Assistance technique fournie par Jaipreet Bharj. Ce travail a été financé par des subventions du FP7-UE (SYSCILIA -241 955) et le rein Fondation néerlandaise (CP11.18).

Déclaration éthique: animaux, l&#39;élevage, l&#39;entretien et les procédures sont définies et contrôlées par la Loi 1986. Tous expérimentation animale a été réalisée sous licences accordées par le ministre de l&#39;Intérieur (PIL n ° 70/7892) en conformité avec biologique Animaux (Scientific Procedures) Services de Groupe de gestion et le comité d&#39;éthique services biologique, SGUL, Londres, Royaume-Uni. Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d&#39;animaux utilisés et d&#39;affiner les procédures et l&#39;élevage afin de minimiser la souffrance et améliorer le bien-être. 1. Préparation des instruments, anesthésique et Fluorescent Dye <ol><li> Utilisation d&#39;un étirage de micropipettes et les capillaires standard de borosilicate de paroi (sans filaments) tirer les aiguilles de longueur appropriée pour la micro-injection (figure 1A). </li><li> Faire un moule agarose pour l&#39;orientation des embryons pour injection facile dans le péricarde (figure 1B). Colle environ dix verre microscope slides ensemble pour former un «escalier» de diapositives offset. Pour de meilleurs résultats, utilisez une goutte de colle époxy rapide jeu de résine dans le centre de chaque diapositive. </li><li> Découpez une section d&#39;environ 78 mm de longueur à mi-chemin à travers deux pipettes 10 ml en plastique à l&#39;aide d&#39;un scalpel chauffé bec Bunsen, retirez pipette se termine comme il convient. Attachent et les articles de la colle (résine époxy) de pipette aux lames de verre empilés pour fournir la stabilité pour permettre le moule de puiser dans un plat de 90 mm de Pétri. Faites tous les efforts pour assurer les coins de diapositives alignent perpendiculaire à la chaussée plat Petri. Prévoyez du temps de colle à définir. </li><li> Casting de moule dans une solution d&#39;agarose à 2% dans l&#39;eau fait de poisson (obtenu à partir de l&#39;aquarium). Verser agarose dans une boîte de Pétri de 90 mm et placez le moule sur le dessus de la boîte de Pétri ouverte, permettant la diapositive empilés bords de submerger à un angle sous la surface de la gélose. Laisser reposer sur le banc de laboratoire pendant 30 min. </li><li> Retirer le casting de diapositives et couvrir l&#39;agarose coulissant imprimé avec de l&#39;eau du poisson fraiscontenant Tricaine anesthésie (voir l&#39;étape 1.9) dans un rapport 1:25. </li><li> Assurez solutions de rhodamine dextran (RD) colorant. Remettre en suspension rhodamine B 10 000 MW étiqueté dextran dans l&#39;eau ultra-pure autoclave pour obtenir une concentration du stock de 50 mg / ml. Pour la micro-injection, diluer davantage le stock à une concentration finale de 5 mg / ml dans l&#39;eau ultra-pure autoclave. NOTE: cellules pigmentées commencent à se différencier chez le poisson zèbre de 24 heures après la fécondation (HPF); ceux-ci peuvent obscurcir marqueurs fluorescents lors de l&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Inhiber la formation des mélanocytes à l&#39;aide de N -Phenylthiourea (PTU), qui bloque la mélanogenèse par inhibition de la tyrosinase. Faire une solution d&#39;achat d&#39;actions de 0,003% des PTU en dissolvant la poudre dans de l&#39;eau PTU aquarium, solution de la chaleur à 60 ° C pour solubiliser totalement. </li><li> Incuber embryons de poisson zèbre en solution de bleu de méthylène, un fongicide doux, pour éviter la prolifération de champignons et augmenter la survie. Ajouter 2 ml de solution stock méthylène bleu, contenant 0,1% de bleu de méthylène dans ueau ltrapure, à 1 L d&#39;eau de l&#39;aquarium et de l&#39;utilisation en tant que moyen d&#39;embryons standard. </li><li> Faire un 15 mM concentration stock de tricaïne méthanesulfonate / éthyl-3 benzoate comme indiqué dans «Le poisson zèbre livre &#39;23. Anesthésier les embryons et par conséquent les immobilisé pour effectuer la procédure de micro-injection. </li><li> Après anesthésier les embryons, les orienter, pour l&#39;imagerie en utilisant les propriétés non-toxiques et visqueux de méthylcellulose. Pour faire un 200 ml préparation de 3% de méthylcellulose, chill 130 ml d&#39;eau à -20 ° C pendant 30 min et placer sur la glace. Chauffer 70 ml d&#39;eau à 80 ° C dans un bêcher en verre, ajouter 6 g de méthylcellulose, et agiter à l&#39;aide d&#39;une baguette de verre jusqu&#39;à ce que toutes les particules sont mouillées et dispersées uniformément. Ajouter l&#39;eau glacée, mélanger et laisser la préparation refroidir à 4 ° C pendant 30 min avant aliquotage en tubes de 50 ml. REMARQUE: abaissement de la température permet la méthylcellulose à devenir soluble. La solution deviendra plus épaiscomme les hydrates de poudre. 3% de méthylcellulose peut être stocké sans croissance bactérienne pour de courtes périodes d&#39;une semaine à 4 ° C ou plus à -20 ° C. Assurez-vous que la méthylcellulose a atteint RT avant utilisation. </li><li> Pour effectuer des injections de colorant fluorescent dans le poisson zèbre utiliser un micro-injection set-up standard (figure 1C). Il se agit d&#39;un compresseur d&#39;air relié à un système de régulation de pression qui alimente un porte-pipette directement pour une utilisation avec 1,0 capillaires de diamètre extérieur. Le titulaire de la pipette doit être logé à l&#39;intérieur d&#39;un micromanipulateur compact contrôle 3-MM33 axe solidaire d&#39;une plaque de base en acier par un support magnétique. Les embryons peuvent être visualisées, manipulé et injecté au moyen d&#39;un microscope à dissection stéréo. </li></ol> 2. poisson zèbre élevage et de traitement pré-injection <ol><li> Maintenir le poisson zèbre comme décrit précédemment 23. Utilisez un aquarium set-up qui fournit l&#39;eau de recirculation fourni à une température constante de 28,5 ° C, Conditionné à un pH de 6.8 à 7.2 et une conductivité de 450 à 550 pS avec du bicarbonate de sodium et Instant Ocean sel de mer, respectivement. Utilisez type sauvage ou des lignes de poisson zèbre transgénique, le cas échéant à l&#39;expérience, le maintien d&#39;une densité de stockage de 15 hommes 15 femmes par 8 L réservoir. Réglez le photocycle des installations de poisson à 14 h de la lumière du jour entre 9 heures-23 heures. </li><li> Frai du poisson zèbre commence au début de la photocycle, lorsque les lumières se allument dans la matinée. Pour assurer un maximum d&#39;œufs peuvent être collectées sans déranger les poissons, plongez bassins d&#39;élevage (contenant des inserts en mesh, disponibles auprès des spécialistes de poisson zèbre) dans les réservoirs de stockage de type sauvage le soir avant la collecte. </li><li> Le jour de la collecte, permet 30 à 40 min pour les poissons pour frayer, après quoi recueillir et rincer œufs à l&#39;aide d&#39;une passoire à thé et de l&#39;eau de l&#39;aquarium frais. Déposer les œufs nettoyés dans un milieu contenant des embryons de 90 mm de boîte de Pétri et incuber à 28,5 ° C. </li><li> Traiter les embryons avec PTU pour inhiber mélanogenèse. A 8 HPF, transférer des embryons viables dans le liquide minimal pour des plats frais de Pétri contenant 1: 100 PTU à moyen de l&#39;embryon et incuber encore à 28,5 ° C jusqu&#39;à 72 HPF. REMARQUE: PTU peut causer des anomalies de développement se il est utilisé à des stades antérieurs devraient donc être restreintes pour poster huit étapes de HPF, mais peut être traitée aussi tard que 24 HPF. Plus tardive des PTU ne bloque pas entièrement la pigmentation des yeux, mais est généralement couronnée de succès et en inhibant la formation de tronc mélanocytes. </li></ol> 3. microinjection NOTE: Le péricarde entoure le cœur, mais est séparé pour la protection et la facilité de mouvement cardiaque par le fluide dans la cavité péricardique. L&#39;objectif de cette procédure consiste à injecter RD dans la cavité péricardique, cela permet une absorption rapide du colorant au système de vascularisation. <ol><li> aiguilles de charge avec 6 pi - dilués RD, à l&#39;aide des conseils de microloader et sécurisé dans le support de l&#39;aiguille du micromanipulateur. Casser la fin de l&#39;aiguille à l&#39;aide bien tippforceps ed (figure 1A). Déplacez la solution de RD à la pointe de l&#39;aiguille en maximisant la durée d&#39;impulsion pour le réglage des minutes, revenir à msec une fois terminé. </li><li> Utiliser un micromètre, le régulateur de pression, et des améliorations à la longueur de la pointe de l&#39;aiguille (en utilisant une pince) pour ajuster la taille de la gouttelette expulsé à 100 m de diamètre, ce qui équivaut à un volume de 0,5 nl (figure 2A). REMARQUE: Lorsque l&#39;aiguille se casse, veillez à ne pas casser trop large sinon il fera calibrer le volume d&#39;injection difficile. Si nécessaire, briser encore la pointe de l&#39;aiguille d&#39;augmenter la taille des gouttes cependant conserver une épaisseur d&#39;aiguille qui permet l&#39;entrée dans le péricarde sans flexion excessive ou des dommages aux tissus. </li><li> Avant l&#39;injection, anesthésier les embryons dans le milieu de l&#39;embryon contenant tricaïne. Mettre en place 2 x 35 mm boîtes de Pétri contenant 5 ml de milieu d&#39;embryon, une étiquette &#39;Tricaine&#39; et l&#39;autre &#39;Recovery&#39;. </li><li> Ajouter 200ul de stock tricaïne à l&#39;antenne dûment étiquetés. Une fois prêt à injecter, sélectionnez un embryon individuelle à 72 HPF et transférer dans un liquide minimale au plat tricaïne. Surveiller l&#39;activité de l&#39;embryon, tester l&#39;embryon est anesthésié et immobilisé par agitation douce en utilisant une pointe de microloader tronquée. </li><li> Transférer l&#39;embryon anesthésié au moule d&#39;injection et orienter l&#39;embryon à l&#39;intérieur d&#39;une auge d&#39;agarose sorte que le côté gauche soit vers le haut, le positionnement du coeur à la gauche du champ de vision. </li><li> Pour injecter la RD dans le cœur, le péricarde percer avec l&#39;aiguille et injecter 1 nl de RD dans la cavité péricardique de l&#39;embryon anesthésié (figure 2B, panneau de droite). Retirer l&#39;aiguille après l&#39;injection. Transférer l&#39;embryon injecté dans le liquide minimal à &#39;plat de récupération &quot;et surveiller pendant 1 min. Transférer l&#39;embryon individu à une plaque de 24 puits contenant 1 ml de milieu d&#39;embryons frais (contenant PTU) et étiqueter correctement. REMARQUE: Le péricarde est difficile, mais il ya un point faible notable à l&#39;intersection où le péricarde répond aux arcs pharyngiens ventro-caudal et dorso-rostrale sac vitellin (figure 2B) flèche. L&#39;aiguille doit être adressée à cette rainure. Lorsque l&#39;aiguille est en place, un robinet cabinet d&#39;un doigt sur le dessus du micromanipulateur va faciliter l&#39;entrée dans la cavité péricardique. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour au moins 10 embryons par groupe expérimental, placez chaque poisson dans un puits séparé et unique labelto permis individuels expérimentaux suivis. Incuber à 28,5 ° C pendant 3 heures. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> À 3 h injection de poste (HPI) anesthésier embryons comme décrit précédemment et transférer dans un plat de 35 mm de Pétri contenant 3% de méthylcellulose. Poussez doucement embryons dans la méthylcellulose et d&#39;orienter de sorte que le côté latéral peut être imagée. </li><li> Acquérir une image de l&#39;embryon sous UV en utilisant un filtre pour la visualisation of lumière émise à 570 nm (figure 2C). Après l&#39;acquisition de l&#39;image, permet de récupérer l&#39;embryon avant de remplacer dans le puits désigné. Acquérir des images pour tous les embryons injectés et incuber encore à 28,5 ° C. NOTE: Dans ce protocole, nous avons utilisé un stéréomicroscope fluorescente avec un jeu de filtres de TXR, une caméra DFC300FX et logiciels d&#39;application respective. Prenez note des paramètres d&#39;acquisition exactes pour l&#39;acquisition de l&#39;image suivante. </li><li> Au 24 HPI, acquérir un second tour d&#39;images tel que décrit ci-dessus. Une fois que toutes les images ont été acquises, à la fois à 3 et 24 HPI HPI, humainement disposer des embryons ou à d&#39;autres moyens expérimentaux par exemple, immunohistochimie. </li></ol> 5. Traitement d&#39;image <ol><li> Quantifier intensité de fluorescence de chaque embryon injecté, à 3 et 24 HPI HPI, en analysant des images en utilisant le logiciel ImageJ du NIH. Pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence, ouvrir une image dans ImageJ et spécifiez une région d&#39;intérêt (ROI) à 100 px (sélection Edit → → préciser) 2. </li><li> Positionner le coeur dans le centre de la ROI (figure 2C), réglez mesures pour y inclure l&#39;échelle de gris moyen et environs (Analyser → ensemble des mesures), effectuer une mesure (Analyser → mesure). Remplissez pour chaque ensemble d&#39;images, à 3 et 24 HPI HPI, par embryon et de transférer des valeurs moyennes d&#39;échelle de gris vers un tableur pour traitement ultérieur. NOTE: Nous avons choisi une taille de roi fixe de 100 px 2 car cela englobe coeurs individuels entre embryons. Le cœur a été choisi pour effectuer des mesures en raison de la taille importante qui permet à un emplacement commode pour mesurer la teneur fluorescent du sang avant d&#39;entrer dans le rein. </li><li> Effectuer une analyse statistique en utilisant un logiciel statistique appropriée. Comparer des groupes de signification statistique en utilisant le test t de l&#39;élève. </li></ol>

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Poisson zèbre offre un outil précieux pour modéliser les maladies génétiques humaines, leur utilisation comme un instrument scientifique pour la recherche in vivo ont permis des études détaillées de la répartition génétique de nombreux systèmes biologiques, y compris le rein. Une grande partie est maintenant compris comment le rein poisson zèbre se développe et fonctionne. Les similitudes frappantes avec néphrogenèse humaine et d&#39;homologie avec la maladie causant des gènes 21 a m...

Le rein humain joue un rôle crucial dans le filtrage des déchets métaboliques du sang et la récupération de solutés nécessaires pour maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. Il existe un certain nombre de maladies génétiques humaines qui provoquent un dysfonctionnement rénal. La maladie rénale héréditaire la plus fréquente est autosomique polykystose rénale dominante (PKD) caractérisé par le développement des sacs remplis de fluide dans les tubules néphrétiques; les dommages causés par la cystogénèse est préjudiciable à la fonction rénale 10. ADPKD a une occurrence de 1: 800-1: 1000 et représente 8 à 10% des patients en insuffisance rénale au stade terminal (ESRF) 11. Plusieurs gènes ont été impliqués pour provoquer ADPKD y compris polycystine-1 (PKD1) et -2 (PKD2), représentant environ 85% et 15% des cas respectivement 12,13. En outre, les produits de gènes pour PKD1 et -2 localiser le cil et sont fondamentales pour ciliogenèse 14,15. Il ya maintenant une famille reconnue de troubles génétiques humains, connus sous le nomles ciliopathies, qui affectent la fonction des cils et se traduisent par CKD 16. Le nombre croissant de maladies génétiques humaines qui affectent le développement et la fonction ciliaire suscite l&#39;intérêt mondial dans cet organite résiduelle autrefois considéré. Le cil, une saillie cellulaire ressemblant à des cheveux, est enrichi avec les récepteurs et les canaux nécessaires à la transduction des événements de signalisation cellulaire clés d&#39;ions. Le cil est constitué d&#39;une base de axoneme microtubules, typiquement structuré en neuf doublets de microtubules disposés radialement, avec ou sans une paire centrale de microtubules de singulet. La structure de axonémale définit le type et le mode d&#39;action ciliaire. L&#39;arrangement des microtubules 9 + 2 confère à la motilité du cil où il est utilisé dans le déplacement des fluides à travers les surfaces epitheliales. La configuration 9 + 0 est non mobiles, mais est considéré principalement fonction des événements de signalisation cellulaire 17. En dehors de CKD, les conséquences de la dysfonction ciliaire sont un ensemble de caractéristiquescaractéristiques de ciliopathie qui comprennent, l&#39;obésité, la dégénérescence rétinienne, une polydactylie, et la déficience cognitive 16. Cependant, CKD est parmi les plus préjudiciables à la qualité de vie du patient et donc une force motrice majeure derrière le développement de appropriée dans des modèles in vivo pour ciliaire liés CKD. Le poisson zèbre est un excellent modèle pour comprendre l&#39;étiologie de la maladie génétique humaine. Leur développement rapide, la production d&#39;un grand nombre d&#39;œufs, tissu transparent, et la croissance ex utero permet processus de développement de poisson zèbre pour être visualisées et événements biologiques manipulés avec beaucoup d&#39;aisance. Les gènes peuvent être génétiquement modifiés en utilisant le récent succès d&#39;outils d&#39;édition de génome (CRISPR 18 et 19 TALENS), renversé en utilisant la technologie antisens morpholino 20, ou pharmacologiquement réglementés par l&#39;addition de composés à leur environnement aquatique. En effet, le poisson zèbre offre une plate-forme pour entreprendre eXperiments qui ne sont pas permissives dans d&#39;autres modèles animaux. Alors que le poisson-zèbre sont des vertébrés relativement simples (par rapport à l&#39;homme), ils partagent de nombreux organes fonctionnellement conservés, des gènes et des processus de signalisation en commun avec les humains. Par exemple, le rein poisson zèbre est remarquablement similaire en structure et la fonction par rapport à l&#39;homme 21,22. Cependant, contrairement au rein de mammifère qui se développe à travers une succession de phases, chacune marquée par un rein plus développé (pronéphros, mésonéphros métanéphros), et, le poisson zèbre embryonnaire ne se développe un pronéphros, la forme la plus immature d&#39;un rein. Alors que des millions de néphrons peuvent être trouvés formant les blocs de construction de rein de mammifère, l&#39;embryon de poisson zèbre possède seulement deux. Le glomérules, qui permettent pour le filtrat sanguin initial, sont fusionnés à la ligne médiane ventrale juste à l&#39;aorte. filtres de sang dans les glomérules dans les tubules pronephrique qui se exécutent caudale long de l&#39;axe, la fusion avant la sortie via le cloaque. Le pronephrique tubules sont fortement ciliés de cils motiles qui sont permissives pour l&#39;écoulement du filtrat vers la sortie caudale 3,4. Cette structure pronephrique simples maintient l&#39;homéostasie poisson zèbre par plusieurs semaines de croissance larvaire où ils finissent par se transformer en une structure plus complexe mésonéphros 21. Cependant, le poisson zèbre ne se développe jamais un métanéphros 21. Malgré les particularités de poisson zèbre, le néphron poisson zèbre est segmenté avec des profils d&#39;expression génique égal à celui observé chez les mammifères et offre ainsi un incomparable modèle in vivo pour néphrogenèse 3,22. Régulièrement patients sont testés pour la fonction rénale par une série de tests sanguins et urinaires. Typiquement, le sang est analysé pour les sels dissous, l&#39;urée et la créatinine. Des niveaux élevés de l&#39;urée, la créatinine et les concentrations de sel anormales sont révélateurs de problèmes avec la fonction rénale. L&#39;analyse d&#39;urine en utilisant une jauge colorimétrique détecte des niveaux anormaux de protéines, blood, du pus, de bactéries et de sucre présente dans les échantillons d&#39;urine. Ces essais nécessitent normalement environ 30 ml d&#39;urine ou de 5 à 10 ml de sang. Il a été difficile de traduire ces types d&#39;essais à petite dans des organismes modèles in vivo, tels que le poisson-zèbre, principalement en raison de la nature impossible de collecter le sang ou l&#39;urine suffisante pour réaliser le dosage. Ici, nous abordons l&#39;absence de tests de la fonction rénale poisson zèbre appropriées et décrivons une technique innovante pour son étude. En injectant un colorant fluorescent dans le sang nous sommes en mesure de suivre et de quantifier individuellement dans le temps de la filtration et de l&#39;excrétion de l&#39;activité de fluorescence à partir du sang par les reins. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des dommages aux reins causée par la maladie, ce qui nous fournissons un exemple de.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

L&#39;embryon de poisson zèbre offre un modèle souple pour étudier l&#39;organogenèse et modéliser les maladies génétiques humaines. Malgré sa simplicité relative, le rein et le poisson zèbre développe fonctions dans presque la même manière que les humains. Une différence importante dans la construction du rein humain est la présence de millions de néphrons par rapport au poisson-zèbre ne possède que deux. Cependant, la simplification d&#39;un système aussi complexe en unités fonctionnelles de base a aidé notre compréhension de la façon dont le rein développe et exploite. Chez le poisson zèbre, la ligne médiane située glomérule est responsable de la filtration du sang initial en deux tubules pronephrique qui divergent afin de fonctionner bilatéralement long de l&#39;axe embryonnaire avant de fusionner les uns aux autres au cloaque. Les tubules pronephrique sont fortement peuplées par des cils mobiles qui facilitent le mouvement de filtrat le long du tubule segmenté, permettant l&#39;échange de différents solutés avant de finalement sortir via le cloaque 2-4. De nombreux gènes responsables de la maladie rénale chronique, incLUDING ceux liés à ciliogenèse, ont été étudiés chez le poisson zèbre 5. Cependant, une attraction majeure de retour a été la difficulté d&#39;évaluer la fonction rénale poisson zèbre après manipulation génétique. Essais traditionnels pour mesurer le dysfonctionnement du rein chez l&#39;homme ont prouvé non translationnelle poisson zèbre, principalement en raison de leur environnement aquatique et de petite taille. Par exemple, il ne est pas physiquement possible d&#39;extraire le sang de l&#39;embryon organisé poissons pour l&#39;analyse de l&#39;urée et de la créatinine contenu, car ils sont trop petits. En outre, le poisson zèbre ne produisent pas suffisamment d&#39;urine pour tester sur une simple protéinurie &#39;jauge&#39;, qui est souvent effectuée lors des examens initiaux des patients. Nous décrivons un dosage par fluorescence qui utilise la transparence optique du poisson zèbre pour contrôler quantitativement le dégagement d&#39;un colorant fluorescent, au fil du temps, du système vasculaire et en sortie par le rein, pour donner une lecture de la fonction rénale 1,6-9.

Syndrome de Bardet-Biedl (BBS) est une ciliopathie hétérogène rare qui affecte environ 1: 160 000 personnes dans le monde 16. Les patients présentent un certain nombre de problèmes liés notamment reins polykystiques, suite patients ont souvent besoin de dialyse rénale ou une transplantation 24. ESRF est la cause la plus fréquente de décès chez BBS, avec environ 30% des patients CKD en développement 16. Actuellement, 20 gènes non liés ont été impliqués dans BBS sans associ...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d&#39;évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD.

Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K vues.  University College London.  Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d'évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD. 

Vidéo: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

En utilisant la réponse optocinétique pour étudier la fonction visuelle du poisson zèbre

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections intraveineuse de larves de poisson zèbre pour étudier lésions rénales aiguës

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...