Les auteurs tiennent à remercier les communautés de la province du Yunnan, République populaire de Chine et d&#39;Agboville, Côte d&#39;Ivoire, pour leur participation dans les études décrites ci-dessus. Nous sommes redevables aux équipes locales de terrain qui ont aidé à l&#39;essai et l&#39;exécution des protocoles. Nous sommes particulièrement reconnaissants aux collègues suivants du Swiss Tropical et de Santé Publique Institut: Yvette Endriss pour fournir des images microscopiques, Hanspeter Marti et son équipe pour le soutien de laboratoire et Stefanie Krauth pour son aide lors du tournage vidéo. Enfin, nous remercions les deux relecteurs anonymes pour une série d&#39;observations utiles.

1. Kato-Katz Technique <ol><li> Placez une norme de Kato-Katz modèle avec un trou pour la tenue de 41,7 milligrammes (mg) de selles sur une lame de microscope. </li><li> Scoop 2-3 grammes (g) d&#39;un nouvel échantillon fécal sur un morceau de papier journal ou du papier d&#39;aluminium, puis appuyez sur un morceau de fil ou de treillis de plastique sur le dessus pour la tamiser. </li><li> En utilisant une petite spatule en plastique, grattez la matière tamisée au large de la maille et remplir complètement le trou dans le modèle de Kato-Katz avec elle. À éliminer l&#39;excès de matières fécales, le niveau de la teneur du trou avec la spatule. </li><li> Verticalement supprimer le modèle sans déranger les matières fécales maintenant adhérer à la lame de microscope. Le modèle et la spatule peut être nettoyé à l&#39;eau avec un détergent, et réutilisés. </li><li> Placez un morceau de cellophane, préalablement trempé dans une solution de vert malachite glycérine pendant au moins 24 heures (h), au-dessus de l&#39;échantillon fécal sur la lame de microscope. </li><li> Pour répartir les matières fécales dans une goutte épaisse, appuyez doucement sur un chiffon propre microdiapositive portée contre la lame échantillon, distribution uniforme de la matière à l&#39;intérieur d&#39;un cercle d&#39;un diamètre légèrement plus petit que la largeur de la lame de microscope. </li><li> Laissez la lame pour dégager pendant 30-60 minutes (mn), au cours de laquelle les lames doivent être tenus à l&#39;écart de la lumière directe. Ensuite, examiner systématiquement la goutte épaisse sous un microscope optique (40-100x de grossissement). Comptez le nombre d&#39;œufs STH et les stratifier par espèce (c.-à-A.lumbricoides, T.trichiura et l&#39;ankylostome). Fait à noter, les œufs d&#39;helminthes d&#39;autres (par exemple Schistosoma mansoni) peuvent également être détectés par cette méthode et doivent être comptés et enregistrés séparément. </li><li> Pour obtenir une estimation normalisée de l&#39;intensité de l&#39;infection, conventionnellement exprimé en nombre d&#39;œufs par gramme de selles (EPG), il faut multiplier le nombre d&#39;œufs par 24 (24 x 41,7 mg ≈ 1 g). </li></ol> 2. Technique Baermann <ol><li> Mettre en place un stand qui peut tenir un verre d&#39;entonnoir et fixer un tube de caoutchouc, fermé d&#39;espritClip ha, au fond de l&#39;entonnoir. </li><li> Placez un tamis ou un morceau de grillage en forme de cône, dans l&#39;entonnoir et il couche avec un morceau de gaze médicale. </li><li> Remplir l&#39;entonnoir avec de l&#39;eau du robinet et s&#39;assurer que l&#39;ensemble set-up ne fuit pas. </li><li> Écoper 20-30 g de selles fraîches sur le milieu de la gaze médicale et de s&#39;assurer qu&#39;il est complètement immergé dans l&#39;eau. Ajouter plus d&#39;eau si nécessaire. Plier la gaze médicale sur l&#39;échantillon. </li><li> D&#39;en bas, brille la lumière artificielle à l&#39;entonnoir pendant 2 heures. </li><li> Drainer 50 millilitres (ml) de la partie inférieure de l&#39;eau dans l&#39;entonnoir dans un tube de centrifugation en douceur libérer la fixation sur le tube en caoutchouc. </li><li> Centrifuger l&#39;eau collectée à 600 xg (force centrifuge relative) pendant 5 min et versez délicatement le surnageant sans déranger le sédiment. Conserver les dernières gouttes dans le tube. </li><li> Remettre en suspension les sédiments et 2 gouttes de pipette de la solution sur une lame de microscope et examiner le coulisseausous un microscope optique (grossissement 40x pour la détection et 100-400x de grossissement pour confirmation de l&#39;espèce). Larves de premier stade (L1) de S. stercoralis sont vivants et se déplacer activement au microscope. </li></ol> 3. 20-m Exécuter le test navette <ol><li> Mesurer un 20-m terrain plat et rectiligne et le marquer avec des cônes. </li><li> Aidez le participant essai porter un moniteur de fréquence cardiaque sur le poignet et l&#39;émetteur correspondant autour de la poitrine 18. Cet équipement permet la fréquence cardiaque du participant doit être mesurée avant et après le test et donc surveille si le participant a exercé l&#39;effort maximal. </li><li> Demandez aux participants de lancer d&#39;avant en arrière sur le parcours en suivant le rythme des signaux sonores pré-enregistrés délimitant 20 m tours. À partir d&#39;une vitesse de déplacement de 8,5 km à l&#39;heure (km / h), la fréquence des signaux d&#39;indication 20-m augmente les intervalles par un équivalent de 0,5 km / h toutes les minutes. </li><li> Assurez-eau participant commence un nouveau 20-m intervalle chaque fois qu&#39;un signal est émis et il se termine avant l&#39;arrivée du prochain signal d&#39;. </li><li> Arrêter le participant si il / elle ne parvient pas à suivre le rythme pour deux périodes consécutives de 20 m d&#39;intervalle. </li><li> Enregistré la plus forte vitesse de fonctionnement indiqué dans le dernier intervalle où le participant a rempli entièrement, avec l&#39;âge et le sexe du participant. </li><li> Vérifiez que la fréquence cardiaque atteint à la fin de l&#39;essai est le taux de l&#39;enfant cardiaque maximale 19. Si cette fréquence cardiaque n&#39;est pas atteint, l&#39;enfant pourrait ne pas avoir exercé un effort maximal, et donc le test doit être répété. </li><li> Estimer la capacité maximale aérobie (VO 2 max) du participant, en utilisant une équation mis de l&#39;avant par la firme Léger et ses collègues: VO 2 max = 31.025 + 3.238 * Vitesse (en km / h) - 3,248 * âge (années) + 0,1536 * La vitesse (en km / h) * âge (en années). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Sur le plan deDiagnostic STH avec la technique de Kato-Katz, caractéristiques uniques des œufs d&#39;helminthes différentes permettre l&#39;identification de la plupart des espèces 20. Les oeufs de A.lumbricoides (environ 45-75 micromètres (um) de long et de 35-50 um de large, figure 1) ont des parois plus épaisses que les coquilles des œufs de T.trichiura (figure 2) et l&#39;ankylostome (figure 3). Un ovule fécondé de A.lumbricoides (Figure 1) a une couche externe albumineuse, qui lui donne une apparence dorée, tandis qu&#39;un œuf non fécondé n&#39;a pas cette couche extérieure et est légèrement allongé et plus globale. Les oeufs de T.trichiura (environ 50 m de long et de 22 um de large, figure 2) sont allongés et ont des besoins spécifiques bouchons polaires. L&#39;ankylostome oeufs (environ 64-76 m de long et de 36 à 40 um de large, figure 3), d&#39;autre part, ont une paroi très mince, suivie d&#39;un anneau clair autour d&#39;un amas dense de cellulesdans le centre de l&#39;oeuf. S.stercoralis larves L 1 (figure 4) sont d&#39;environ 180-380 um de long et ont une cavité buccale très court. Une ébauche distincte des organes génitaux (mis en évidence par une flèche bleue dans la figure 4) peut être observée et la queue des larves (mis en évidence par une flèche rouge dans la figure 4) a une extrémité pointue. Comme l&#39;impact réel des géohelminthiases sur la condition physique des enfants est encore en discussion 13,14,15, il n&#39;ya pas de résultat représentatif de leur impact à ce stade. Interprétation des résultats navette de 20 m de test d&#39;exécution peut être effectuée de diverses manières. La condition physique des enfants peuvent être comparées entre les sujets infectés et non infectés, qui sont similaires en termes d&#39;âge et le sexe, d&#39;autres conditions de santé potentiellement concernés, le statut socioéconomique et les habitudes culturelles. Cela peut être fait dans une enquête transversale 13,14,15 où l&#39;Statut d&#39;infection STH et la condition physique des enfants infectés et non infectés sont évalués à un moment particulier. La force de la preuve sera plus élevé lorsque l&#39;on suit un design essai contrôlé randomisé où la condition physique des enfants d&#39;âge scolaire est évaluée avant et après anthelminthique / traitement placebo, permettant à la fois l&#39;évaluation à court et à long terme. On peut encore tenter d&#39;identifier une éventuelle relation dose-réponse entre l&#39;intensité de géohelminthiases et la forme physique et de comparer les différents niveaux de multiparasitisme 1 avec la condition physique. Dans le travail présenté par Yap et ses collègues 15, forme physique, telle que représentée par le VO 2 max, a été trouvé à être considérablement réduite chez les enfants infectés par le T.trichiura par rapport aux enfants qui n&#39;étaient pas infectées par T.trichiura (figure 5) . <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig1.jpg" /> Figu<html> re 1. Images microscopiques d&#39;œufs fécondés A.lumbricoides: (A) et non fécondé (B) sous un grossissement de 500x. Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig2.jpg" /> Figure 2. Image microscopique d&#39;un œuf sous un grossissement de 500x T.trichiura. Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig3.jpg" /> Figure 3. Image microscopique d&#39;un œuf sous un grossissement de 500x ankylostomes. Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig4.jpg" /> Figure 4. Image microscopique d&#39;une S.stercoralis L 1 sous un grossissement de 250x larve. Les flèches indiquent la queue (rouge) et des organes génitaux primordium (bleu). Barre d&#39;échelle = 100 um. d/3966/3966fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Graphique montrant le niveau de condition physique des enfants infectés par le T.trichiura rapport au niveau de la condition physique des enfants non infectés par T. trichiura.

<ol>
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R., Rollinson, D., Marti, H., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+soil-transmitted+helminths+in+the+era+of+preventive+chemotherapy:+effect+of+multiple+stool+sampling+and+use+of+different+diagnostic+techniques.">Diagnosis of soil-transmitted helminths in the era of preventive chemotherapy: effect of multiple stool sampling and use of different diagnostic techniques.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 2, e331 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les trois protocoles décrits dans le présent document ont été testés et exécutés dans la partie sud-ouest de la province du Yunnan, République populaire de Chine parmi les membres de la minorité ethnique Bulang 21 et dans différentes régions d&#39;Afrique 6,13,14. Il ya plusieurs modèles disponibles pour la technique de Kato-Katz. Chaque distincte trou de taille va délivrer une quantité nette de matières fécales. Pour le calcul des EPG, il est donc néce...

Remarque: Les matières figurant dans cette liste sont génériques et peuvent être obtenus à partir de différentes sources. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Kato-Katz kit [400 modèles en plastique avec un trou de 6 millimètres (mm) (diamètre) dans un modèle de 1,5 mm d&#39;épaisseur; 400 spatule en plastique, un rôle 20-m de l&#39;écran de nylon 80; un maillage de rôle 20-m de cellophane hydrophile, 34 um d&#39;épaisseur.] </td><td> Vestergaard Frandsen </td><td></td><td> S&#39;il vous plaît noter que la solution de glycérine vert-malachite n&#39;est pas inclus dans ce kit, mais peut être acheté à n&#39;importe quel fournisseur de produits chimiques. </td></tr><tr><td> Entonnoir en verre [environ 8 centimètres (cm) de large et 6 cm de profondeur] </td><td></td><td></td><td> L&#39;entonnoir en verre pour la technique de Baermann devrait être capable de tenir environ 60 ml d&#39;eau. The taille du tuyau en caoutchouc et de la gaze est dépendante du type d&#39;ampoule de verre utilisé. </td></tr><tr><td> Microscope biologique </td><td> Olympe </td><td> CX21LED/CX21 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Shanghai Medical Instruments Group </td><td> 80 - 2T </td><td></td></tr><tr><td> Pré-enregistrés des signaux </td><td> Conception Bitworks </td><td> Équipe Bleep Test Version 1.3.1 </td><td> application iPhone </td></tr><tr><td> Moniteur de fréquence cardiaque </td><td> POLAR </td><td> FT1 </td><td> Regarder et le transmetteur </td></tr></tbody></table>

determining soil-transmitted helminth infection status and physical fitness of school-aged children

Helminthes transmis par le sol (STH) les infections sont courantes. En effet, plus de 1 milliard de personnes sont touchées, surtout dans le monde en développement, où la pauvreté règne et le comportement d&#39;hygiène, l&#39;approvisionnement en eau et l&#39;assainissement sont souvent déficients 1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, et les deux espèces d&#39;ankylostome, Ancylostoma duodenale et Necator americanus, sont les plus répandues STHS 3. Le fardeau mondial estimé en raison de l&#39;ankylostome la maladie, l&#39;ascaridiose et la trichocéphalose est de 22,1, 10,5, et 6,4 millions d&#39;années de vie ajustées sur l&#39;incapacité (DALY), respectivement 4. En outre, un 30-100000000 de personnes sont infectées par Strongyloides stercoralis, les espèces les plus négligés STH d&#39;importance mondiale qui provoque sans doute aussi un impact considérable pour la santé publique 5,6. Espèces multiples infections (c.-à-STHS différents abrités dans un seul individu) sont monnaie courante, et les infections ont été lin<html> ked à une baisse de productivité et les perspectives économiques ainsi des pays en développement 1,3. Pour le diagnostic du STHS communs, l&#39;Organisation mondiale de la Santé (OMS) recommande la technique de Kato-Katz 7,8, qui est une méthode relativement simple pour déterminer la prévalence et l&#39;intensité de ces infections. Il facilite la détection des œufs de parasites que les sujets infectés passent dans leurs selles. En ce qui concerne le diagnostic de S.stercoralis, il n&#39;existe actuellement aucun outil simple et précise. La technique de Baermann est la méthode la plus largement utilisée pour le diagnostic. Le principe de la technique de Baermann est que les larves actives S.stercoralis migrer hors d&#39;un échantillon éclairé fécale fraîche que les larves sont phototactiques 9. Il nécessite du matériel de laboratoire moins sophistiqués et moins de temps que les méthodes de culture et immunologiques 5. t &quot;&gt; morbidités associées aux infections STH gamme de symptômes aigus, mais commun, tels que douleurs abdominales, diarrhée, prurit, des symptômes chroniques, telles que l&#39;anémie, la malnutrition et la sous-et la déficience cognitive 10. Puisque les symptômes sont généralement non spécifiques et subtile, ils passent souvent inaperçues, sont considérées comme une condition normale par les personnes concernées, ou sont traités comme des symptômes d&#39;autres maladies qui pourraient être plus commune dans un contexte donné. Par conséquent, il est concevable que la véritable charge de géohelminthiases est sous-estimée par l&#39;évaluation s&#39;appuyant sur des outils d&#39;auto-déclarés signes et les symptômes, comme c&#39;est habituellement le cas dans les enquêtes de population. Dans les années 1980 et début des années 1990, Stephenson et ses collègues ont mis en évidence la possibilité de géohelminthiases abaissement de la condition physique des garçons âgés de 6-12 ans 11,12. Cette ligne de recherche scientifique a récemment pris un nouvel élan 13,14,15. Le 20 mètres (m) de test de course navette a été mis au point und validé par Léger et al. 16 et est utilisé dans le monde entier pour mesurer la capacité aérobique des enfants 17. Le test est facile à standardiser et peut être exécuté partout où un 20-m long cours et de roulage à plat et une source audio sont disponibles, ce qui rend son utilisation intéressante dans les ressources sont limitées 13. Afin de faciliter et de normaliser les tentatives d&#39;évaluer si les géohelminthiases avoir un effet sur l&#39;aptitude physique des enfants d&#39;âge scolaire, nous présentons des méthodes qui diagnostiquent les géohelminthiases ou d&#39;adaptation des mesures physiques qui sont simples à exécuter et encore, fournir des résultats précis et reproductibles. Cela permettra de générer de nouvelles preuves concernant l&#39;impact sur la santé des géohelminthiases.

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Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

L&#39;infection chronique par des helminthes transmis par le sol (STHS) provoque une malabsorption, retard de croissance et émaciation chez l&#39;enfant qui grandit. Par conséquent, il est plausible que ces infections réduisent également la condition physique des enfants. Ici, nous visualisons deux techniques pour le diagnostic du STHS et le test de 20 mètres de navette course pour évaluer l&#39;aptitude physique des enfants.

Déterminer transmis par le sol Statut helminthiase et la condition physique des enfants d&#39;âge scolaire

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

determining-soil-transmitted-helminth-infection-status-physical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.1K vues.  Swiss Tropical and Public Health Institute, Basel, Switzerland. L'infection chronique par des helminthes transmis par le sol (STHS) provoque une malabsorption, retard de croissance et émaciation chez l'enfant qui grandit. Par conséquent, il est plausible que ces infections réduisent également la condition physique des enfants. Ici, nous visualisons deux techniques pour le diagnostic du STHS et le test de 20 mètres de navette course pour évaluer l'aptitude physique des enfants.

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Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

L&#39;analyse de la maturation des cellules dendritiques pulmonaire et de la migration au cours de l&#39;inflammation allergique des voies respiratoires

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un Densovirus dans le coton Heliothis

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...