Ce projet a été financé par des fonds Case Western Reserve University de démarrage fournis à E. Jolly. Escargots infectés ont été fournies par le Centre de ressources Schistosome, NIH-NIAID (NIAID Marché n HHSN272201000009I). Nous remercions également Chris King et Ronald Blanton pour le soutien à la sécurisation des escargots infectés de schistosomes et pour des discussions utiles.

Mesures de sécurité: Cercaires de schistosomes peuvent directement pénétrer la peau sans les besoins d&#39;une coupure ou pores et provoquer la schistosomiase maladies chroniques. S. mansoni est un niveau de biosécurité 2 organisme, donc un équipement de protection individuelle et des mesures de sécurité appropriées doivent être suivies lorsque l&#39;on travaille avec des cercaires infectantes. La plupart des équipements nécessaires à la croissance et à transformer les schistosomes est standard, à quelques exceptions près clés indiqués dans le tableau à la fin du protocole. Tous les travaux des cercaires devrait être fait dans une pièce isolée. Schistosomules doivent être cultivées dans un récipient stérile, la biosécurité approuvé le capot. Deux couches de nitrile ou des gants en latex doivent être portés, tout comme une blouse, une paire de chaussures imperméables, pantalons avec des trous ou de déchirures, et les protecteurs manches étanches pour vos poignets et des bras. En cas de déversement accidentel, pulvériser immédiatement zone contaminée avec de l&#39;éthanol à 70% ou eau de Javel à 10%, frottant vigoureusement si sur votre personne.Ce sera suffisant pour désactiver le parasite, mais toutes les infections possibles doivent être signalés et pris au sérieux. Bien que schistosomules ne sont pas naturellement infectieux, directives institutionnelles varient et doivent être consultées pour déterminer si BSL2 précautions sont nécessaires lors des étapes de la vie non infectieuses. Désinfectez toutes les surfaces qui entrent en contact avec une substance potentiellement infectieux après l&#39;expérience est effectuée et jeter les déchets dans un contenant approuvé biohazard. REMARQUE: bacs de couverture escargot hôte 1 à 2 jours avant la mue et protègent de la lumière 1. La récolte des cercaires de l&#39;escargot hôte <ol><li> Remplir un gobelet propre et libre de 500mL détergents à mi-chemin plein avec de l&#39;eau distillée équilibrés à température ambiante. Si vous travaillez avec des escargots hôtes infectées par miracidiums à des dates différentes, utiliser un bécher séparé pour chaque date d&#39;infection (Ceci est particulièrement important si les escargots seront réutilisées pour future expériences). La taille du gobelet peut aussi être inférieur en fonction de l&#39;expérience de l&#39;utilisateur. </li><li> Recueillir des mollusques hôtes infectés que vous souhaitez jeter et de les déposer avec précaution dans le bécher à l&#39;aide d&#39;un poisson d&#39;aquarium standard net et une pince à usage général selon les besoins. </li><li> Bécher place sur un bac de nettoyage d&#39;urgence environ 8 à 12 pouces au-dessous d&#39;une source incandescente. Laisser reposer pendant 1-2 heures, sous la lumière. Cercaires quitter le mollusque hôte lorsqu&#39;il est exposé à la lumière. </li><li> Soigneusement filtrer les escargots à partir du mélange des cercaires. Prenez des précautions supplémentaires, sous forme de mélange est très contagieux. Rappelez-vous, les cercaires peuvent directement pénétrer la peau humaine! </li><li> Remplacer mélange sous source de lumière pendant environ 15 minutes, ce qui permet une matière particulaire de déchet à régler. </li><li> Transfert cercaires dans un erlenmeyer propre à l&#39;aide d&#39;une pipette, en évitant les débris au fond du bécher. Placer le ballon à environ un angle de 45 ° sur la glace dans l&#39;obscurité pendant45 - 60 minutes, ce qui permet cercaires de s&#39;installer dans un coin. </li><li> Utiliser une pipette 50 ml pour éliminer 75 à 90% du surnageant et le déposer dans le bécher contenant l&#39;eau de Javel à 10% ou 70% d&#39;éthanol, en prenant soin de ne pas laisser les gouttes d&#39;eau contenant des cercaires goutte à goutte de la pipette. </li><li> Agiter le flacon d&#39;Erlenmeyer contenant des cercaires doucement pour remettre en suspension les cercaires en solution. Utiliser une pipette pour transférer l&#39;échantillon à stériles tubes de 50 ml coniques. Placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 20 minutes dans l&#39;obscurité. Cercaires se déposent vers le bas du tube dans l&#39;obscurité. </li></ol> 2. Transformation manuelle des cercaires à schistosomules Avant de commencer: Assurez-RPMI 1640 complet (RPMI, 5% de sérum fœtal bovin, 1X Pen / Strep) et chaude à 37 ° C. (Il est crucial que le sérum fœtal bovin utilisé a été inactivée par incubation de 56 ° C pendant 1 heure comme schistosomes peuvent être sensibles à compléter). <ol><li> Dans une hotte biohazard, retirezsurnageant jusqu&#39;à 5 à 10 ml de solution dans chaque conique 50 ml à l&#39;aide d&#39;un dispositif de pipetage ou de vide. </li><li> Joindre un calibre 22 à double extrémité, Luer lok émulsifiant aiguille d&#39;une seringue de taille appropriée. </li><li> Aspirer lentement le mélange dans la seringue. Recueillir des cercaires de tous les tubes de 50 ml dans une seringue. Soyez attentif de gouttes. </li><li> Tournez avec précaution la seringue au cours de telle sorte que l&#39;extrémité de l&#39;aiguille seule est en place. Fixer une autre seringue de ce côté-ci de l&#39;aiguille d&#39;émulsification. </li><li> Passer le mélange à travers l&#39;aiguille un total de 40 fois (20 fois aller et retour) pour transformer les cercaires. </li><li> Positionner verticalement les seringues de telle sorte que le mélange est contenu dans la seringue en bas et en haut de la seringue est vide. Retirer la seringue et désinfecter haut dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Goutte à goutte dépôt mélange dans un récipient propre de hauteur x 50mm paroi 100mm plat en pyrex ou cristallisoir. Désinfectez l&#39;aiguille et la seringue dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Ajouter 37 ° C milieu RPMI 1640 complet de sorte que la<html> inférieure de la boîte de Petri est entièrement recouverte, comme une plaque de coulée bouillon Luria. </li><li> Agiter doucement pour recueillir schistosomules dans le centre de la boîte de Pétri. Éviter les éclaboussures. Remarque: Il peut être utile de désactiver la lumière de hotte pour cette étape de façon à mieux visualiser les schistosomules dans le centre. </li><li> Déposer immédiatement schistosomules concentrés dans un nouveau de 12 puits de plaque de culture cellulaire et en utilisant un compte-gouttes stérile. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que 2.9 et 2.10 schistosomules ne sont plus présents dans le centre du plat (environ 10 fois). Déposer chaque collecte ultérieure dans un endroit bien frais. </li><li> Remplir chaque puits jusqu&#39;à mi-course (~ 1,5 ml) avec milieu RPMI complet préchauffé. </li><li> Visualisez sur un microscope inversé pour vérifier la présence de schistosomules et l&#39;absence de cercaires. </li><li> Cultivez les schistosomules dans un incubateur à CO 2 réglée à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: ove_content &quot;&gt; Dans l&#39;attente de transfert des schistosomules transformés en milieux de culture, la visualisation en vertu d&#39;un champ lumineux inversé microscope (voir tableau équipement pour un exemple) devrait donner une image similaire à la figure 1, dans laquelle seuls schistosomules transformées sont présents dans le puits. contaminants potentiels pourrait inclure des cercaires intacte, coupées queues cercariens, ou d&#39;autres débris. Si aucun microscope inversé est disponible, un microscope standard ou même un champ de dissection sera suffisante pour visualiser les schistosomules. Notez que cette procédure ne permet pas toujours de transformer 100% de cercaires. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: schistosomule Transformé <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2: Severed cercaires et Tails

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Plusieurs problèmes potentiels pourraient survenir pendant la procédure de transformation, mais ce protocole est conçu pour éviter la plupart de ces problèmes. Un danger potentiel est le colmatage de l&#39;aiguille émulsifiant, qui survient généralement à cause de débris laissés par l&#39;exploitation à l&#39;étape 1.3. Veillez à conserver toutes les particules de s&#39;installer dans l&#39;étape 1.5 et de transférer les cercaires soigneusement à l&#39;étape de 1,6 à éviter ce problème. En outre, comme décrit précédemment, travaillant à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique, l&#39;utilisation d&#39;équipements de protection individuelle (masques protecteurs même) et d&#39;éviter une pression excessive sur les seringues est conseillé. Détaché queues cercariens peuvent être visualisés dans les médias, ce qui est révélateur d&#39;une mauvaise séparation lors de l&#39;étape 2.9. Les queues de présenter une motion de spasme comparable et ont une forme distincte (voir la figure 2), et thusly sont facilement distinguables des schistosomules. Les queues peuvent être enlevées par lavage des schistosomules en excès de RPMIcompléter les schistosomules permettant de régler. Les queues restera flottant qui peut être aspirées. Si cercaires intacts sont présents dans les médias, la transformation à l&#39;étape 2.5 a été pas exécuté correctement. Une image d&#39;une cercaire intacte est représenté dans la figure 3b pour référence. Si ce problème se produit, s&#39;assurer que l&#39;aiguille émulsifiant utilisé est de la bonne taille. En outre, le nombre de fois que le mélange des cercaires est passé par l&#39;aiguille peut être augmenté, mais 40 fois est généralement beaucoup plus que suffisant pour approcher cisaillement 100% des queues cercariens. Transformation des cercaires en schistosomules a été décrite pour la première en 1974 par Colley et Wikel (13). Depuis lors, la préparation des schistosomules a été fait en utilisant soit la stratégie de cisaillement avec une aiguille et d&#39;une seringue comme décrit dans le présent protocole, ou en utilisant une approche vortex et séparés par des gradients de Percoll (14, 15) ou tourbillonnant comme l&#39;a démontré dans le présent document. Ces deux techniques de préparation de schistosomules sont magnifiquement décrite par Fred Lewis (16) et pour plus d&#39;informations poursuite de la culture du schistosomules de croissance à long terme peut être trouvée au Centre de ressources Schistosome NIAID ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;émulsifiant aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 825-17G </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) inactivé par la chaleur </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Cristallisoir (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Pinces à usage général </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium net pour les crevettes de saumure </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

Schistosomes sont les agents responsables de la schistosomiase, une maladie chronique débilitante qui touche plus de 200 millions de personnes au niveau mondial et se classe deuxième au paludisme dans les maladies parasitaires en termes de santé publique et socio-économiques (1-4). Schistosomes sont des vers trématodes, avec un cycle de vie complexe échangeant entre une vie parasitaire dans mollusques hôtes et de mammifères avec des intervalles de libre-natation étapes. En bref, la nage libre cercaires infecter un hôte mammifère en pénétrant la peau à l&#39;aide de protéases sécrétées, au cours de laquelle les cercaires perdent leur queue, se transformant en schistosomules. Les schistosomules doit désormais échapper au système immunitaire de l&#39;hôte, de développer un intestin pour la digestion des globules rouges, et de migrer si les poumons et la circulation portail en route vers leur destination finale dans le système porte hépatique et éventuellement les veines mésentériques (pour S. mansoni) où mâle et femelle et s&#39;accoupler deux vers, producing centaines d&#39;œufs par jour. Certains des œufs sont excrétés par le corps dans l&#39;eau douce, où les œufs éclosent en nage libre miracidiums (5-10). Le miracidium infecter les espèces d&#39;escargots spécifiques et se transforment en sporocystes mère et la fille, qui, à son tour, produisent des cercaires infectantes, complétant ainsi le cycle de vie. Malheureusement, le cycle de vie des schistosomes ne peuvent pas être cultivées in vitro, mais cercaires infestantes peut être transformé en schistosomules et les schistosomules peuvent être cultivées pendant des semaines pour l&#39;analyse du développement schistosome in vitro ou l&#39;analyse des microréseaux. Dans ce protocole, nous fournissons une description visuelle de la transformation des cercaires et culture in vitro de schistosomules. Nous nous débarrassons de cercaires infectieuses de l&#39;escargot Biomphalaria glabrata hôte et manuellement les transformer en schistosomules en détachant leurs queues en utilisant un émulsifiant double aiguille. In vitro, la transformation des cercaires et des techniques de culture d schistosomulesescribed éviter l&#39;utilisation d&#39;un hôte mammifère, ce qui simplifie la visualisation des schistosomes et faciliter la collecte du parasite pour l&#39;analyse expérimentale. transformation in vitro et des techniques de culture de schistosomes ont été faites depuis des années (11, 12), mais pas de protocoles visuels ont été développés qui sont à la disposition de toute la communauté.

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Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Nous décrivons une<em&gt; In vitro</em&gt; Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d&#39;eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d&#39;accueil.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

18.0K vues.  Case Western Reserve University. Nous décrivons une In vitro Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes Schistosoma mansoni, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d'eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d'accueil.

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Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Recherche

Immunologie et infection

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Masse d’Isolation et de la culture In Vitro des étapes apporte de la douve de sang humain Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Biologie du développement

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Génétique

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Nucléofection et propagation in vivo des parasites de poulet Eimeria

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Biologie

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

Transformation des cercaires et

Résumé

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En utilisant des oeufs de