Ringraziamo il Cystic Fibrosis Foundation (CFF) per il finanziamento di questo lavoro attraverso il suo Consorzio CFTR struttura 3D (codice di autorizzazione FORD08XX0). Noi riconosciamo l&#39;enorme contributo di tutti i colleghi all&#39;interno del Consorzio a questo lavoro, in particolare nella progettazione dei geni CFTR. Abbiamo anche riconoscere i contributi preziosi di Drs. James Birtley (NCSR Democrito, Grecia), Mark Young (Università di Cardiff, UK) e David Drew (Imperial College, London, UK) nelle prime fasi del lavoro. Noi in particolare ringraziare il Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) per la lettura critica del manoscritto.

1. Preparazione dei supporti e tamponi <ol><li> YNB: per un litro, sospendere base di 6,9 g di lievito di azoto, senza aminoacidi e 0,77 g miscela completa senza supplemento uracile in 1 l di acqua. Sterilizzare in autoclave. Conservare a 4 ° C. </li><li> YNBA: Per 400 ml, sospendere base di 2,76 g di lievito di azoto, senza aminoacidi, 0,38 g miscela completa senza supplemento uracile e 8g agar batteriologico in 350 ml di acqua. Sterilizzare in autoclave. Mescolare 8 g di glucosio con 50 ml d&#39;acqua e scaldare lentamente fino alla dissoluzione. Sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 um e aggiungere al YNBA mentre l&#39;agar è fuso. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Glucosio media del 20%: per 500 ml, mescolare 100 g di glucosio con 500 ml YNB e riscaldare dolcemente fino alla dissoluzione. Passare attraverso un filtro da 0,2 uM in una bottiglia sterile Duran. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Media galattosio 20%: Per 2 litri, mescolare 400 g di galattosio YNB 2l e riscaldare dolcemente fino alla dissoluzione. Passare attraverso un filtro da 0,2 micron in una bottiglia sterile Duran. Conservare a carattere cameraperatura. </li><li> Scorte di inibitori della proteasi: CFTR è altamente suscettibile alla proteolisi 4. Gli autori hanno trovato le seguenti inibitori di essere efficace nel limitare la proteolisi, anche se i lettori possono voler personalizzare questo elenco per soddisfare le proprie esigenze. Conservare in aliquote di 100 pl a -20 ° C per ridurre i problemi di congelamento-scongelamento. Tutti gli inibitori dovrebbero essere diluito dalle soluzioni madre alla concentrazione di lavoro come di seguito: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Inhibitor </td><td> Concentrazione magazzino </td><td> Preparazione magazzino </td><td> Concentrazione di lavoro </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> Sciogliere a 48mg 1 ml di acqua distillata </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidina </td><td> 300 mM </td><td> Sciogliere 36 mg in 1 ml di acqua distillata </td><td> 0,3 mM </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> 4 mM </td><td> Sciogliere 2,5 mg in 1 ml a secco DMSO </td><td> 4 pM </td></tr><tr><td> E-64 </td><td> 7 mm </td><td> Sciogliere 2,5 mg in 1 ml di acqua distillata </td><td> 7 pM </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> 20 mM </td><td> Sciogliere 10 mg in 1 ml di acqua distillata </td><td> 20 pM </td></tr><tr><td> A pepstatina </td><td> 15 mM </td><td> Sciogliere 10 mg in 1 ml DMSO secco </td><td> 15 pM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> Sciogliere 174mg di 1ml a secco DMSO </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): Sciogliere 154 mg ditiotreitolo in 1 ml di acqua distillata. Conservare a -20 ° C. Utilizzare a 1:1000 diluizione in buffer indicato. </li><li> EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g di acido etilendiamminotetraacetico con 100 ml di acqua. Aggiungere 10 N NaOH goccia a goccia fino a quando tutto l&#39;EDTA è dissolto e il pH raggiunge 8. Portare a 200 ml con acqua e passare attraverso un filtro 0,2 micron in una bottiglia sterile Duran. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M sorbitolo, 1 mM EDTA): Sciogliere 18,17 g di Tris-base in 350 ml di acqua e regolare il pH a 7,4 per aggiunta di HCl. Aggiungere 51,35 g di sorbitolo e fare volume di 500 ml con acqua. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 1 ml di soluzione madre EDTA e conservare a 4 ° C. </li><li> CFTR tampone (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v glicerolo): Sciogliere 6,06 g di Tris-base in 500 ml di acqua. Regolare il pH a 8 con HCl, aggiungere 100 ml di glicerolo e portare a 1 L con acqua. Autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> 2x colorante carico: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% glicerolo, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% blu di bromofenolo, 4% SDS, 0,05 M DTT. Fare 10 ml, aliquotare e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Screening trasformanti Questo protocollo presuppone che il CFTR-GFP-8His gene di fusione è stata inserita in un plasmide di lievito a valle di un promotore GAL1 galattosio (Fig.1) e che il plasmide è stato trasformato in cellule FGY217, un mutante di delezione PEP4 10 S.cerevisiae </em&gt;. Le cellule possono essere coltivate su piastre YNBA e immagazzinati per diverse settimane a 4 ° C. Per la conservazione a lungo termine, le scorte di glicerolo devono essere fatte e conservati a -80 ° C. Metodi per la clonazione e la trasformazione sono descritti in dettaglio da Drew et al. (2008) 10. <ol><li> Scegli 5-10 ben separati colonie da una piastra di trasformazione. Trasferire ciascuna colonia ad una sterile separata tubo da 50 ml Falcon contenente 9 ml YNB e 1 ml di terreno di glucosio al 20%. Per questo passaggio, è importante avere una concentrazione finale del 2% glucosio (w / v) in coltura per mantenere la crescita cellulare. Crescere durante la notte per 16 ore a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione. </li><li> Fare stock di glicerolo per ciascuna delle colonie schermati. Asepsi 0,8 ml delle colture overnight a 0,2 ml di glicerolo sterile in etichettati vite migliori fiale, brevemente vortex e conservare a -80 ° C. </li><li> Diluire le colture restanti overnight a un volume finale di 50 ml in YNB, incluse 250 microlitri di terreno di glucosio 20%.Per questo passaggio, è importante per diluire la concentrazione di glucosio a circa lo 0,1% (w / w) nella cultura perché glucosio può reprimere la promotore GAL1 10. Grow culture in etichetta 250 ml Erlenmeyer sconcertato palloni ad un OD 600 di 0,7-0,8 a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione. </li><li> Indurre le culture con aggiunta di 5 ml di mezzo galattosio 20% a ciascun pallone e crescere su per 16 ore. </li><li> Confermare l&#39;espressione di CFTR usando la microscopia a fluorescenza. Prendete 100 microlitri di cultura e di glicerolo aggiungere 100 microlitri di limitare la mobilità delle cellule in soluzione. Analizzare le celle di un microscopio Vision Delta RT ripristino (o simili), utilizzando un laser blu sotto un filtro FITC (lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 490 nm e la lunghezza d&#39;onda di emissione di 528-538 nm). Espressione positiva del CFTR-GFP proteina di fusione deve essere visibile come un anello di fluorescenza alla membrana plasmatica delle cellule di lievito. Cellule di lievito non trasformate possono essere utilizzati come controllo. </li><li> Trasferire ilculture in tubi Falcon da 50 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3500 xg, a 4 ° C per 10 minuti in una centrifuga da banco. Mentre la centrifuga è in funzione, preparare 2 tubi microcentrifuga ml con tappo a vite contenente circa 500 pl acid-washed perline di vetro e immessi sul ghiaccio. Eliminare il surnatante e risospendere ciascuna pellet in 500-800 ul ghiacciato CRB con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni ai tubi da microcentrifuga contenente le perline e tenere su ghiaccio. </li><li> Lisare le cellule scuotendo vigorosamente / vortex ciascuna provetta da microcentrifuga per 10 periodi di 30 secondi, appoggiato su ghiaccio tra i periodi. Un beadbeater può essere impiegato in alternativa, ad esempio un beadbeater Biospec mini funzionare per 3 min. </li><li> Porre i tubi in una microcentrifuga da banco e centrifugare a 3500 xg, a 4 ° C per 5 minuti. Trasferire il surnatante contenente la popolazione greggio membrana per pulire i tubi microcentrifuga e immettono sul ghiaccio. Aggiungere 500 ul fresco ghiaccio-cold CRB con inibitori della proteasi in ogni provetta e ripetere il processo di accumulare le membrane. </li><li> Raccogliere le membrane grezzi facendo girare alla massima velocità, 4 ° C in una microcentrifuga da banco per 2 ore. Eliminare il supernatante e risospendere ciascun pellet in 50 microlitri di buffer CFTR ghiacciata. </li><li> In tubi puliti microcentrifuga, miscelare 15 microlitri di ciascuna sospensione colorante con 15 microlitri di carico 2x pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Non bollire i campioni, ciò causerebbe proteine ​​di membrana CFTR e l&#39;altro per formare SDS-aggregati insolubili e denaturare il tag GFP. </li><li> Caricare i campioni con PageRuler Plus. standard proteiche prestained (Fermentas) su un 4-20% Tris / glicina gradiente di gel (NuSep) e funzionare a 150 V per 40 minuti o fino a che il colorante è di fronte al fondo del gel. </li><li> Identificare le cellule che esprimono alti da in-gel fluorescenza. Inserire in un sistema di imaging di fluorescenza come uno scanner Typhoon. Eseguire la scansione del u gelcantare il laser blu a lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 526 nm. Il CFTR-GFP fusione deve essere visibile a circa 220 kDa. Ci sarà anche una banda fluorescente visibile debole a circa 70 kDa che probabilmente è un lievito intrinseca FAD contenente proteina di membrana (come succinato deidrogenasi subunità A) 11,12. </li><li> Colorare il gel con Coomassie, Decolorare ed eseguire la scansione il gel per il confronto con la scansione di fluorescenza mediante una comoda visualizzazione pacchetto di immagini software. Il gel colorato con Coomassie-permette una valutazione relativa di CFTR-GFP livelli di espressione in diverse linee clonali dopo la normalizzazione per la quantità di proteina totale caricato su ciascuna traccia del gel. </li><li> Streak la linea cellulare che esprime più alto dal suo magazzino glicerolo (2.2) su un nuovo YNBA ed incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Questo piatto può quindi essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C. </li></ol> 3. Su larga scala Fermentatore Culture <ol><li> Preparazione pre-culture per il fermentatore. Raschiare uno spazio di 1 centimetro due cellule dal YNBA piastra (2.13) utilizzando un&#39;ansa sterile e aggiungere 45 ml YNB e 5 ml di terreno di glucosio 20%, in modo tale che la OD 600 è circa 0,1. Crescere in beute da 250 ml sconcertati a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione fino a quando la OD 600 raggiunge 1. </li><li> Dividere la cultura tra i due 2 l Erlenmeyer sconcertato palloni contenenti ciascuna 450 ml YNB e 25 ml di glucosio media del 20%. Coltivare queste sul a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione fino a quando la OD 600 raggiunge 1,2. </li><li> Mentre queste pre-culture sono in crescita, impostare il fermentatore. Fare 11.2l di YNB come descritto in 1,1, ma sciogliere un ulteriore 8,28 g YNB e 0,95 g goccia fuori supplemento per compensare l&#39;aggiunta di glicerolo a induzione. Asepsi, aggiungere il l 11,2 YNB e 75 ml di glucosio media del 20% a una nave sterile fermentatore 20L e regolare la temperatura di esercizio di30 ° C. </li><li> Aggiungere asetticamente le precultures al fermentatore e impostare la velocità di agitazione a circa 800 rpm e mantenere la temperatura a 30 ° C. L&#39;aria compressa deve fluire a circa 15 dm 3 min -1. Una volta la cultura fermentatore raggiunge un OD 600 del 1.2, inducono aggiungendo asetticamente la soluzione 1,5 l galattosio YNB 20% glicerolo e 1,2 l. Ridurre la temperatura a 25 ° C e crescere la coltura per 16 ore. </li><li> Trasferire il contenuto fermentatori in centrifuga refrigerata vasi da 1 litro su ghiaccio utilizzando una pompa peristaltica. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.500 xg, a 4 ° C per 30 minuti in un rotore di grande capacità (ad esempio 6 litri). Risospendere le cellule in 150 ml CRB ghiaccio freddo con inibitori della proteasi. Da qui, tutti i lavori deve essere condotta a 4 ° C. </li><li> Lisare le cellule passando attraverso una costante disgregatore cella sistemi in 4 passaggi a 25, 30, 32 e 35 kPa, raccogliendo il lisato su ghiaccio in ciascun caso. In alternativa, utilizzare un bead Beater (Biospec) con un volume uguale di acido lavate perle di vetro 0,5 mm e agitare per 3 minuti a piena potenza. Trasferire il lisato di provette Falcon da 50 ml e il pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 3.500 xg, a 4 ° C per 15 minuti in una centrifuga da banco. </li><li> Trasferire il supernatante in provette da centrifuga refrigerata. Centrifugare a 14.000 xg, a 4 ° C per 30 minuti in una centrifuga per rimuovere mitocondri. </li><li> Trasferire il surnatante in provette ultracentrifuga refrigerati. Centrifugare a 200.000 xg, a 4 ° C per 90 minuti in un&#39;ultracentrifuga per raccogliere microsomi. </li><li> Attenzione decantare e scartare il surnatante e aggiungere 2 ml di buffer CFTR fredda come il ghiaccio con inibitori della proteasi e 1mM DTT in ciascun tubo. Risospendere delicatamente le palline con un pennello, rabboccare ogni tubo con tampone CFTR e mescolare con un miscelatore vortex. </li><li> Centrifugare la sospensione a 200.000 xg, 4 ° C per 60 minuti in un&#39;ultracentrifuga, scartare il pellet supernatante e risospendere in 2 ml ghiacciata CFTR tampone winibitori della proteasi ith (Senza DTT) con un pennello. </li><li> Pool di microsomi risospeso, regolare il volume finale di 50 ml con il tampone CFTR e mescolare bene. Prenota un aliquota 1 ml per analisi SDS-PAGE gel, come descritto in 2,9-2,11. I microsomi possono ora essere lampo congelati in azoto liquido e poi stoccato a -80 ° C fino al momento. </li><li> CFTR può essere estratto da microsomi utilizzando uno dei seguenti: detergenti litio perfluorooctonoate acido (LiPFO), tetradecanoly-liso-fosfatidilglicerolo (LPG14), n-dodecil-β-D-maltoside (DDM). Mescolare le microsomi con tampone CFTR, inibitori della proteasi e il 5% detergente (w / w). Se DDM viene utilizzato, anche aggiungere 300 mM NaCl al buffer. Agitare a 4 ° C per 15 minuti su un rotatore tubo. </li><li> Centrifugare i campioni a 100.000 xg, a 4 ° C per 1 ora in un&#39;ultracentrifuga. Conservare il supernatante e prendere una piccola aliquota di analisi SDS-PAGE gel. CFTR può ora essere purificati dal materiale di metallo immobilizzato solublisedcromatografia di affinità seguita da cromatografia per esclusione di dimensione. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Trasformazione di lievito con il CFTR contenente plasmide non è efficiente al 100%. Un rappresentante di piccole dimensioni dello schermo di espressione CFTR nelle colonie selezionati da un esperimento di trasformazione produrrà circa 1 su 4 colonie che esprimono la proteina. Un tipico risultato di uno schermo di 5 colonie raccolti da una piastra viene mostrato nel pannello A di Fig. 3. Una delle colonie mostra una forte livello di espressione di CFTR-GFP proteina di fusione che si estende tipicamente tra i 250 e 130 kDa marcatori kDa, come mostrato. Le CFTR-GFP livelli di fluorescenza variano considerevolmente tra gli esperimenti, con la colonia di 4 in fig. 3 indica almeno 10 volte superiore a fluorescenza della banda intrinseca fluorescente a circa 70kDa. Se i livelli di espressione di CFTR-GFP sembrano dare meno fluorescenza rispetto alla banda da 70 kDa, allora è probabilmente vale la pena ri-trasformazione e la scelta di una coloniacon alti livelli di CFTR-GFP espressione. Come mostrato in Fig. 3A, è improbabile, anche con un livello di elevata espressione di CFTR-GFP, che il CFTR-GFP banda sarà distinguibile nell&#39;estratto cella da colorazione con Coomassie. Una volta selezionate colonie sono state coltivate in esperimenti scala maggiore, e microsomi isolati, la presenza di CFTR-GFP nei microsomi dovrà essere valutata, come mostrato in fig. 3B. I risultati di questo esperimento sono importanti, non solo per valutare l&#39;efficienza di induzione di espressione, ma anche per verificare che i microsomi sono stati preparati con cura e che la proteolisi è stata minimizzata. I risultati mostrati in fig. 3B implica che in questo esperimento il CFTR-GFP espressione è leggermente inferiore (come giudicato relativa alla banda intrinseca 70kDa) che in piccola scala esperimento mostrato nel pannello A. Tuttavia questa impressione è polarizzato dalla sovraesposizione del rivelatore di fluorescenza in questo misurazione. Questo perché lo sperimentatore era checking per la presenza di frammenti proteolitici del CFTR costrutto. Vi è qualche evidenza in questo esperimento di alcuni frammenti fluorescenti proteolitici tra i 130 kDa e 100 kDa marcatori, ma questi sono molto deboli rispetto alla full-length CFTR GFP-band. Con gli inibitori della proteasi qui descritte, si trovano poche prove per la degradazione proteolitica di CFTR dopo la rottura delle cellule. Se proteolisi significativa si osserva, si consiglia di fare nuove soluzioni stock inibitori della proteasi. Abbiamo anche trovato che le compresse commerciali cocktail inibitore di proteasi non sono efficaci per questo sistema. La crescita di cellule oltre 16 ore (post-induzione) darà luogo ad espressione di CFTR è diminuita come mostrato in Figura 4. Ciò è probabilmente dovuto al turnover della proteina, forse a causa upregulation della macchina lievito controllo di proteine ​​di qualità 6-9,13. Si consiglia pertanto di monitorare i livelli di espressione del gene CFTR dopo induzione con galattosio, se possibile, come il momento ottimale per raccogliere le cellule may varia da un laboratorio all&#39;altro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Figura 1. Il costrutto contenente CFTR lievito plasmide. Il CFTR-GFP-8His fusione viene inserito nel vettore di espressione 2μ p424GAL1, sotto il controllo di un (GAL1) promotore galattosio. Il vettore contiene anche un marcatore di selezione uracile (URA) e un gene di resistenza all&#39;ampicillina (Amp). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Figura 2. Un diagramma di flusso che sintetizza il protocollo visualizzato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentativi SDS-PAGE gel di espressione CFTR e di purificazione. Panel A presenta cinque scelto a caso colonie trasformanti (corsie 1-5) che sono state sottoposte a screening per l&#39;espressione CFTR. Panel B mostra microsomi che sono stati isolati da un ferm 15LInserisci cultura. Panel C presenta purificata CFTR murino ottenuto dopo due fasi di purificazione mediante cromatografia per affinità seguita da cromatografia ad esclusione dimensionale. Tutti i gel vengono visualizzati in condizioni di illuminazione a fluorescenza entusiasmante dal dominio GFP (sinistra) e dopo Coomassie macchia (a destra). Le posizioni relative di standard di peso molecolare sono elencati sulla sinistra (kDa). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Figura 4. Dati rappresentativi per l&#39;espressione di CFTR in lievito. Pannello A mostra un corso di tempo di espressione di CFTR dopo induzione con galattosio. Estratti cellulari sono stati analizzati mediante SDS-PAGE, e la fluorescenza GFP per la CFTR-GFP banda di proteina è stata integrata. B pannello mostra risultati tipici per microscopia a fluorescenza di GFP cellule esprimenti 16 ore dopo l&#39;induzione. Tipicamente, solo una frazione delle cellule esprimono CFTR a livelli elevati.

<ol>
	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo documento fornisce un metodo per l&#39;espressione di CFTR proteina murina in cellule di lievito, che dovrebbe facilitare la ricerca sulla fibrosi cistica. L&#39;obiettivo è di collegare questo articolo con il rilascio del DNA murino CFTR costrutto, che sarà disponibile attraverso la Cystic Fibrosis Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Altro ortologhi dovrebbero essere resi disponibili in seguito. La trasformazione delle cellule di lievito con il vettore contenente CFTR è semplice, ma è importante schermo per colonie che esprimono livelli elevati di CFTR. I livelli di espressione variabili possono derivare da diversi fattori, ma il numero di copie del plasmide per cella rappresenta probabilmente un significativo grado di variazione. Passaggi critici descritti qui dovrebbero consentire la produzione di CFTR che esprimono cellule di lievito e CFTR contenenti le membrane microsomiali. Dopo la trasformazione, la crescita, la raccolta e la lisi delle cellule di lievito sono stati masterizzati, purificazione della proteina dovrebbe essere possibile, e in Figura 3 abbiamo dato un esempio di purezza che dovrebbe essere realizzabile in questo caso come punto di riferimento utile. Non è nostra intenzione in questo manoscritto di fornire metodologia dettagliata per la purificazione della proteina. Tuttavia, ci sono alcuni punti critici di purificazione a valle che sono specifici per il sistema di espressione S.cerevisae, come lisi cellulare e purificazione microsoma, e questi sono stati inclusi in dettaglio in questo manoscritto. Va ricordato, tuttavia, che oltre ai due metodi che abbiamo usato, metodi alternativi di rottura delle cellule di lievito può essere impiegata, come l&#39;uso di una cella di pressione francese. La proteina ricombinante ha un TEV distaccabile dominio C-terminale GFP che consente alla proteina di essere rintracciato dopo induzione (Fig. 4). Lievito hanno una proteina intrinseca 70kDa (probabilmente succinato deidrogenasi 12) che reagisce alle medesime condizioni 11, e questo può fornire un altro utilestandard di calibrazione nale per i livelli di espressione relativi di CFTR in estratti di cellule intere o microsomi (Fig. 3). È evidente dai dati riportati nella Figura 4 che i tempi di raccolta di cellule dopo induzione con galattosio è cruciale. Le rese di goccia CFTR precipitosamente dopo circa 16 ore di induzione, in modo che non vi è quasi alcun CFTR rilevabile in cellule di lievito dopo 24 ore di induzione. La resa di proteina purificata è di circa 1-2mg proteina CFTR cultura fermentatore per 15 litri. Il recupero può essere stimato come circa il 70% del totale CFTR-GFP proteina fino allo stadio microsoma, e circa il 25% di recupero di proteina purificata. Caratterizzazione del S. cerevisiae-espresso CFTR è in corso. Come si vede in fig. 4, posizione della proteina nella cellula può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza. Sebbene il fluorescenza si trova attorno alla periferia della cella come previsto 10, alcune delle proteine ​​mostra una localizzazione puntata, sia in, oappena dentro la membrana plasmatica, che potrebbe essere dovuto ad CFTR riciclaggio con un ritardo Golgi / endosomal percorso 14 o forse a valle del nascente comparto delle vescicole di trasporto dal pronto soccorso 4. Il trattamento con PNGaseF, un enzima che deglycosylates proteine, ha mostrato variazioni minime della migrazione della banda di proteina CFTR su SDS-PAGE, implicando che è non glicosilata, o ha glicosilazione minima 15. Esperimenti sullo stato di fosforilazione della proteina sono in corso. In alcuni dei detergenti testati finora, la proteina purificata visualizza ATPasi (che è inibita da un inibitore specifico CFTR-16) a velocità che sono simili a quelle tradotto 2,15. Misurazione dell&#39;attività canale CFTR richiederà ricostituzione della proteina purificata, che comporterebbe una fase finale di purificazione in un detergente che ha una relativamente alta concentrazione micellare critica (CMC) 17. Lievito microsomi containing CFTR possono essere solublised con vari detergenti comunemente impiegati, tra cui 18 detergenti come dodecil maltoside 2, che sono generalmente considerati &#39;mild&#39;. Tuttavia detergenti cmc più elevati hanno dimostrato di essere inefficiente per solubilsation, finora, suggerendo che lo scambio in questi detergenti devono essere considerati in una fase successiva in qualsiasi schema di purificazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo No </td></tr><tr><td> FGY217 ceppo S.cerevisiae, con delezione 10 PEP4 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lievito base di azoto senza amminoacidi </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Completa miscela senza supplemento uracile </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Agar batteriologico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galattosio </td><td> Pescatore </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Pescatore </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> A pepstatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butano (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl fluoruro (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidina cloridrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiotreitolo (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) </td><td> Pescatore </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pescatore </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodecil-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler Inoltre gli standard di proteine ​​prestained </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly gel gradiente 4-20% </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Immediata Blu Coomassie Stain </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Perle di vetro, lavata con acidi </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml Tubi Falcon sterili </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2 mlSterili tappo a vite fiale </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> Sterile flaconi da 250 ml Erlenmeyer sconcertati </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2l Erlenmeyer sterile sconcertato fiaschi </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Tubi microcentrifuga 2ml </td><td> Sarstedt </td><td> 72,695 </td></tr><tr><td> 0.2μM filtro per siringa </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultracentrifuga tubi </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> provette da centrifuga; </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> Vasi centrifuga 1l </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital scuotendo incubatore con controllo della temperatura </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT restauro microscopio </td><td> Applied Vision </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da banco </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Microcentrifuga da banco </td><td> Pescatore </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex mixer </td><td> Stella Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Trio Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 sistema di imaging </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> Fermentatore nave 20L e unità di controllo </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Constant sistemi cellulari distruttore </td><td> Sistemi di costanti </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater cell disgregatore </td><td> Biospec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultracentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotore 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

Il regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) è un canale cloruro, che quando mutati, può dar luogo alla fibrosi cistica in humans.There è pertanto notevole interesse in questa proteina, ma sforzi per studiare la struttura e attività sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificare quantità sufficienti di proteina 1-3. Come molti &#39;difficili&#39; proteine ​​di membrana eucariotica, espressione in un organismo in rapida crescita è auspicabile, ma impegnativo, e nel lievito S. cerevisiae, finora basse quantità sono stati ottenuti e rapida degradazione della proteina ricombinante è stata osservata 4-9. Le proteine ​​coinvolti nel trattamento di CFTR ricombinante in lievito sono stati descritti 6-9. In questa relazione si descrive un metodo per l&#39;espressione di CFTR in lievito e la sua purificazione in quantità significativa. Il protocollo descrive come i problemi proteolisi precedenti possono essere superati e come livelli di espressione diCFTR può essere notevolmente migliorata modificando le condizioni di crescita cellulare e controllando le condizioni di induzione, in particolare il periodo di tempo prima della raccolta delle cellule. Le reagants associati a questo protocollo (CFTR murino che esprimono le cellule di lievito o plasmidi di lievito) saranno distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation statunitense, che ha sponsorizzato la ricerca. Un articolo che descrive la progettazione e la sintesi del CFTR costrutto impiegato in questa relazione sarà pubblicata separatamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inedito). In questo articolo vi spiegheremo il nostro inizio metodo con la trasformazione delle cellule di lievito con il CFTR costruire - lievito contenente plasmide (Fig. 1). Il costrutto ha una proteina verde fluorescente (GFP) fusa alla sequenza CFTR al suo C-terminale e segue il sistema sviluppato da Drew et al. (2008) 10. La GFP permette l&#39;espressione e la purificazione di CFTR da seguire con relativa facilità. Il protoc JOVE visualizzatofiniture olo dopo la preparazione di microsomi delle cellule di lievito, anche se si comprendono alcuni suggerimenti per la purificazione della proteina dai microsomi. I lettori possono aggiungere proprie modifiche alla procedura di purificazione microsoma, a seconda degli esperimenti finali da effettuare con la proteina e le attrezzature locali a loro disposizione. Il lievito-espresso proteina CFTR può essere parzialmente purificato di ioni metallici con cromatografia di affinità, utilizzando un tag intrinseca purificazione poliistidina. Dopo cromatografia ad esclusione dimensionale produce una proteina che sembra essere&gt; 90% puro, come giudicato da SDS-PAGE e colorazione Coomassie-del gel.

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

I tentativi di esprimere la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Hanno, finora, ha prodotto quantità relativamente basse di proteina. Questo protocollo e dei reagenti associati distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation dovrebbe consentire la preparazione di quantità dell&#39;ordine di milligrammi di questa proteina &#39;difficile&#39; della membrana eucariotica.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

18.4K Views.  University of Manchester. I tentativi di esprimere la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae Hanno, finora, ha prodotto quantità relativamente basse di proteina. Questo protocollo e dei reagenti associati distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation dovrebbe consentire la preparazione di quantità dell'ordine di milligrammi di questa proteina 'difficile' della membrana eucariotica.