Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH HL093196 (RCR) et de la recherche Atlanta et de l&#39;éducation de la Fondation (AREF).

La sensibilisation aux allergènes et I. Défi (voir Figure 1) A. Pour Défi intratrachéale <ol><li> Pour la sensibilisation initiale, injecter mâle ou femelle C57BL / 6 ou BALB / c (6-8 semaines) par voie intrapéritonéale au jour 0 et à nouveau au jour 7 avec 20 pg d&#39;ovalbumine (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) émulsionné dans 0,2 ml de phosphate stérile (PBS) contenant 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium (Sigma-Aldrich) ou avec 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile comme témoin. </li><li> Défi avec un antigène, le cas échéant (par exemple, aux jours 14, 16, 18 et 20). Procédure de récusation suit. </li><li> Anesthésier souris avec une voie intrapéritonéale (ip) d&#39;injection d&#39;un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Assurez-vous de la souris est entièrement anesthésié pendant au moins 10 min. </li><li> Surface de fonctionnement Angle à 45 degrés ou plus. Placez la souris sur cette surface garder la face ventrale vers le haut et la tête en haut. </li><li> Crochet tHLit sous incisives de tenir la tête en arrière. Niveau les pattes avec l&#39;autre pour assurer la trachée est droite et à utiliser la bande d&#39;étiquettes à maintenir les pieds. Faire tremper site chirurgical avec 70% et EtOH écouvillon. </li><li> Appliquer bupivacaïne (0,1 à 0,2 ml de solution à 0,25%) par voie topique à l&#39;endroit de l&#39;incision. </li><li> Nip peau sur la gorge avec une pince et tirez doucement vers l&#39;extérieur. Faire une petite incision verticale avec des ciseaux chirurgicaux. Réduire la taille de l&#39;incision. </li><li> Préparer une seringue de 1 ml avec 50 ul de PBS ou OVA 0,1% dans du PBS et l&#39;insérer dans une pipette répétitive (Tridak Stepper, Torrington, CT). Prendre la pipette dans une main et utiliser l&#39;autre pour tenir le tissu de retour avec la pince à épiler et d&#39;exposer la trachée. </li><li> En tenant la seringue comme parallèle à la trachée que possible, d&#39;insérer l&#39;aiguille à travers la trachée mur et injecter la solution. </li><li> Maintenir la souris dans une suite à l&#39;injection orientation verticale pour laisser le temps pour une solution à s&#39;installer dans les poumons. </li><li> Surface de la plaie doucement et stérilement étroite avecpince à épiler et joint avec suture. </li><li> Placez la souris sur le sternum vers le bas sur un coussin chauffant et lui permettre de récupérer jusqu&#39;à totalement ambulatoire. Après la récupération, le retour de la souris à l&#39;établissement de soins des animaux et de la surveiller quotidiennement les signes de sérome, inflammation ou une infection, et déhiscence de la plaie jusqu&#39;à ce que la plaie est complètement guérie. </li></ol> B. Pour Défi par nébulisation <ol><li> Sensibiliser les souris au jour 0 par injection intrapéritonéale de 20 mg d&#39;OVA (Sigma-Aldrich) émulsionné dans 0,2 ml de PBS stérile contenant 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium (Sigma-Aldrich) ou avec 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile que le contrôle . </li><li> Au jour 14, de stimuler une sensibilisation par injection ip tel que décrit ci-dessus. </li><li> Sur le 21 e jour, 22 ème, 23 ème, 24 ème et 25 ème après la sensibilisation initiale, les souris défi par une exposition de 30 min à l&#39;OVA 1% nébulisée ou PBS seul livré via un nébuliseur ultrasonique (Buxco Systems Research, Wilmington, Caroline du Nord). </li><li> Souris lieu dans la salle principale de la WBP; les acclimater dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 10 min. </li><li> Placer 1 ml de OVA 0,1% dans du PBS stérile ou stérile PBS seul, tel que décrit dans les étapes 4-6 ci-dessous, via un nébuliseur. Nébuliser pendant 30 min. </li><li> Retirer du nébuliseur et jeter toute solution restante. </li><li> Nébulisation peut être effectuée sur tous les souris simultanément en utilisant une chambre de nébulisation. </li></ol> II. Détermination de l&#39;hyperréactivité bronchique à la méthacholine A. Mesure non invasive de l&#39;hyperréactivité des voies aériennes par pléthysmographie corps entier-(WBP; Buxco recherche sur les systèmes, Wilmington, NC) <ol><li> Laisser la bouteille méthacholine poudre se réchauffer à température ambiante avant ouverture (méthacholine est très hygroscopique et former des amas inutiles si on les laisse à absorber l&#39;eau). Préparer une dose de 200 mg / ml de solution mère dans du PBS stérile, puis assurez-série 2-dilutions (par exemple, 100, 50, 25, 12,5 et 60,25 mg / ml). Conserver les solutions froid. </li><li> Mettre en place l&#39;équipement comme suit: raccorder l &#39;entrée principale de la WBP d&#39;un nébuliseur, le biais des flux d&#39;entrée à l&#39;air de la pompe, et la sortie WBP à piéger le gaz en utilisant un tube de caoutchouc étanche. Attacher transducteur de pression pour réduire les sorties des chambres principales et renvoi de la WBP. Connectez transducteur de pression pour préamplificateur avec les câbles fournis, et se connecter au PC en utilisant préamplificateur spécifique d&#39;acquisition de données de la carte. </li><li> Calibrer le préamplificateur en utilisant le logiciel selon les recommandations du fabricant. </li><li> Souris lieu dans la salle principale de la WBP; les acclimater dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 10 min, puis des lectures de base de disques (Penhbase) pendant 3 min. </li><li> Placer 1 ml de PBS stérile dans le nébuliseur. Nébuliser pendant 2 min, puis surveiller les variables respiratoires pour un supplément de 6 min au cours de la phase de séchage. Retirer du nébuliseur et jeter tout reste PBS. </li><li> Placer 1 ml de 6,25 mg / ml méthacholine dans le nébuliseur et rnébulisation EPEAT pendant 2 min, plus un cycle de suivi de 6 minutes. </li><li> Répétez la mesure avec 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml méthacholine, en utilisant la période de nébulisation même 2-min et cycle de suivi de 6 minutes. </li><li> Retirer les souris à partir des chambres et de les renvoyer dans leurs cages. </li><li> Recharge nébuliseur tasse avec 1 ml de PBS stérile et exécuter une autre séquence pour rincer la tubulure. </li><li> Arrêtez les flux d&#39;air, démonter, et essuyer toutes les chambres avant de lancer une deuxième série d&#39;animaux. </li></ol> B. Mesure invasive de la réactivité des voies respiratoires par commandée par ordinateur Ventilateur (flexiVent; SCIREQ Inc, Montréal, Canada) <ol><li> Peser la souris et anesthésier par voie intrapéritonéale (ip) d&#39;injection de 60 mg de sodium par kg de poids corporel pentobarbital. </li><li> Après anesthésie, position adéquate les souris ventro-dorsale pour trachéotomie. </li><li> Désinfectez la peau du cou avec de l&#39;éthanol 70%. Appliquer bupivacaïne (0,1 à 0,2 ml de solution à 0,25%) par voie topique à l&#39;ile site ncision. Incisez et ouvrir la peau du cou. Séparez les muscles du cou et d&#39;exposer la trachée. </li><li> Faire un 1 - à 2 mm de l&#39;incision dans la trachée avec des ciseaux fins (être certain de ne pas couper la trachée) et insérez la sonde trachéale avec prudence. Attachez un fil de suture autour de la trachée pour empêcher une fuite d&#39;air. </li><li> Poser la souris dans la chambre de pléthysmographe et connecter le tube inséré la trachée et la ventilation. </li><li> Démarrer une ventilation mécanique. Réglez la fréquence respiratoire approprié et le volume courant / course (150 coups / min et 200 pi, respectivement pour une souris de 20 g). Assurez-vous que le thorax se déplace en synchronie avec le ventilateur. Si la souris est la «lutte» avec le ventilateur (auto-respiration), injecter plus d&#39;anesthésie et d&#39;attendre la synchronisation. </li><li> Après les mesures de base, de maintenir la souris sous ventilation de base pour un autre 3 min, puis prendre un 2 e série de mesures d&#39;impédance. Cette 2 ème série de mesures de base est utilisé pour calcmuler les valeurs de référence moyennes. </li><li> Livrer CPE ou à la méthacholine (MCH) (défis 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml) par la canalisation de débit inspiratoire du ventilateur grâce à un nébuliseur ultrasonique. </li><li> Après chaque défi avec MCh (6,25, 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml), le retour du piston à fournir un Vt de 10 ml / kg à 120 respirations par minute et de prendre des mesures d&#39;impédance. </li></ol> III. Mesure de l&#39;infiltration cellulaire dans l&#39;espace aérien A. Effectuer lavage broncho-alvéolaire (LBA) <ol><li> Après la mesure de la procréation assistée, l&#39;euthanasie des souris avec du CO 2, et de positionner chaque souris sur le dos sur le pavé chirurgicale. </li><li> Faire tremper la zone avec de l&#39;EtOH 70%. </li><li> Commençant à l&#39;abdomen inférieur, ouvrir la cavité abdominale et enlever la peau / supérieure du muscle, se déplaçant vers le haut vers les côtes. </li><li> Une fois les côtes sont visibles, utiliser des ciseaux pour bien percer la membrane. Poumons devrait se rétracter, le diaphragme. Soyez particulièrement careful à ne pas entailler les poumons ou le cœur. </li><li> Coupez la cage thoracique pour bien exposer les poumons et le cœur (éviter de couper les principaux vaisseaux sanguins pour empêcher le sang de remplir le site). </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 27 (BD seringues, Franklin Lakes, NJ), la ponction des ventricules cardiaques et lentement et soigneusement retirer la seringue pour prélever le sang. Prenez soin d&#39;éviter l&#39;effondrement du cœur. </li><li> Recueillir le sérum de ce sang en utilisant le protocole standard. Conserver à -70 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Coupez la peau et les tissus de la gorge jusqu&#39;à ce que la trachée est révélé. Dégagez suffisamment de tissu pour travailler facilement dans le domaine (encore une fois, éviter de couper les principaux vaisseaux sanguins). </li><li> L&#39;aide de ciseaux courbes, coupées en vertu de la trachée se frayer un chemin. </li><li> Passez le point d&#39;une pince courbes sous la trachée et de saisir la fin d&#39;un morceau de fil de suture. Tirer le fil de suture dans la trachée. </li><li> Faire un demi-nœud lâche à propos de la trachée, faible dans la gorge. </li><li> CAREFully une entaille, de taille suffisante pour la canule, au-dessus du fil de suture. </li><li> Soin insérer la canule dans le trou et dans la trachée-delà du point du fil de suture. Appuyez doucement sur l&#39;avant jusqu&#39;à ce que la canule émerge juste à l&#39;entrée dans les poumons (trop loin: poumons de crevaison; trop court: la trachée effondrement lors de la tentative de récupérer BAL). </li><li> Serrer fil de suture et faire un nœud complet pour sceller la trachée autour canule. </li><li> Seringue Lock (contenant 1 ml de PBS) sur la canule, et appuyez doucement sur le fluide dans les poumons. Lobes du poumon devrait individuellement gonfler lentement. Ne pas trop remplir. Pour une souris pleine de 0,9 à 1,0 ml cultivé est le maximum absolu. 0,8 ml peut être plus sûr. Verrouiller la seringue à canule lâche, sinon il est susceptible de causer des dommages lors d&#39;une tentative de se désengager. </li><li> Retirer du fluide à partir de poumons. Si on rencontre une résistance (tissu aspiré dans la canule), appuyez sur la canule lentement plus loin dans les poumons et reprendre les enlever. Aussi essayez de tourner la canule en place. Si tous les else échoue, retirer la canule à mi-chemin; la trachée est beaucoup plus susceptible de s&#39;effondrer dans ce cas. </li><li> Détacher la seringue de la canule, le dépôt liquide de LBA dans le récipient, et répéter 2 fois avec une solution de PBS frais. </li><li> Conserver la solution sur de la glace jusqu&#39;à ce que BAL filé vers le bas. </li><li> Utilisez le liquide de LBA et le sérum pour mesurer l&#39;OVA IgE spécifique à l&#39;aide disponible dans le commerce IgE de souris kits ELISA (bioproduits MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. Compter les cellules et détermination des taux différentiels <ol><li> Centrifuger le liquide BAL 5 min à ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire doucement dans du PBS et de garder sur la glace. </li><li> Chargez un hématimètre norme Neubauer avec la suspension cellulaire diluée et de compter les cellules. </li><li> Retirer aliquotes de 2 × 10 4 cellules 10 à 40 du volume ul pour cytospins. Diluer les cellules si nécessaire. </li><li> Pour cytospins, mélanger 2 × 10 4 cellules, 130 pi de PBS et 10 ul FBS. Ajouter le mélange de cellule entière à double cytospin entonnoir et centrifuger 10 min à 700 rpm, en utilisant cytoslides doubles pour les échantillons en double. </li><li> Laisser les lames sécher à température ambiante pendant 1 h avant la coloration. </li><li> Colorer les lames en utilisant Diff-Quick tache (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Les résultats représentatifs Constriction des voies respiratoires à la suite des stimuli provocateurs excessive est une caractéristique importante de la clinique de l&#39;asthme. Nous décrivons deux méthodes de mesure de l&#39;hyperréactivité bronchique à la méthacholine telle chez les souris sensibilisées et OVA contestée: l&#39;ensemble du corps pléthysmographie (Figure 2) et l&#39;oscillation forcée à l&#39;aide du système flexiVent (Figure 3). Les deux méthodes montrent que la sensibilisation et le défi OVA produit une hyperréactivité bronchique chez la souris. Inflammation des voies respiratoires éosinophiles riche en est une autre caractéristique importante de l&#39;asthme et la maladie clinique allergique des voies respiratoires chez les souris. Comme le montre la figure 4 </strong&gt;, la sensibilisation et l&#39;OVA défi augmente considérablement le nombre total de cellules qui peuvent être récupérés à partir des voies respiratoires par BAL. Les numéros d&#39;éosinophiles et, dans une moindre mesure, les neutrophiles sont particulièrement augmenté. Les données indiquent que les résultats allergiques maladies des voies respiratoires de la surproduction d&#39;anticorps IgE aux antigènes sensibilisants. Sensibilisation et un défi à l&#39;OVA en utilisant les protocoles que nous décrivons augmente les taux d&#39;IgE dans le sérum et le fluide BAL des souris traitées (figure 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma d&#39;expérimentation pour l&#39;OVA induit l&#39;asthme allergique. Souris ont été sensibilisées à deux reprises ip avec 20 pg d&#39;OVA émulsionnée dans 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile, ou 2 mg d&#39;hydroxyde d&#39;aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile seul, suivi à la points de temps indiqué par le contester avec 0,1% OVA ou une solution stérile de PBS ou par ex quotidienne<html> posure pendant 30 minutes à l&#39;OVA 1% nébulisée dans du PBS ou du PBS seul livré via un nébuliseur ultrasonique (Buxco). Vingt-quatre heures après l&#39;exposition OVA final, la réactivité bronchique a été déterminée. Par la suite, le liquide de LBA, des échantillons de sang, les cellules pulmonaires, et les tissus ont été prélevés pour une analyse plus approfondie. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figure 2. Souris d&#39;évaluation des induite par l&#39;allergène hyperréactivité bronchique par une méthode non invasive. (N = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l&#39;OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, l&#39;hyperréactivité bronchique à la métacholine inhalée a été déterminée en utilisant la pléthysmographie corps entier tel que décrit dans le protocole. Penh a été déterminée et exprimée en rapport Penh (moyenne Penh sur l&#39;intervalle de temps de 8 minutes avec de la méthacholine, divisé par le Penh moyenne sur l&#39;intervalle de 8 minutes avec du PBS). * P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Souris d&#39;évaluation des induite par l&#39;allergène hyperréactivité bronchique par une méthode invasive (oscillations forcées). (N = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l&#39;OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, l&#39;hyperréactivité bronchique à des concentrations croissantes de métacholine inhalée a été déterminée par l&#39;oscillation forcée (flexiVent) méthode telle que décrite dans le protocole. Une résistance, B) des voies respiratoires; élastance pulmonaire C). * P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figure 4. BAL nombre de cellules de fluide. Souris (n = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l&#39;OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, (Haut) Cellules BAL ont été recueillis et nombre total de cellules ont été comptées comme décrit dans le protocole. (Bas) diapositives Cytospin étaient préparé et colorées avec Diff-Quick. TOT = nombre total de cellules; Eos = Une éosinophiles; Neu = Une neutrophiles; Mac = macrophages; Lym = Lymphocytes. * P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figure 5. OVA-IgE spécifiques. Souris (n = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l&#39;OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, IgE a été mesurée dans le liquide BAL et dans le sérum du sang recueilli par ponction cardiaque tel que décrit dans le protocole. * P &lt;0,05 vs PBS.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bronchoconstriction+using+whole-body+plethysmograph:+comparison+of+freely+moving+versus+restrained+guinea+pigs.">Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39, 163-168 (1998).</li></ol>

Des expériences sur des animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité Atlanta VAMC IACUC sous protocole # V010-10.

Les modèles animaux de la maladie allergique des voies respiratoires fournissent des outils importants pour les études pertinentes à l&#39;asthme clinique. Un certain nombre de modèles différents, qui emploient diverses espèces et les antigènes, ont été développés. La souris, une espèce de laboratoire attrayants et fréquemment utilisée, offre également un certain nombre d&#39;avantages pour les modèles de la maladie allergique des voies respiratoires. 9,10 Bien que ces modèles ne reproduisent...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde d&#39;aluminium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acétyl-β-méthylcholine chlorure de </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sel de sodium pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pléthysmographie corps entier (WBP) système de </td><td> Buxco recherche sur les systèmes Wilmington, NC </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc Montréal, Canada </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscope optique </td><td> Leica Microsystems, Inc Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, Caroline du Nord </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick tache </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipette à répétition </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

L&#39;asthme est une cause majeure de morbidité et de mortalité, affectant quelque 300 millions de personnes à travers le monde. 1 Plus de 8% de la population américaine souffre d&#39;asthme, de la prévalence croissante. 2 Comme avec d&#39;autres maladies, les modèles animaux de la maladie allergique des voies respiratoires facilitent grandement compréhension de la pathophysiologie sous-jacente, aider à identifier des cibles thérapeutiques potentielles, et de permettre des essais précliniques de possibles nouvelles thérapies. Modèles de la maladie allergique des voies respiratoires ont été développés dans plusieurs espèces animales, mais les modèles murins sont particulièrement attractive en raison du faible coût, disponibilité, et bien caractérisés système immunitaire de ces animaux. 3 Disponibilité d&#39;une variété de souches transgéniques augmente encore l&#39;attrait de ces modèles. 4 Ici, nous décrivons deux modèles murins de la maladie allergique des voies respiratoires, à la fois l&#39;ovalbumine employant comme antigène. Après une sensibilisation initiale par injection intrapéritonéale, un modèle LivrERS le défi de l&#39;antigène par nébulisation, l&#39;autre par la livraison intra-trachéale. Ces deux modèles offrent des avantages complémentaires, les uns avec les imitant les principales caractéristiques de l&#39;asthme humain. 5 Les principales caractéristiques de l&#39;asthme aigu comprennent une réponse exagérée des voies aériennes à des stimuli tels que la méthacholine (hyperréactivité bronchique; AHR) et inflammation des voies respiratoires éosinophiles riches. Ce sont également des effets importants de provocation allergénique dans nos modèles murins, 5,6 et nous décrire les techniques permettant de mesurer les et donc d&#39;évaluer les effets de la manipulation expérimentale. Plus précisément, nous décrivons les deux 8 invasives 7 et non-invasif des techniques de mesure de l&#39;hyperréactivité bronchique ainsi que des méthodes pour évaluer l&#39;infiltration de cellules inflammatoires dans les voies respiratoires et du poumon. Cellules inflammatoires des voies aériennes sont recueillies par lavage broncho-alvéolaire du poumon tandis que l&#39;histopathologie est utilisée pour évaluer les marqueurs de l&#39;inflammation dans l&#39;organe. Cestechniques fournissent des outils puissants pour étudier l&#39;asthme d&#39;une façon qui ne serait pas possible chez les humains.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Des modèles de souris expérimentales de l&#39;asthme allergique offrent de nouvelles possibilités pour l&#39;étude de la pathogenèse des maladies et le développement de nouvelles thérapies. Ces modèles sont bien adaptés à des facteurs de mesure relatives à la réponse immunitaire allergique, inflammation des voies respiratoires, et de la physiopathologie pulmonaire.

Modèle murin de l&#39;asthme induit par les allergènes

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

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39.8K vues.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Des modèles de souris expérimentales de l'asthme allergique offrent de nouvelles possibilités pour l'étude de la pathogenèse des maladies et le développement de nouvelles thérapies. Ces modèles sont bien adaptés à des facteurs de mesure relatives à la réponse immunitaire allergique, inflammation des voies respiratoires, et de la physiopathologie pulmonaire.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recherche

Immunologie et infection

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Cytométrie en flux Analyse de la particule liée Bet v 1 Allergène en PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

Un modèle murine de la dengue virus induite par l'encéphalite virale aigue comme la maladie

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modèle robuste induit par la ligature de la parodontite de Murine pour l'évaluation des neutrophiles oraux

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Analyse systématique de notation pour l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite par le sulfate de sodium murine dextran

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...