אנו מודים סיסטיק פיברוזיס קרן (CFF) למימון עבודה זו דרך CFTR Consortium שלה מבנה 3D (מספר מענק FORD08XX0). אנו מכירים את התרומה הענקית של כל עמיתינו בתוך Consortium לעבודה זו, בעיקר בעיצוב של הגנים CFTR. כמו כן, אנו מכירים את תרומתם שלא תסולא בפז של בני הזוג. ג&#39;יימס Birtley (NCSR Demokritos, יוון), מארק יאנג (אוניברסיטת קרדיף, אנגליה) ודוד דרו (אימפריאל קולג&#39;, לונדון, בריטניה) בשלבים המוקדמים של העבודה. אנחנו במיוחד להודות לד&quot;ר אינה Urbatsch (טקסס טק. אוניברסיטת Lubbock) לקריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol>
	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

מאמר זה מספק שיטה ביטוי של חלבון CFTR Murine בתאי שמרים, שאמור להקל על מחקר על סיסטיק פיברוזיס. המטרה היא לקשר את הנייר עם שחרורו של Murine CFTR מבנה ה-DNA, אשר יהיה זמין דרך סיסטיק פיברוזיס קרן ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Orthologs אחר צריך להיות זמין במועד מאוחר יותר. טרנספורמציה של תאים שמרים עם וקטור המכיל CFTR היא פשוטה, אך חשוב למסך המושבות המבטאים רמות גבוהות של CFTR. רמות הביטוי משתנים עשוי לנבוע ממספר גורמים, אבל מספר העותקים של התא לכל פלסמיד כנראה אחראית במידה לא מבוטלת של וריאציה. השלבים הקריטיים המתוארים כאן אמור לאפשר ייצור של CFTR-לבטא בתאי שמרים CFTR, המכילים ממברנות microsomal. לאחר השינוי, הצמיחה, קציר תמוגה של תאים שמרים כבר שולט, purification של החלבון צריך להיות אפשרי, באיור 3 נתנו דוגמה של טוהר, כי צריך להיות בר השגה במקרה זה כאמת מידה שימושי. אין בכוונתנו בכתב היד הזה כדי לספק מתודולוגיה מפורטת טיהור של החלבון. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים טיהור במורד הזרם ספציפיים במערכת ביטוי S.cerevisae, כגון תמוגה התא וטיהור גופיפון, ואלה נכללו בפירוט כתב היד הזה. יש לציין, עם זאת, כי מלבד שתי השיטות בהן השתמשנו, שיטות חלופיות תא שמרים שיבוש יכול להיות מועסק, כגון שימוש של תא הלחץ הצרפתי. חלבון רקומביננטי יש TeV-cleavable בטרמינל C-GFP מושלם המאפשר לחלבון להיות במעקב אחרי הגיוס (איור 4). שמרים יש חלבון 70kDa פנימי (כנראה succinate dehydrogenase 12), מאיר, בתנאים זהים 11, וזה יכול לספק בין שימושיכיול סטנדרטי NAL את רמות הביטוי היחסיות של CFTR של תמציות תאים או microsomes שלמים (איור 3). ברור מהנתונים שמוצג בתרשים 4, כי העיתוי של קצירת התא לאחר אינדוקציה עם גלקטוז הוא קריטי. תשואות ירידה CFTR בתלילות לאחר שעות על 16 האינדוקציה, כך שיש כמעט בכל CFTR להבחין בתאי שמרים לאחר 24 שעות של אינדוקציה. תשואה של חלבונים מטוהרים הוא על חלבון 1 2mg-CFTR לכל תרבות fermenter 15 ליטר. השחזור ניתן להעריך גם על 70% של חלבון CFTR-GFP הכולל עד שלב גופיפון, והתאוששות על 25% מטוהרים חלבון. אפיון של ס &#39; cerevisiae, הביע CFTR היא מתמשכת. כפי שניתן לראות באיור. 4, מיקום של חלבונים בתוך התא יכול להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אמנם רוב הקרינה נמצא סביב בפריפריה של התא כמו 10 הצפויה, כמה חלבון מציג לוקליזציה punctate, או, אורק בתוך קרום הפלזמה אשר יכול להיות בגלל CFTR מיחזור דרך מסלול Golgi / endosomal בסוף 14 או אולי במורד הזרם של תא נביטה של שלפוחית ​​התחבורה של ER 4. טיפול PNGaseF, אנזים deglycosylates חלבונים, הראה שינוי מינימלי ההגירה של הלהקה חלבון CFTR על SDS-PAGE, רומז כי הוא unglycosylated, או שיש לו glycosylation מינימלי 15. ניסויים המדינה זירחון של חלבון נמצאים בעיצומם. בכמה חומרי ניקוי שנבדקו עד כה, חלבונים מטוהרים מציג פעילות ATPase (כי הוא עצור על ידי מעכבי CFTR ספציפי 16) במחירים דומים לאלה שפורסמו בעבר 2,15. מדידה של פעילות הערוץ CFTR ידרוש הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים, שפירושה צעד לטיהור הסופי חומר ניקוי בעל ריכוז גבוה יחסית קריטי micelle (CMC) 17. שמרים microsomes containinגרם CFTR ניתן solublised עם חומרי ניקוי המועסקים בדרך כלל מספר 18, כולל חומרי ניקוי כגון dodecyl maltoside 2, אשר נחשבים בדרך כלל להיות &quot;מתונה&quot;. אולם חומרי ניקוי CMC עליון הוכיחו להיות יעיל עבור solubilsation, עד כה, טוען כי חילופי לתוך חומרי ניקוי אלה יש לשקול בשלב מאוחר בתוכנית כלשהי טיהור.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> לא קטלוג </td></tr><tr><td> FGY217 זן S.cerevisiae, עם המחיקה pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> השלם את התערובת ללא תוספת אורציל </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> בקטריולוגית אגר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-גלקטוז </td><td> דיג </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> דיג </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> מרק </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido, בוטאן (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl פלואוריד (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidine hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> דיג </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> טריס-HCl </td><td> דיג </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-סורביטול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> N-dodecyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler פלוס סטנדרטים חלבון prestained </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep טריס, גלאי שיפוע ג&#39;ל 4-20% </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> כתם כחול מיידית Coomassie </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> חרוזי זכוכית, מולבן </td><td> סיגמא </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל מעוקרות פלקון צינורות </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlעקרות פקק הברגה בקבוקונים </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;ל סטרילי Erlenmeyer צלוחיות המבולבלות </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer סטרילי 2L מבולבל צלוחיות </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Microfuge צינורות 2ml </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM מזרק מסנן </td><td> סארטוריוס </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultracentrifuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> צנטריפוגות צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> צנטריפוגות סירים 1 ליטר </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital רועד חממה עם בקרת טמפרטורה </td><td> ניו ברונסוויק מדעי </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision RT מיקרוסקופ שיקום </td><td> יישומי חזון </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop צנטריפוגות </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Benchtop microfuge </td><td> דיג </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> וורטקס מערבל </td><td> כוכב Labs </td><td></td></tr><tr><td> טייפון סורק טריו </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 הדמיה המערכת </td><td> פוג&#39;י </td><td></td></tr><tr><td> Fermenter כלי 20l ואת יחידת הבקרה </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> הסלולרי משבש מערכות מתמיד </td><td> קבועים מערכות </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater משבש סלולרי </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> מיני beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> אופטימה L-100 ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) הוא ערוץ כלוריד, כי כאשר מוטציה, יכול להצמיח סיסטיק פיברוזיס ב humans.There ולכן עניין רב חלבון זה, אבל המאמצים ללמוד את המבנה שלה ואת הפעילות כבר הקשו על ידי קושי להביע וטיהור כמות מספקת של חלבון 1-3. כמו הרבה חלבונים &quot;קשה&quot; קרום האיקריוטים, ביטוי באורגניזם בצמיחה מהירה רצוי, אבל מאתגר, וגם את השמרים ס cerevisiae, עד כה התקבלו סכומים נמוכים והשפלה מהיר של חלבון רקומביננטי נצפתה 4-9. חלבונים המעורבים בעיבוד של CFTR רקומביננטי בשמרים תוארו 6-9. בדו&quot;ח זה אנו מתארים מתודולוגיה ביטוי CFTR בשמרים וטיהור שלה בכמויות משמעותיות. הפרוטוקול מתאר כיצד הבעיות proteolysis קודמות ניתן להתגבר וכיצד רמות הביטוי שלCFTR ניתן לשפר באופן משמעותי את הצמיחה על ידי שינוי תנאי התא על ידי שליטה בתנאי אינדוקציה, בתקופת זמן מסוימת לפני קצירת התא. את reagants הקשורות לפרוטוקול זה (Murine CFTR-לבטא בתאי שמרים או פלסמידים שמרים) יופץ באמצעות פיברוזיס סיסטיק ארה&quot;ב קרן, אשר מימנה את המחקר. מאמר המתאר את עיצוב וסינתזה של CFTR לבנות המועסקים דו&quot;ח זה יפורסם בנפרד (Urbatsch, י,. Thibodeau, פ ואח&#39;, לא פורסם). במאמר זה נסביר תחילת השיטה שלנו עם המעבר של התאים שמרים עם CFTR לבנות - השמרים המכיל פלסמיד (איור 1). יש לבנות את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רצף התמזגו כדי CFTR בתחנה הסופית C-שלה מלווה את המערכת שפותחה על ידי דרו et al. (2008) 10. GFP מאפשר ביטוי וטיהור של CFTR להיות אחריו בקלות יחסית. Protoc יופיטר דמיינוגימורים ol לאחר הכנת microsomes מן בתאי שמרים, אם כי אנו כוללים מספר הצעות טיהור של חלבון מן microsomes את. לקוראים מומלץ להוסיף שינויים משלהם הליך טיהור גופיפון, תלוי את הניסויים הסופיים להתבצע עם חלבון ו ציוד המקומית לרשותם. שמרים לידי ביטוי חלבון CFTR יכול להיות מטוהרים באופן חלקי מתכת באמצעות יונים זיקה כרומטוגרפיה, באמצעות תג פנימי לטיהור polyhistidine. כרומטוגרפיה לאחר בגודל הדרה מניב חלבון נראה&gt; 90% טהור, נשפט על ידי SDS-PAGE ו-Coomassie מכתים של ג&#39;ל.

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; יש, עד כה, הניב כמויות נמוכות יחסית של חלבון. זה פרוטוקול של חומרים כימיים הקשורים מופץ באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס צריך לאפשר הכנת כמויות מיליגרם של זה &quot;קשה&quot; חלבון הקרום האיקריוטים.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

18.4K Views.  University of Manchester. ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) ב Saccharomyces cerevisiae יש, עד כה, הניב כמויות נמוכות יחסית של חלבון. זה פרוטוקול של חומרים כימיים הקשורים מופץ באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס צריך לאפשר הכנת כמויות מיליגרם של זה "קשה" חלבון הק?...

Video: Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...