rapide de la protéine recombinante a été observée 4-9. Les protéines impliquées dans le traitement de la protéine CFTR chez la levure recombinante ont été décrites 6-9. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour l&#39;expression de la protéine CFTR chez la levure et sa purification en quantités importantes. Le protocole décrit comment les problèmes de protéolyse antérieures peuvent être surmontés et les niveaux d&#39;expression de la façon dontCFTR peut être grandement améliorée en modifiant les conditions de croissance des cellules et en contrôlant les conditions d&#39;induction, en particulier la période de temps avant la récolte des cellules. Les reagants associés à ce protocole (CFTR murin exprimant des cellules de levure ou des plasmides de levure) seront distribués par l&#39;intermédiaire de la Fondation de la fibrose kystique aux États-Unis, qui a parrainé la recherche. Un article décrivant la conception et la synthèse de la protéine CFTR Construct employé dans le présent rapport sera publié séparément (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, non publié). Dans cet article nous allons expliquer notre méthode de début de la transformation des cellules de levure avec le CFTR construire - la levure contenant le plasmide (Fig. 1). Le produit de construction a une protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la séquence CFTR à son extrémité C-terminale et suit le système développé par Drew et al. (2008) 10. La GFP permet l&#39;expression et la purification de la protéine CFTR à suivre relativement facilement. Le protocole JoVE visualiséesfinitions ol après la préparation de microsomes des cellules de levure, bien que nous incluons quelques suggestions pour la purification de la protéine à partir des microsomes. Les lecteurs peuvent ajouter leurs propres modifications à la procédure de purification microsome, en fonction des derniers essais à effectuer avec la protéine et l&#39;équipement local à leur disposition. La levure a exprimé la protéine CFTR peut être partiellement purifié à l&#39;aide d&#39;ions métalliques chromatographie d&#39;affinité, en utilisant un marqueur polyhistidine intrinsèque de purification. Après chromatographie d&#39;exclusion stérique donne une protéine qui semble être&gt; 90% de pureté, à en juger par SDS-PAGE et Coomassie-coloration du gel.

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Les tentatives pour exprimer le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Ont, jusqu&#39;à présent, abouti à des quantités relativement faibles de protéines. Ce protocole et les réactifs associés distribués par la Cystic Fibrosis Foundation devrait permettre la préparation de quelques milligrammes de cette «difficile» protéine de la membrane eucaryote.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

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Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

18.4K vues.  University of Manchester. Les tentatives pour exprimer le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) dans Saccharomyces cerevisiae Ont, jusqu'à présent, abouti à des quantités relativement faibles de protéines. Ce protocole et les réactifs associés distribués par la Cystic Fibrosis Foundation devrait permettre la préparation de quelques milligrammes de cette «difficile» protéine de la membrane eucaryote.