Auteurs tiens à remercier Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi et Blair Mell pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des prix du NIH (DK080640) et l&#39;Université de Toledo &amp; ProMedica de bourses de recherche translationnelle de stimulation à M. Surya Nauli.

1. Prétraitement des cellules et la préparation métaphase <ol><li> Les cellules sont cultivées dans la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) contenant 10-15% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2 incubateur, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent 70-80% de confluence. </li><li> Traiter les cellules avec une solution colcémide à 0,05 pg / ml pendant 30-60 min. </li><li> Recueillir le milieu contenant des cellules flottantes dans des tubes stériles de 50 ml à centrifuger faucon. Rincer les cellules sur la plaque avec sterile1X-PBS. Après une incubation avec de la trypsine stérile pendant 1-2 min, la récolte et de recueillir les cellules restantes dans le même tube. </li><li> Faites tourner les tubes à 1000 rpm pendant 5 min, aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml et desserrer culot en feuilletant avec le doigt uniquement. </li><li> Selon la taille de granulés, ajoutez 5-10 ml de solution hypotonique de KCl 0,56% en dH 2 O et incuber la suspension à 37 ° C pendant 30-45 min. </li><li> Ajouter une goutte de méthanol / acide acétique(03:01 vol / vol) par ml de suspension cellulaire hypotonique et inverser le tube avec précaution pour mélanger. </li><li> Centrifuger à 1200 tours par minute pendant 5 minutes et recueillir des granules comme l&#39;étape 1.4, puis ajoutez 5 ml de méthanol frais / acide acétique (3:1 vol / vol) goutte à goutte la solution de fixation tout en feuilletant le culot en continu. Cette procédure est essentielle afin que les étalements métaphasiques ne sera pas pris au piège dans les touffes des cellules qui pourraient compromettre l&#39;expérience. </li><li> Centrifuger de nouveau à 1200 rpm pendant 5 min et ajoutez 5-10 ml de méthanol glacé / fixateur acide acétique le long de la paroi du tube. A ce stade, si nécessaire, les cellules peuvent être stockées dans la solution de fixation dans un tube serré et scellé à -20 ° C à court terme ou -80 ° C pour le long terme (années) pour une utilisation future. </li><li> Diapositives Propreté dans l&#39;éthanol absolu, puis trempez la diapositive dans dH 2 O pendant approximately10X afin de former une gaine de l&#39;eau sur la surface de la diapositive. Placer la lame sur une plaque de verre et de baisse de 15 20 pi de suspension cellulaire (de l&#39;étape 1.8) De 10 &quot;au dessus de la diapositive. Placez la lame dans un bain-marie réglé à 65-70 ° C pendant 1-2 min et laisser sécher. </li><li> Vérifiez la lame sous un microscope optique 10x et 40x en utilisant un objectif à sec en s&#39;assurant qu&#39;il existe des chromosomes en métaphase et les pâtes à tartiner sont régulièrement espacées. Vérification de la présence cytoplasme entourant les chromosomes. Si cytoplasme est présente procéder à un prétraitement diapositive (digestion par la pepsine), si aucune cytoplasme est présente et les chromosomes ont une bonne morphologie, alors il n&#39;ya pas besoin de prétraitement diapositive. </li></ol> 2. Prétraitement de diapositives (la pepsine de traitement) <ol><li> Appliquer 120 pi de 1:200 RNase solution (20 mg / ml) dissous dans 2X SSC-sur une lamelle de microscope 24 mm x 60 mm et inverser la surface de glissement vers le bas sur la métaphase de la lamelle, puis doucement la surface de glissement métaphase et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Retirez délicatement la lamelle sans rayer la lame et laver dans 2X SSC-tampon dans une jarre Coplin toutes les 5 min pendant 15 minavec agitation. </li><li> Ajouter 5-15 ul de la solution mère la pepsine (100 mg / ml dans dH 2 O) dans un bécher propre, puis ajouter 100 ml d&#39;préchauffé (37 ° C) 0,01 M HCl. Il est important que la pepsine est ajouté dans un récipient propre bécher d&#39;abord et non pas directement dans la solution de HCl, sinon il ne serait pas dissoudre dans une solution. Incuber la lame dans une jarre Coplin contenant la solution de HCl / pepsine à 37 ° C pendant 3-5 min. Cette étape est très critique que la digestion trop de provoquer des chromosomes à overdigested et trop peu sortir de la digestion du cytoplasme non digérés qui pourrait conduire à une liaison non spécifique de la sonde et interférer avec le signal d&#39;hybridation. </li><li> Laver la lame dans une jarre Coplin contenant 100 ml 1X-PBS pendant 5 min à deux reprises à la température ambiante. </li><li> Laver la lame dans une jarre Coplin contenant 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 pour 5 min à température ambiante (50 ml de 1M MgCl 2 dans 950 ml d&#39;1X-PBS). </li><li> Placez la lame dans un pot de containin Coplin100 g ml de formaldéhyde à 1% pendant 10 min à température ambiante (1,7 ml de formaldéhyde 37% dans 100 ml d&#39;1X-PBS/MgCl 2). </li><li> Laver la lame dans une jarre Coplin contenant 100 ml 1X-PBS pendant 5 min. </li><li> Observer la lame sous un microscope optique à l&#39;aide 40X objectif à sec afin de s&#39;assurer que les lames sont digérés correctement et aucun cytoplasme est présent et la morphologie des chromosomes est conservé. Sélectionnez une zone pour l&#39;hybridation à l&#39;aide d&#39;un stylo en diamant. </li></ol> 3. Dénaturation des chromosomes et de la sonde et l&#39;hybridation <ol><li> Préparer une nouvelle solution de dénaturation (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) et préchauffer à 70-80 ° C dans une jarre Coplin placée dans un bain d&#39;eau Lieu de la diapositive dans la jarre Coplin contenant la solution dénaturante dans un bain d&#39;eau à 70 ° C pour les chromosomes de souris et de 80 ° C pour les chromosomes de l&#39;homme pour 30s-1.5 min. </li><li> Immédiatement placer la lame dans la glace froide d&#39;éthanol à 70% pendant 3 min puis 80% et éthanol à 100% pendant 3 min chacun et l&#39;air sec. Examinez la lamepour la morphologie des chromosomes. La morphologie des chromosomes Bon est notée par les chromosomes sombres et pas &quot;phase-légers&quot; ou halo chromosomes. </li><li> Réchauffez la sonde SkyPaint (kit de peinture SKY; flacon n ° 1) à 37 ° C avec agitation pendant 20 min, vortex et centrifuger brièvement à 1000 rpm pendant quelques secondes. </li><li> Dénaturer la sonde dans un thermocycleur programmé pour un cycle de deux étapes à 85 ° C pendant 5 min du cycle suivi par 37 ° C pendant 60 min pour permettre marqué-sonde d&#39;ADN pour prérecuit. </li><li> Appliquer 10 pi de la sonde dénaturée sur la zone d&#39;hybridation et de la couverture avec un 22 mm x 40 mm lamelle veillant à ne pas emprisonner des bulles d&#39;air. Sceller les bords de la lamelle avec du ciment caoutchouc et incuber dans une chambre humide à 37 ° C pendant 48-72 heures. </li></ol> 4. Sonde de détection fluorescente <ol><li> Retirer la lamelle avec soin et placer la lame dans une jarre Coplin contenant préchauffé (45 ° C) une solution de lavage I (fraîchement préparé du formamide à 50% en 2X SSC). Laver pendant 5 mintrois fois à 45 ° C dans un bain-marie à agitation à 45 rpm </li><li> Laver la lame dans la solution de lavage II (1X SSC) à 45 ° C pendant 5 min à deux reprises avec agitation. </li><li> Laver la lame dans la solution de lavage III (4X SSC/0.1% de Tween 20) pendant 5 min à 45 ° C avec agitation. </li><li> Appliquer 80 pi de réactif de blocage (kit de peinture SKY; flacon # 2), placer une lamelle et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirer la lame et permettre au fluide de s&#39;écouler. Appliquer 80 pi de Cy5 réactif de coloration (concentré Anticorps détection CAD kit; flacon n ° 3), appliquer une lamelle et incuber à 37 ° C pendant 40 min. </li><li> Laver la lame avec la solution de lavage III à 45 ° C pendant 5 min trois fois avec agitation. </li><li> Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5.5 (concentré Anticorps détection CAD kit; flacon n ° 4), placer une lamelle et incuber à 37 ° C pendant 40 min. </li><li> Laver la lame avec la solution de lavage III à 45 ° C pendant 5 min trois fois avec agitation. </li><li> Inclinez la diapositive et de permettre au fluide de<html> égouttez-les. Appliquer 20 ul du réactif anti-fade DAPI (kit de peinture SKY; flacon n ° 5) et placer un 24 mm lamelle de microscope x 60 mm. Retirez soigneusement les bulles d&#39;air qui peuvent se former. Les diapositives peuvent être visualisés immédiatement ou conservés à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant une durée n&#39;excédant pas 1 semaine. </li></ol> 5. L&#39;acquisition des images et l&#39;analyse <ol><li> L&#39;acquisition des images se fait en regardant des diapositives en métaphase en utilisant un microscope Olympus équipé d&#39;une lentille à immersion d&#39;huile 60X, un cube spectral (conçus sur mesure triple filtre passe-bande), un filtre DAPI et un module interféromètre de Sagnac avec une caméra CCD. </li><li> Spectral-caryotypes ont été effectuées en utilisant le logiciel Sky View (Applied Version imagerie spectrale 1,62) suivant le manuel de l&#39;utilisateur. </li><li> Après avoir analysé les images, les chromosomes peuvent être considérées comme des images en couleur (avec des couleurs spécifiques fluorescents), les images couleur pseudo (avec des couleurs pour la classification) et des images renversées DAPI (spécifique motif de bandes). </li></ol>e_title &quot;&gt; Résultats représentant 6. Une procédure complète du ciel prend habituellement environ une fois par semaine (figure 1). Cela comprend l&#39;acquisition d&#39;images et d&#39;analyse à condition que les cellules en métaphase sont en quantité suffisante. L&#39;analyse du caryotype révèle un caryotype normal de la souris (40, XY) des cellules de souris de type sauvage (figure 2a). En revanche, les cellules de PKD1 - / - de la souris (modèle de souris PKD) montre une augmentation significative du nombre de chromosomes et des anomalies structurelles, telles que des délétions chromosomiques (chromosome n ° 8) et des translocations des chromosomes (n ° 11 et 19) (Figure 2b). Nous avons également analysé les tissus vasculaires des patients PKRAD. Une simple étude en comptant les nombres chromosomiques ont indiqué que la non-PKRAD et quelques échantillons PKRAD vasculaires étaient normaux nombres chromosomiques de 23 paires (figure 2c). En général, cependant, nous avons observé l&#39;échec de la ségrégation chromosomique, résultant dans 46 paires de chromosomes dans uneÉchantillons DPKD au lieu de 23 paires (figure 2d). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme protocole SKY. Diagramme du protocole SKY illustre les étapes pour mener à bien une expérience à partir de prétraitement des cellules et des préparations métaphasiques à l&#39;acquisition de l&#39;image et l&#39;analyse. Un approximative d&#39;une semaine calendrier est présenté sur la gauche à l&#39;étape-par-étape des procédures pour chaque jour. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> Figure 2. Caryotype spectral sur des lignées cellulaires immortalisées de souris fraîchement isolés et les cellules humaines primaires. Couleur et inversées images DAPI de chromosomes individuels ne soient présentées avant le tri chromosomique. Après le tri, les chromosomes sont présentés dans le &quot;classement&quot; de table. Une image du ciel) d&#39;une propagation de la métaphase souris de type sauvage contient un caryotype normal (40, XY). B) </stl&#39;image rong SKY&gt; d&#39;une propagation de la métaphase PKD1 - / -. la souris indique le nombre anormal de chromosomes (68 au lieu de 40) et des anomalies chromosomiques telles que des délétions chromosomiques (chromosome n ° 8) et translocations chromosomiques (chromosomes n ° 11 et 19) c) SKY l&#39;image d&#39;une propagation métaphase à partir du tissu vasculaire d&#39;un patient non-PKRAD a caryotype normal (46, XX). d) l&#39;image d&#39;une propagation SKY métaphase à partir du tissu vasculaire d&#39;un patient PKRAD contient caryotype anormal (92, XXXX). Une partie des données ont déjà été signalés et réutilisé avec sa permission 14.

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N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Caryotype spectral (SKY) est une technique utilisée dans l&#39;étude cytogénétique des compositions génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, et la détection de ces sondes sont acquis par un interféromètre de Sagnac. Le processus complet SKY prend habituellement environ une semaine, et il comporte plusieurs étapes clés (figure 1). Le SKY utilise un protocole standard, qui a d&#39;abord été décrit par Padilla Nash et al 3....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / streptomycine </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de solution saline tamponnée au </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY peinture sonde kit (Human) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY peinture sonde kit (souris) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Concentré kit de détection des anticorps </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Le formamide </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> préparer juste avant utilisation </td></tr><tr><td> De Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de verre de microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope couvercle en verre 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Colle de caoutchouc </td><td> Elmer (locales magasin de détail) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hybridation / humidifiedchamber / Plateau </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> mettre des serviettes en papier humide au fond </td></tr><tr><td> Thermocycleur </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Secouant la plate-forme / Agitateur orbital </td><td> Bellco biotechnologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Secouant salle de bain / eau </td><td> Précision scientifique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filtre cube </td><td> Technologie Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filtre cube </td><td> Technologie Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé culture cellulaire </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> IX70 </td><td> Huile de 60X </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Méthode conventionnelle pour identifier et classer des chromosomes individuels dépend de la configuration unique des bandes de chaque chromosome dans une espèce spécifique en cours d&#39;analyse 1, 2. Cette technique classique de baguage, cependant, n&#39;est pas fiable dans l&#39;identification des aberrations chromosomiques complexes tels que ceux associés au cancer. Pour surmonter les limites de la technique de baguage, caryotype spectral (SKY) est introduite pour fournir beaucoup d&#39;informations fiables sur les anomalies chromosomiques. SKY est une fluorescence multicolore hybridation in situ (FISH) technique pour détecter les chromosomes en métaphase avec un microscope spectrale 3, 4. SKY a été prouvé être un outil précieux pour l&#39;analyse cytogénétique d&#39;un large éventail d&#39;anomalies chromosomiques associées à un grand nombre de maladies génétiques et les tumeurs malignes 5, 6. SKY implique l&#39;utilisation de sondes multicolores d&#39;ADN par fluorescence-labellisés préparés à partir de l&#39;oligonucle dégénéréeamorces otide par PCR. Ainsi, chaque chromosome a une couleur spectrale unique après dans-in situ hybridation avec des sondes, qui sont marquées de façon différentielle avec un mélange de colorants fluorescents (rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC et Cy5.5). Les sondes utilisées pour SKY comporter jusqu&#39;à 55 sondes chromosomiques spécifiques 7-10. La procédure pour SKY comporte plusieurs étapes (Figure 1). SKY nécessite la disponibilité de cellules avec index mitotique élevé à partir de tissu normal ou malade ou de sang. Les chromosomes d&#39;une cellule unique à partir d&#39;une cellule fraîchement isolés primaire ou une lignée cellulaire sont étalées sur une lame de verre. Cette propagation chromosome est marqué avec une combinaison différente de colorants fluorescents spécifiques pour chaque chromosome. Pour sonde de détection et d&#39;acquisition d&#39;image, le système d&#39;imagerie spectrale se compose de l&#39;interféromètre de Sagnac et une caméra CCD. Ceci permet de mesurer le spectre de la lumière visible émise par l&#39;échantillon et d&#39;acquérir une image spectrale vientchromosomes m individuels. HiSKY, le logiciel utilisé pour analyser les résultats des images capturées, fournit une identification facile des anomalies chromosomiques. Le résultat final est une métaphase et une image de classification caryotype, dans lequel chaque paire de chromosomes a une couleur distincte (figure 2). Cela permet une identification facile des identités et des translocations chromosomiques. Pour plus de détails, s&#39;il vous plaît visitez le site Web Applied Spectral Imaging ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY a été récemment utilisé pour l&#39;identification des défauts de ségrégation des chromosomes et des anomalies chromosomiques chez l&#39;homme et la souris avec rénale autosomique dominante polykystique (PKRAD), une maladie génétique caractérisée par un dysfonctionnement dans les cils primaires 11-13. En utilisant cette technique, nous avons démontré la présence de la ségrégation des chromosomes anormaux et anomalies chromosomiques chez les patients PKRAD et des modèles de souris 14. Des analyses plus poussées en utilisant SKY non seulement nous a permis d&#39;identifier nombre chromosomique et de l&#39;identité, mais aussi de détecter avec précision très complexes aberrations chromosomiques telles que des délétions chromosomiques et des translocations (figure 2).

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Caryotype spectral (SKY) est une technique avancée cytogénétique à identifier aberrations génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, ce qui permet la classification de tous les chromosomes. SKY peut également identifier des aberrations chromosomiques complexes et les défauts d&#39;isolement chez les souris et les humains atteints de diverses maladies, y compris la maladie polykystique des reins.

Caryotype spectral pour l&#39;étude d&#39;anomalies chromosomiques dans les humains et les souris de la maladie polykystique des reins

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K vues.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Caryotype spectral (SKY) est une technique avancée cytogénétique à identifier aberrations génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, ce qui permet la classification de tous les chromosomes. SKY peut également identifier des aberrations chromosomiques complexes et les défauts d'isolement chez les souris et les humains atteints de diverses maladies, y compris la maladie polykystique des reins.

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Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Transplantation orthotopique aortique chez la souris pour l&#39;étude des maladies vasculaires

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Recherche

Médecine

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

5/6e néphrectomie en association avec High Salt Diet Nitric Oxide Synthase et inhibition pour provoquer la maladie rénale chronique chez le rat Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

L&#39;évaluation de la fonction vasculaire chez les patients atteints de maladie rénale chronique

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

L&#39;utilisation de l&#39;IRM de terrain ultra-haute dans les modèles petit rongeur de la maladie polykystique des reins pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Phénotypage and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Symmetric Bihemispheric Postmortem cerveau de coupe pour étudier en santé et états pathologiques du cerveau chez les humains

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Un modèle pour Simuler Hypoxie cliniquement importants chez les humains

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

Livraison d’un miARN exogène synthétisé artificiellement dans le rein à l’aide de nanoparticules de polyéthylènemine dans plusieurs modèles murins de maladie rénale

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...