Ce projet a été financé par des fonds Case Western Reserve University de démarrage fournis à E. Jolly. Escargots infectés ont été fournies par le Centre de ressources Schistosome, NIH-NIAID (NIAID Marché n HHSN272201000009I). Nous remercions également Chris King et Ronald Blanton pour le soutien à la sécurisation des escargots infectés de schistosomes et pour des discussions utiles.

Mesures de sécurité: Cercaires de schistosomes peuvent directement pénétrer la peau sans les besoins d&#39;une coupure ou pores et provoquer la schistosomiase maladies chroniques. S. mansoni est un niveau de biosécurité 2 organisme, donc un équipement de protection individuelle et des mesures de sécurité appropriées doivent être suivies lorsque l&#39;on travaille avec des cercaires infectantes. La plupart des équipements nécessaires à la croissance et à transformer les schistosomes est standard, à quelques exceptions près clés indiqués dans le tableau à la fin du protocole. Tous les travaux des cercaires devrait être fait dans une pièce isolée. Schistosomules doivent être cultivées dans un récipient stérile, la biosécurité approuvé le capot. Deux couches de nitrile ou des gants en latex doivent être portés, tout comme une blouse, une paire de chaussures imperméables, pantalons avec des trous ou de déchirures, et les protecteurs manches étanches pour vos poignets et des bras. En cas de déversement accidentel, pulvériser immédiatement zone contaminée avec de l&#39;éthanol à 70% ou eau de Javel à 10%, frottant vigoureusement si sur votre personne.Ce sera suffisant pour désactiver le parasite, mais toutes les infections possibles doivent être signalés et pris au sérieux. Bien que schistosomules ne sont pas naturellement infectieux, directives institutionnelles varient et doivent être consultées pour déterminer si BSL2 précautions sont nécessaires lors des étapes de la vie non infectieuses. Désinfectez toutes les surfaces qui entrent en contact avec une substance potentiellement infectieux après l&#39;expérience est effectuée et jeter les déchets dans un contenant approuvé biohazard. REMARQUE: bacs de couverture escargot hôte 1 à 2 jours avant la mue et protègent de la lumière 1. La récolte des cercaires de l&#39;escargot hôte <ol><li> Remplir un gobelet propre et libre de 500mL détergents à mi-chemin plein avec de l&#39;eau distillée équilibrés à température ambiante. Si vous travaillez avec des escargots hôtes infectées par miracidiums à des dates différentes, utiliser un bécher séparé pour chaque date d&#39;infection (Ceci est particulièrement important si les escargots seront réutilisées pour future expériences). La taille du gobelet peut aussi être inférieur en fonction de l&#39;expérience de l&#39;utilisateur. </li><li> Recueillir des mollusques hôtes infectés que vous souhaitez jeter et de les déposer avec précaution dans le bécher à l&#39;aide d&#39;un poisson d&#39;aquarium standard net et une pince à usage général selon les besoins. </li><li> Bécher place sur un bac de nettoyage d&#39;urgence environ 8 à 12 pouces au-dessous d&#39;une source incandescente. Laisser reposer pendant 1-2 heures, sous la lumière. Cercaires quitter le mollusque hôte lorsqu&#39;il est exposé à la lumière. </li><li> Soigneusement filtrer les escargots à partir du mélange des cercaires. Prenez des précautions supplémentaires, sous forme de mélange est très contagieux. Rappelez-vous, les cercaires peuvent directement pénétrer la peau humaine! </li><li> Remplacer mélange sous source de lumière pendant environ 15 minutes, ce qui permet une matière particulaire de déchet à régler. </li><li> Transfert cercaires dans un erlenmeyer propre à l&#39;aide d&#39;une pipette, en évitant les débris au fond du bécher. Placer le ballon à environ un angle de 45 ° sur la glace dans l&#39;obscurité pendant45 - 60 minutes, ce qui permet cercaires de s&#39;installer dans un coin. </li><li> Utiliser une pipette 50 ml pour éliminer 75 à 90% du surnageant et le déposer dans le bécher contenant l&#39;eau de Javel à 10% ou 70% d&#39;éthanol, en prenant soin de ne pas laisser les gouttes d&#39;eau contenant des cercaires goutte à goutte de la pipette. </li><li> Agiter le flacon d&#39;Erlenmeyer contenant des cercaires doucement pour remettre en suspension les cercaires en solution. Utiliser une pipette pour transférer l&#39;échantillon à stériles tubes de 50 ml coniques. Placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 20 minutes dans l&#39;obscurité. Cercaires se déposent vers le bas du tube dans l&#39;obscurité. </li></ol> 2. Transformation manuelle des cercaires à schistosomules Avant de commencer: Assurez-RPMI 1640 complet (RPMI, 5% de sérum fœtal bovin, 1X Pen / Strep) et chaude à 37 ° C. (Il est crucial que le sérum fœtal bovin utilisé a été inactivée par incubation de 56 ° C pendant 1 heure comme schistosomes peuvent être sensibles à compléter). <ol><li> Dans une hotte biohazard, retirezsurnageant jusqu&#39;à 5 à 10 ml de solution dans chaque conique 50 ml à l&#39;aide d&#39;un dispositif de pipetage ou de vide. </li><li> Joindre un calibre 22 à double extrémité, Luer lok émulsifiant aiguille d&#39;une seringue de taille appropriée. </li><li> Aspirer lentement le mélange dans la seringue. Recueillir des cercaires de tous les tubes de 50 ml dans une seringue. Soyez attentif de gouttes. </li><li> Tournez avec précaution la seringue au cours de telle sorte que l&#39;extrémité de l&#39;aiguille seule est en place. Fixer une autre seringue de ce côté-ci de l&#39;aiguille d&#39;émulsification. </li><li> Passer le mélange à travers l&#39;aiguille un total de 40 fois (20 fois aller et retour) pour transformer les cercaires. </li><li> Positionner verticalement les seringues de telle sorte que le mélange est contenu dans la seringue en bas et en haut de la seringue est vide. Retirer la seringue et désinfecter haut dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Goutte à goutte dépôt mélange dans un récipient propre de hauteur x 50mm paroi 100mm plat en pyrex ou cristallisoir. Désinfectez l&#39;aiguille et la seringue dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Ajouter 37 ° C milieu RPMI 1640 complet de sorte que la<html> inférieure de la boîte de Petri est entièrement recouverte, comme une plaque de coulée bouillon Luria. </li><li> Agiter doucement pour recueillir schistosomules dans le centre de la boîte de Pétri. Éviter les éclaboussures. Remarque: Il peut être utile de désactiver la lumière de hotte pour cette étape de façon à mieux visualiser les schistosomules dans le centre. </li><li> Déposer immédiatement schistosomules concentrés dans un nouveau de 12 puits de plaque de culture cellulaire et en utilisant un compte-gouttes stérile. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que 2.9 et 2.10 schistosomules ne sont plus présents dans le centre du plat (environ 10 fois). Déposer chaque collecte ultérieure dans un endroit bien frais. </li><li> Remplir chaque puits jusqu&#39;à mi-course (~ 1,5 ml) avec milieu RPMI complet préchauffé. </li><li> Visualisez sur un microscope inversé pour vérifier la présence de schistosomules et l&#39;absence de cercaires. </li><li> Cultivez les schistosomules dans un incubateur à CO 2 réglée à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: ove_content &quot;&gt; Dans l&#39;attente de transfert des schistosomules transformés en milieux de culture, la visualisation en vertu d&#39;un champ lumineux inversé microscope (voir tableau équipement pour un exemple) devrait donner une image similaire à la figure 1, dans laquelle seuls schistosomules transformées sont présents dans le puits. contaminants potentiels pourrait inclure des cercaires intacte, coupées queues cercariens, ou d&#39;autres débris. Si aucun microscope inversé est disponible, un microscope standard ou même un champ de dissection sera suffisante pour visualiser les schistosomules. Notez que cette procédure ne permet pas toujours de transformer 100% de cercaires. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: schistosomule Transformé <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2: Severed cercaires et Tails

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Plusieurs problèmes potentiels pourraient survenir pendant la procédure de transformation, mais ce protocole est conçu pour éviter la plupart de ces problèmes. Un danger potentiel est le colmatage de l&#39;aiguille émulsifiant, qui survient généralement à cause de débris laissés par l&#39;exploitation à l&#39;étape 1.3. Veillez à conserver toutes les particules de s&#39;installer dans l&#39;étape 1.5 et de transférer les cercaires soigneusement à l&#39;étape de 1,6 à éviter ce problème. En outre, comme décrit précédemment, travaillant à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique, l&#39;utilisation d&#39;équipements de protection individuelle (masques protecteurs même) et d&#39;éviter une pression excessive sur les seringues est conseillé. Détaché queues cercariens peuvent être visualisés dans les médias, ce qui est révélateur d&#39;une mauvaise séparation lors de l&#39;étape 2.9. Les queues de présenter une motion de spasme comparable et ont une forme distincte (voir la figure 2), et thusly sont facilement distinguables des schistosomules. Les queues peuvent être enlevées par lavage des schistosomules en excès de RPMIcompléter les schistosomules permettant de régler. Les queues restera flottant qui peut être aspirées. Si cercaires intacts sont présents dans les médias, la transformation à l&#39;étape 2.5 a été pas exécuté correctement. Une image d&#39;une cercaire intacte est représenté dans la figure 3b pour référence. Si ce problème se produit, s&#39;assurer que l&#39;aiguille émulsifiant utilisé est de la bonne taille. En outre, le nombre de fois que le mélange des cercaires est passé par l&#39;aiguille peut être augmenté, mais 40 fois est généralement beaucoup plus que suffisant pour approcher cisaillement 100% des queues cercariens. Transformation des cercaires en schistosomules a été décrite pour la première en 1974 par Colley et Wikel (13). Depuis lors, la préparation des schistosomules a été fait en utilisant soit la stratégie de cisaillement avec une aiguille et d&#39;une seringue comme décrit dans le présent protocole, ou en utilisant une approche vortex et séparés par des gradients de Percoll (14, 15) ou tourbillonnant comme l&#39;a démontré dans le présent document. Ces deux techniques de préparation de schistosomules sont magnifiquement décrite par Fred Lewis (16) et pour plus d&#39;informations poursuite de la culture du schistosomules de croissance à long terme peut être trouvée au Centre de ressources Schistosome NIAID ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;émulsifiant aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 825-17G </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) inactivé par la chaleur </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Cristallisoir (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Pinces à usage général </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium net pour les crevettes de saumure </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

Schistosomes sont les agents responsables de la schistosomiase, une maladie chronique débilitante qui touche plus de 200 millions de personnes au niveau mondial et se classe deuxième au paludisme dans les maladies parasitaires en termes de santé publique et socio-économiques (1-4). Schistosomes sont des vers trématodes, avec un cycle de vie complexe échangeant entre une vie parasitaire dans mollusques hôtes et de mammifères avec des intervalles de libre-natation étapes. En bref, la nage libre cercaires infecter un hôte mammifère en pénétrant la peau à l&#39;aide de protéases sécrétées, au cours de laquelle les cercaires perdent leur queue, se transformant en schistosomules. Les schistosomules doit désormais échapper au système immunitaire de l&#39;hôte, de développer un intestin pour la digestion des globules rouges, et de migrer si les poumons et la circulation portail en route vers leur destination finale dans le système porte hépatique et éventuellement les veines mésentériques (pour S. mansoni) où mâle et femelle et s&#39;accoupler deux vers, producing centaines d&#39;œufs par jour. Certains des œufs sont excrétés par le corps dans l&#39;eau douce, où les œufs éclosent en nage libre miracidiums (5-10). Le miracidium infecter les espèces d&#39;escargots spécifiques et se transforment en sporocystes mère et la fille, qui, à son tour, produisent des cercaires infectantes, complétant ainsi le cycle de vie. Malheureusement, le cycle de vie des schistosomes ne peuvent pas être cultivées in vitro, mais cercaires infestantes peut être transformé en schistosomules et les schistosomules peuvent être cultivées pendant des semaines pour l&#39;analyse du développement schistosome in vitro ou l&#39;analyse des microréseaux. Dans ce protocole, nous fournissons une description visuelle de la transformation des cercaires et culture in vitro de schistosomules. Nous nous débarrassons de cercaires infectieuses de l&#39;escargot Biomphalaria glabrata hôte et manuellement les transformer en schistosomules en détachant leurs queues en utilisant un émulsifiant double aiguille. In vitro, la transformation des cercaires et des techniques de culture d schistosomulesescribed éviter l&#39;utilisation d&#39;un hôte mammifère, ce qui simplifie la visualisation des schistosomes et faciliter la collecte du parasite pour l&#39;analyse expérimentale. transformation in vitro et des techniques de culture de schistosomes ont été faites depuis des années (11, 12), mais pas de protocoles visuels ont été développés qui sont à la disposition de toute la communauté.

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Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Nous décrivons une<em&gt; In vitro</em&gt; Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d&#39;eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d&#39;accueil.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

17.9K vues.  Case Western Reserve University. Nous décrivons une In vitro Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes Schistosoma mansoni, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d'eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d'accueil.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

La culture de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l&#39; analyse biosimilarité

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, investigations of interactions between endobiotics (e.g., drugs and prebiotics) and gut microbiota have become an important research topic. However, in vivo experiments with human volunteers are not ideal for such studies due to bioethics and economic constraints. As a result, animal models have been used to evaluate these interactions in vivo. Nevertheless, animal model studies are still limited by bioethics considerations, in addition to differing compositions and diversities of microbiota in animals vs. humans. An alternative research strategy is the use of batch fermentation experiments that allow evaluation of the interactions between endobiotics and gut microbiota in vitro. To evaluate this strategy, bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) were used as a representative xenobiotic. Then, the interactions between Bif EPS and human gut microbiota were investigated using several methods such as thin-layer chromatography (TLC), bacterial community compositional analysis with 16S rRNA gene high-throughput sequencing, and gas chromatography of short-chain fatty acids (SCFAs). Presented here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems. Importantly, this protocol can also be modified to investigate general interactions between other endobiotics and gut microbiota.

Described here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems.

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...