Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) AI091759 et la maladie de Crohn et la colite Fondation de William de l&#39;Amérique et Shelby Modell famille Bourse de recherche Fondation (à MN). Schistosome-souris infectées ont été fournis par le Centre de ressources Schistosome NIAID (NIAID contrat N01 A130026).

1. Purifiant œufs de Schistosoma mansoni <ol><li> Infect suisse-Webster souris avec des cercaires de schistosomes, qui est le stade infectieux dans le cycle de vie Schistosoma 8. Sinon, procurez-schistosome-souris infectées par le NIAID ressources schistosomiase Centre ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Laissez la souris pour 6-7 semaines après l&#39;infection, par lequel point dans le temps, les oeufs sont présents dans le foie et peut être récupéré tel que décrit ci-dessous (voir fig. 1). </li><li> Euthanasier les souris avec le CO 2, et mouiller avec de l&#39;éthanol 70%. Placez la souris sur le dos. Utilisez le forceps émoussé et ciseaux pour couper la peau et le péritoine sous-jacent. D&#39;accise du foie, située en dessous de la cage thoracique et le diaphragme. </li><li> Émincer finement les foies et ajouter 20 ml par le foie de mélange de digestion, composée de la collagénase / dispase (0,5 mg / ml), la pénicilline (100 U / ml) et de la streptomycine (100 ug / ml) dans du PBS. Mettez mixture dans un tube Falcon de 50 ml et incuber pendant une nuit dans un shaker à 37 ° C. </li><li> Centrifuger le mélange à 400 xg / 3 min / 20 ° C. Verser délicatement l&#39;excès de liquide et le tube de remplissage avec du PBS. Centrifuger de nouveau et répéter de lavage PBS. Après centrifugation dernier, remettre en suspension le culot dans 25 mL du PBS. </li><li> Passer le culot remis en suspension à travers un standard de cuisine métallique crépine (utiliser un piston de la seringue de 50 ml pour écraser les morceaux de foie dans un récipient en verre), suivi par le passage du mélange à travers une passoire fine (utiliser une seringue de 10 ml pour pousser le mélange à travers la passoire fine dans un bécher seconde). </li><li> Mettez le mélange dans un tube tendues Falcon de 50 ml. Centrifuger à 400 xg / 5 min / 20 ° C. Verser délicatement sur surnageant sans perdre de granules. Resuspendre le culot dans 3 ml de PBS. </li><li> Overlay mélanger doucement sur ​​un Percoll 20%, 40 ml de gradient de 8 ml de Percoll et 32 ml de saccharose 0,25 M (FW = 342,3 donc 8,56 g sucrose/100 ml H 2 0). </li><li> Centrifuger 10 min / 800 xg / 20 ° C. Introduire à la pipette à pied und jetez gélatineuse couche supérieure des cellules du foie. Retirez l&#39;œuf culot en bas avec une pipette de transfert et de mettre dans un tube de 15 ml Falcon. </li><li> Laver à granulés 3X dans 10 ml de PBS / EDTA 1 mM / 1 mM EGTA paramètres de centrifugation à l&#39;aide: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Remettre en suspension dans 500 ul de PBS. </li><li> Mélange de superposition sur un nouveau Percoll 25%, 10 ml de gradient (2,5 ml de Percoll et 7,5 mL 0,25 M de saccharose) en utilisant les paramètres de centrifugation: 10 min / 800 xg / 20 ° C. </li><li> Laver 3X dans 10 ml de PBS en utilisant les paramètres de centrifugation: 3 min / 30 xg / 20 ° C. </li><li> Dans les derniers 10 ml de lavage, retirez 100 pi à compter les œufs. Oeufs de régler rapidement, de sorte que le tube Falcon doit être bien mélangé avant de retirer l&#39;échantillon. Diluer l&#39;échantillon de 100 ul avec 900 ul de PBS. 100 uL du mélange doit être compté sous forme de gouttelettes sur une lame de microscope en utilisant un microscope à dissection (dilution 1:10). Wide-bore des pointes de pipette doit être utilisée. </li><li> Remettre en suspension les oeufs à 50.000 œufs / ml dans PBS. Les œufs peuvent être stockés pendant plusieurs mois à -80 ° C et décongelés une fois ou TWICe pour une utilisation. Avant utilisation, vérifier sous un microscope pour s&#39;assurer que les œufs sont toujours intacts (voir Fig. 1). </li></ol> 2. Sensibilisation par voie intrapéritonéale avec S. Oeufs mansoni: Jour 0 <ol><li> Préparez les œufs à 5000 oeufs/100 ul de PBS dans un tube de 5 ml snapcap. Pour l&#39;injection, d&#39;estimer les œufs de 50% de plus que nécessaire. </li><li> Chargez une aiguille de calibre 23 et un 3/4inch seringue de 1 ml avec 100 uL de suspension d&#39;oeufs par souris. Oeufs de régler, l&#39;aiguille charge alors avec des œufs immédiatement avant utilisation. </li><li> Seringue rock d&#39;avant en arrière pour mélanger les oeufs avant chaque injection, et d&#39;injecter par voie intrapéritonéale 100 pi de suspension par la souris. </li></ol> 3. Rétro-orbitaire Défi intraveineuse avec S. Oeufs mansoni: Jour 14 <ol><li> Préparer les œufs comme ci-dessus à 5.000 oeufs/100 ul. </li><li> Anesthésier souris dans la chambre spécialisée à l&#39;isoflurane (4%), ou par voie intrapéritonéale avec la xylazine (10 mg / kg) et la kétamine (120 mg / kg). Profondeur de anesthesia est déterminé par le pincement de la patte et en veillant pas de réponse physique. </li><li> Après chargement de la seringue de 1 ml et 23 aiguille de la jauge 3/4inch avec des œufs, d&#39;utiliser des pinces pour plier l&#39;aiguille à un angle de 90 ° avec le biseau vers le bas dans l&#39;angle. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes. </li><li> Placer la souris sur un côté. Rentrer la peau de sorte œil saillie, et injecter 100 ml dans les vaisseaux derrière le globe oculaire à un angle de 45 ° sur le nez. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et appliquer une légère pression pour contrôler le saignement. </li></ol> Toutes ces procédures doivent être effectuées avec soin, et la souris doivent être surveillés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils récupèrent de l&#39;anesthésie. Ces protocoles ont été approuvés par l&#39;Université de Pennsylvanie soins des animaux et le Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC). 4. Récolte expérimentale: Jour 22 <ol><li> Euthanasier les souris avec du CO 2. </li><li> La souris par voie humide avec de l&#39;éthanol 70%, et le lieu sur le dos. </li><li> Utilisation de mousse forceps, saisir l&#39;abdomen de la souris et faire une petite incision dans la peau. Retirez soigneusement la peau avec des ciseaux et d&#39;exposer la cage thoracique et du péritoine. </li><li> Couper le péritoine. Coupez l&#39;aorte abdominale pour récupérer le sang avec une pipette Pasteur. Conservez-le sur la glace. </li><li> Déplacez le foie vers le bas pour exposer le diaphragme. Utilisez des ciseaux fins de couper le diaphragme. Découpez soigneusement ouvert la cage thoracique afin d&#39;exposer le tissu pulmonaire. </li><li> Récupérer les ganglions lymphatiques qui drainent parathymic du poumon avec des pinces fines. Ceux-ci sont caché sous la cage thoracique, de chaque côté du thymus 9. Magasin sur la glace dans 1mL milieux stériles (DMEM supplémenté avec 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 50 uM de 2-mercaptoéthanol, tous disponibles chez Invitrogen). </li><li> Pour récupérer la BAL, et gonfler les poumons pour l&#39;analyse histologique, l&#39;intubation trachéale doit être effectuée. Exposer la trachée en déplaçant les glandes salivaires sur le côté, et Placing pinces fines sous la trachée. L&#39;aide de ciseaux fins, découpez un trou dans le milieu de la trachée, et insérer le tube dans les poumons. Fixer la tuyauterie en attachant avec un fil chirurgical. </li><li> Fixez PBS-remplie seringue de 1 ml à la tubulure et gonfler les poumons avec 1 ml de PBS. Soigneusement récupérer lavage BAL avec une seringue. Conservez-le sur la glace. </li><li> Fixez paraformaldéhyde à 4% (PFA) dans du PBS-remplie seringue de 1 ml à la tubulure et gonfler les poumons. </li><li> Retirez le tube, et serrer le fil chirurgical pour éviter les fuites de la PFA. </li><li> Soigneusement disséquer les tissus pulmonaires et les placer dans un tube Falcon de 50 ml avec 5 ml de 4% PFA. </li></ol> 5. Préparation des tissus récupérés <ol><li> Sérum: Après le stockage sur de la glace pendant 30 min à 2 h pour le sang à coaguler, le sérum est récupéré à partir du sang par centrifugation (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Le sérum est conservé à -20 ° C et peut être utilisé pour les tests ELISA des cytokines ou S. mansoni œuf spécifique de l&#39;antigène isotype IgG ELISA <sup&gt; 6, 10. </li><li> Les nœuds lymphatiques: des suspensions cellulaires simples sont préparés et nombre de cellules utilisées pour évaluer l&#39;ampleur de la réponse immunitaire. Pour examiner la polarisation des cellules Th2, les cellules sont stimulées avec re-S. antigène oeuf mansoni pendant 72 heures. Coloration des cytokines Intracellar peuvent être examinés par cytométrie de flux, et les surnageants peut être récupéré et stocké à -20 ° C pour le test ELISA de cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: Les cellules sont granulés (400 ug / 5 min / 4 ° C). Le liquide de LBA est récupéré et stocké à -20 ° C pour l&#39;analyse des cytokines Th2 par ELISA. BAL chiffres cellules sont utilisées comme une lecture pour l&#39;inflammation des voies aériennes. Préparations de cytocentrifugeuse 10,000-100,000 cellules (500 tours par minute / 5 min / 4 ° C), suivie d&#39;une coloration Diffquik permettra énumération de infiltration inflammatoire 4, 6. Alternativement, les cellules BAL peut être examinée par 6 cytométrie en flux. </li><li> Le tissu pulmonaire: tissu pulmonaire sont stockagenuit ed à 4 ° C. Tissus fixe est inclus en paraffine, sectionnés et montées sur des lames pour l&#39;analyse histologique et immunofluorescence. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Ce protocole décrit toutes les étapes nécessaires pour (i) la purification de Schistosoma mansoni oeufs pour utilisation in vivo (Fig. 1), (ii) sensibiliser et de contester la souris avec ces œufs et (iii) récupérer les organes d&#39;examen de la réponse inflammatoire des poumons. Ce modèle in vivo entraîne une réponse reproductible du poumon puissant Th2 inflammatoire. Ceci est illustré par une inflammation des voies respiratoires et éosinophilie tels que révélés par les numérations cellulaires BAL et préparations cytocentrifugeuse (Fig. 2). H &amp; sections du poumon E-tachés peuvent être examinées pour les oeufs induite par des granulomes (Fig. 3a), et la coloration par immunofluorescence de sections du poumon permet de visualiser les macrophages activés alternativement et Th2 induite par les cytokines telles que les gènes Résisd&#39;étain-comme molécule (RELM) α (Fig. 3b). La réponse spécifique de l&#39;antigène CD4 cytokine Th2 est examiné par ELISA pour l&#39;IL-5, IL-4 et IL-13 de l&#39;antigène-stimulées parathymic cellules des ganglions lymphatiques (fig. 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Figure 1 Schistosoma mansoni modèle d&#39;injection pour oeufs images représentatives de foies granulomateuses, caractéristiques de haute S.mansoni-oeufs charges et d&#39;œufs S.mansoni sont présentés -.. Taille moyenne (L) 120 um par (W) 50 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Figure 2. S. mansoni œuf d&#39;injection entraîne une inflammation des voies respiratoires. A. Le nombre de cellules BAL (x10 5) de naïfs (N) ou S. mansoni (Sm) oeuf-souris injectées. * P &lt;0,05. La préparation des cellules B. cytocentrifugeuse BAL. Mac, MACROPHAGES; Eos, EOSINOPHILES; LYMPHATIQUE, lymphocytes. Bar, 10 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation des granulomes pulmonaires et les macrophages activés alternativement autour de l&#39;œuf S.mansoni. A. Granulome pulmonaire qui entoure l&#39;œuf Sm (flèche noire) a été visualisé dans les sections H &amp; E-pulmonaires colorées. B. Immunofluorescence coloration pour RELMα (vert), le récepteur du mannose (rouge) et DAPI (bleu) révèle encore des macrophages activés (flèche blanche) dans le granulome entourant le autofluorescente Sm oeuf (flèche noire). Bar, 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Figure 4. S.mansoni oeuf spécifique de l&#39;antigène réponse des cytokines Th2. Vidange parathymic cellules ganglionnaires de souris naïves (N) ou Sm-oeuf injecté ont été stimulées avec Sm &lt;/ Em antigène oeuf&gt; pendant 72 heures, suivie par la méthode ELISA de surnageants de l&#39;IL-4, IL-5 et IL-13. Échelle, ng / mL. * P &lt;0,05.

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	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis:+report+of+a+WHO+expert+committee.">Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee.</a> WHO Technical Report Series 912. , (2002).</li><li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunobiology+of+schistosomiasis.">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li><li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair.">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li><li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung.">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li><li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections:+a+model+of+local+immune+responses.">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li><li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-{alpha}+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung.">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li><li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues.">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li><li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni,+with+observations+on+three+schistosome/snail+host+combinations.">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li><li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat.">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li><li>Lewis, F., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Chapter 19, Unit 19 (2001).</li><li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response.">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+disease+and+the+T(H)1/T(H)2+paradigm.">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li><li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni.">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ici, un modèle utilisant de Schistosoma mansoni oeufs à induire une inflammation du poumon de type 2 est décrite. Les traits caractéristiques de ce modèle incluent le puissant réponse immunitaire de type Th2, inflammation des voies respiratoires et la formation de granulomes pulmonaires. Étant donné que ces paramètres dépendent des réponses des lymphocytes CD4 Th2 11, il s&#39;agit d&#39;un modèle utile pour étudier les effets des suppressions de protéines spécifiques ou de la lignée ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Taille / Description </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Collagénase / dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Emballer </td><td> Fisher Scientific Co. LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Liquide </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon de 50 ml </td><td> Emballer </td><td> Faucon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE tubes </td><td> 0,58 mm </td><td> Becton Dickinson and Co. </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> 250 ml </td><td> De la santé animale abbé </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge, la santé animale </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Anticorps anti-récepteur du mannose </td><td> La biotine </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metallic Crépine </td><td> Passoire de cuisine standard </td><td> Cible </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 Litre </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 0891 01 </td></tr><tr><td> Anticorps RELMα </td><td> 50 pg </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Fil chirurgical </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Spécialités chirurgicales Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Aiguille de la seringue </td><td> 23g, 3/4 pouce </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> Normes pour les essais aux Etats-Unis Sieve </td><td> 150 um, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc </td><td> ASTME-11, Spec. N ° 100 </td></tr><tr><td> La xylazine </td><td> 20 mg / ml </td><td> Majordome </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

using eggs from schistosoma mansoni as an in vivo model of helminth-induced lung inflammation

Schistosomes sont schistosomes qui infectent environ 200 millions de personnes dans le monde 1. Dans l&#39;infection chronique à Schistosoma, l&#39;une pathologie grave, y compris la fibrose du foie et de la splénomégalie, est causée par la réponse immunitaire à des œufs de parasites plutôt que le parasite lui-même 2. Œufs de parasites induisent une réponse Th2 caractérisée par la production d&#39;IL-4, IL-5 et IL-13, l&#39;activation alternative des macrophages et le recrutement des éosinophiles. Ici, nous décrivons l&#39;injection d&#39;œufs de Schistosoma mansoni en tant que modèle pour examiner les réponses spécifiques du parasite cytokines Th2 dans les poumons et les ganglions lymphatiques drainant, la formation de granulomes pulmonaires entourant l&#39;oeuf et l&#39;inflammation des voies respiratoires. Après une sensibilisation par voie intrapéritonéale et intraveineuse défi, S. oeufs mansoni sont transportés à travers le poumon des artères pulmonaires où ils sont piégés dans le parenchyme du poumonpar les granulomes composés de lymphocytes, les éosinophiles et les macrophages activés alternativement 3-6. Associé à la formation de granulomes, de l&#39;inflammation dans les espaces broncho-alvéolaires, l&#39;expansion des ganglions lymphatiques drainant et l&#39;activation des cellules CD4 T peut être observée. Ici, nous détaillons le protocole pour isoler Schistosoma mansoni oeufs à partir de foies infectés (modifié à partir de 7), la sensibilisation et difficile souris, et la récupération des organes (lavage broncho-alvéolaire (LBA), du poumon et les ganglions lymphatiques drainant) pour l&#39;analyse. Nous incluons également histologique des données représentatives et immunologiques et des suggestions pour l&#39;analyse immunologique supplémentaire. Dans l&#39;ensemble, cette méthode fournit un modèle in vivo pour étudier les réponses immunologiques induites par les helminthes dans le poumon, qui est largement applicable à l&#39;étude des maladies inflammatoires, y compris Th2 infestation par les helminthes, les maladies fibrotiques, l&#39;inflammation allergique et l&#39;asthme. Avantages de ce modèle pour l&#39;étude de type 2 l&#39;inflammation dans les poumons comprennent la reproductibilité d&#39;une puissante réponse inflammatoire Th2 dans les poumons et les ganglions lymphatiques drainant, la facilité de l&#39;évaluation de l&#39;inflammation par l&#39;examen histologique des granulomes entourant l&#39;œuf, et le potentiel de stockage à long terme du parasite oeufs.

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Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni oeufs sont des stimulateurs efficaces du type T auxiliaire 2 (Th2) la réponse immunitaire, caractéristique d&#39;une infection parasitaire, l&#39;asthme et l&#39;inflammation allergique. Ce protocole utilise S. mansoni œuf d&#39;injection afin de générer un taux de CD4 Th2 induite par les cytokines réponse inflammatoire dans les poumons, caractérisée par la formation de granulomes pulmonaires autour de l&#39;oeuf, l&#39;éosinophilie et l&#39;activation des macrophages alternative.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

13.7K vues.  University of Pennsylvania. Schistosoma mansoni oeufs sont des stimulateurs efficaces du type T auxiliaire 2 (Th2) la réponse immunitaire, caractéristique d'une infection parasitaire, l'asthme et l'inflammation allergique. Ce protocole utilise S. mansoni œuf d'injection afin de générer un taux de CD4 Th2 induite par les cytokines réponse inflammatoire dans les poumons, caractérisée par la formation de granulomes pulmonaires autour de l'oeuf, l'éosin...

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Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

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Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In vivo méthode d&#39;imagerie à distinguer inflammation aiguë et chronique

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Sondes de projection optique de nouvelles bactéries spécifiques sur les tissus pulmonaires humains Ex Vivo par endomicroscopie confocale par Laser

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...