The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole sont effectués conformément aux lignes directrices énoncées par le Royaume-Uni Home Office et de l&#39;Université des Services vétérinaires Edimbourg. 1. L&#39;infection de souris par gavage <ol><li> Magasin Heligmosomoides polygyrus L3 larves dans l&#39;eau distillée jusqu&#39;à six mois à 4 ° C. </li><li> Avant utilisation, lavez larves L3 trois fois dans l&#39;eau distillée: centrifuger à 300 g pendant 10 min (avec frein), mais enlever tous les 500 pi d&#39;eau (pour éviter les larves L3 granulés inquiétante) et remettre le culot à chaque fois. </li><li> Pour le troisième lavage, ajouter de l&#39;eau à un volume exact (typiquement 40 ml) et aspirer 20 pi avec une pointe coupe 200 pi d&#39;élargir son ouverture. Placer deux échantillons de 20 ul sur la surface d&#39;une boîte de culture de 60 mm et compter les larves L3 (généralement mobile, et mieux vu sous un grossissement de 50X avec un microscope à dissection). Remettre en suspension le culot final dans de l&#39;eau distillée à une Concentration de 2000 larves L3 par ml. </li><li> Pour la production du cycle de vie, d&#39;infecter (C57BL / 6xCBA) souris F1 huit semaines, âgé de 400 H. polygyrus larves L3 dans 200 ul d&#39;eau distillée par gavage par voie orale (souris retenir en position verticale par la peau du cou et passer doucement l&#39;aiguille de gavage émoussée par la bouche et de l&#39;œsophage dans l&#39;estomac). Bien agiter avant chaque infection (larves se installent rapidement dans l&#39;eau) et aspirer 200 pi dans une seringue de 1 ml; utiliser une aiguille de gavage dédiée à bout arrondi. Pour l&#39;infection expérimentale de souris plus jeunes (6-8 semaines anciens), ou d&#39;autres souches consanguines (par exemple C57BL / 6 ou BALBc), infecter des souris avec 200 larves L3. </li></ol> 2. Propagation et entretien de H. polygyrus <ol><li> Placez charbon dans le centre d&#39;une grande baignoire en plastique et laissez l&#39;eau froide du robinet afin de fonctionner au-dessus d&#39;un minimum de 30 min (non lavés charbon actif est toxique pour les larves L3). Videz l&#39;eau de la baignoire et placer le charbon de bois sur tDeux couches de papier absorbant, le laissant exposé à l&#39;air ambiant jusqu&#39;à séchage complet. </li><li> Si les œufs sont nécessaires, gratter les matières fécales premier sur le côlon avec des pinces et ciseaux (si nécessaire). Si un grand nombre de larves L3 est nécessaire, placer des souris sur une grille de fils et de recueillir des boulettes fécales sur plusieurs jours. </li><li> Mélanger les selles avec du charbon de bois granulé à un rapport d&#39;au moins 1: 1, pour obtenir une consistance juste humides assez pour adhérer à papier filtre. Appliquer une fine couche sur le centre de certains papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placer dans une boîte humide (ajouter un peu de serviette de papier humide et un plat d&#39;eau) dans l&#39;obscurité pendant 12 à 14 jours. </li><li> Retirer larves L3 de 7 jours à compter, et les recueillir sur au moins deux reprises avant que le papier est jeté. Les larves former un anneau autour du bord du papier filtre; soulever le papier filtre sur la boîte de Pétri et rincer les larves qui sont à gauche de la plaque (en utilisant une pipette et 5 ml d&#39;eau stérile par plaque) dans un tube de 50 ml. </li><li> Ascenseurle papier filtre et récolter les larves restant à gauche sur la plaque avec de l&#39;eau distillée dans un tube de 50 ml. Centrifuger la solution d&#39;effluents à 300 g pendant 10 min. Laver les larves trois fois à l&#39;eau distillée, puis stocker à 4 ° C dans un maximum de 50 ml d&#39;eau distillée jusqu&#39;au moment requis. REMARQUE: Les larves restent viables et infectieux pendant au moins six mois. </li></ol> 3. Collection des adultes H. polygyrus Worms <ol><li> Préparer l&#39;appareil Baermann modifié à l&#39;avance comme représenté sur la Figure 1. </li><li> Souris Cull quatorze jours après l&#39;infection. </li><li> Laver l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Couper la peau sur l&#39;abdomen et tirez pour révéler la paroi abdominale antérieure. Faire une incision médiane pour entrer dans la cavité péritonéale. </li><li> Retirer l&#39;ensemble du petit et grand intestin (du duodénum proximal rectum distal). Placer dans une boîte de Pétri sec. </li><li> Redresser l&#39;intestin sur toute sa longueur; exciser le côlon fèces contenant; placer cela dans un plat à part pour les préparations d&#39;œufs plus tard. </li><li> Exciser les proximales 20 cm de l&#39;intestin grêle qui contient les vers adultes -identified par la paroi relativement épaisse du duodénum et souvent un aspect rouge dues à des vers intra-luminal. Placez dans un (100 mm de diamètre) boîte de Pétri avec 5 ml de la solution de Hanks, chauffée à 37 ° C (deux spécimens par boîte). </li><li> Ouvrez la partie de l&#39;intestin proximal ver rempli longitudinalement avec des ciseaux (ciseaux à bout rond sont les meilleurs pour cela), et racler l&#39;intérieur de paroi intestinale avec deux lames de verre pour enlever les vers. Puis jetez la paroi intestinale propre. </li><li> Vers pointe dans de petits sacs de mousseline, base fermée et sécurisée avec trombones autour du bord de l&#39;entonnoir de verre (Figure 1). </li><li> Remplissez entonnoir avec une solution de Hanks et ajouter environ 4 boîtes de Pétri de vers dans chaque entonnoir. </li><li> Placez l&#39;appareil sur 37 ° C incubateur pendant 1-2 heures, en agitant doucement à mi-parcours pour délogerles débris de la préparation de l&#39;intestin qui peuvent obstruer le filtre de mousseline. Prenez soin d&#39;éviter le déversement de débris à l&#39;extérieur du sac de mousseline - cela va causer une contamination de la préparation finale HES. Les vers adultes auraient lentement migré à travers le tissu de mousseline et se sont installés au fond du tube à essai en verre. Détacher délicatement le tube à essai dans le tuyau en caoutchouc reliant dessus de l&#39;évier (en prenant soin d&#39;éviter de perdre des vers à ce point). </li><li> En utilisant une pipette en plastique, transférer les vers dans un tube de 50 ml et laver six fois avec Hanks Solution (permettent de vers à régler avec gravité, supprimer les médias avec un Stripette, ajouter 40 ml de Hanks Solution et répéter cinq fois). REMARQUE: la culture du ver doit être maintenue stérile partir de ce point. <ol><li> Déplacer vers une hotte à flux laminaire et laver encore six fois dans une solution stérile de Hanks additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, prêt pour la culture in vitro. </li></ol></li><li> Comptez levers adultes récupérés en prenant deux échantillons de 20 ul prises avec une pointe jaune coupe d&#39;élargir son ouverture; attendre environ 50% de la quantité de larves inoculées. </li></ol> 4. Configuration de cultures pour HES: Préparation Moyen, adultes Worms <ol><li> Tremper les vers de 3,11 à environ 10 ml de RPMI additionné de 10% de gentamycine pendant 20 min, en laissant reposer le tube à un angle pour assurer des vers sont entièrement couverts. </li><li> Effectuer cette dans une hotte à flux laminaire: laver à nouveau six fois avec une solution de Hanks (complété avec 5 U / ml de pénicilline et 5 ug / ml de streptomycine). </li><li> Préparer H. polygrus médias. </li><li> Le maintien de la stérilité dans une hotte à flux laminaire, à 500 ml de RPMI1640, ajouter 11,1 ml de 45% de glucose (concentration finale de 1,2% comme RPMI 1640 contenant 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-streptomycine (concentration finale de 5 U / ml de pénicilline, 5 ug / ml de streptomycine), 5 ml de L-glutamine (2 mM de concentration finale), et5 ml de gentamycine (concentration finale 1%). Ne pas ajouter de FCS. </li><li> vers aliquotes dans des flacons T25 ventilés, env. 1000 vers dans 15 ml H. polygyrus médias par flacon, et le lieu debout dans 37 ° C incubateur (5% de CO 2) pour trois semaines. </li></ol> 5. Préparation de HES <ol><li> Récupérer HES-contenant des milieux de culture à partir de cultures à des intervalles de plus de deux fois par semaine, l&#39;annulation de la première collection après 24 h de la culture (en raison de niveaux élevés de contamination LPS et protéines de l&#39;hôte - peuvent être traitées séparément ou mis au rebut). Gardez chaque collecte séparée et clairement étiquetés avec le numéro de date et lot. Remplacer avec un volume égal de H. polygyrus médias à chaque fois. </li><li> Centrifugeuse HES-contenant les médias à 400 x g pendant 5 min. Puis filtrer stériliser par 0,2 um filtres à faible liaison aux protéines en tubes de 50 ml. Magasin dans le congélateur à -20 ° C clairement étiqueté avec la date de la récolte du ver et la date de HES collection. </li><li> Après 21 jours de collecte HES de la culture, jeter vers. </li><li> Piscine 500-1000 ml de surnageant HES (habituellement de stock congelé, et non y compris la collecte premières 24 h) et se concentrer sur un filtre de 3000 MWCO dans le dispositif d&#39;ultrafiltration sous pression d&#39;azote. NOTE: Soyez très prudent de ne pas laisser le filtre à sec. <ol><li> Pour mettre en place le dispositif de filtrage, d&#39;abord laver le côté brillant de la membrane 3 kDa dans un bécher de 1 litre avec de l&#39;eau distillée pendant 3 x 20 min tout en remuant. Monter le dispositif d&#39;ultrafiltration selon les instructions du fabricant avec membrane filtrante côté brillant vers le haut. Lieu dans l&#39;armoire à 4 ° C et passer 50 ml d&#39;eau distillée à travers avant de commencer à se concentrer HES en gestion commune. </li><li> Ajouter dans chaque tube de HES dans le dispositif de filtration selon les besoins (100 à 140 ml par jour), jusqu&#39;à ce que le volume est concentré jusqu&#39;à 2-5 ml. </li></ol></li><li> Afin d&#39;éliminer les contaminants de milieux de culture contenant HES, ajouter 50 ml de pyrfibrinogène exempt de PBS au dispositif de filtration et vers le bas et ensuite concentré à environ 2 ml. Répétez cette étape deux fois (150 ml de PBS au total). Transfert HES dans un tube de 15 ml, stériliser par filtration (avec un filtre de 0,2 um) dans une hotte à flux laminaire et mesurer la concentration de protéine en utilisant un spectrophotomètre (E = 10 280) ou par dosage de Bradford. </li><li> Aliquote, étiquette avec numéro de lot et la date, et le gel à -80 ° C. </li><li> Effectuez un test de LAL chromogène selon les protocoles du fabricant sur chaque lot de HES avant de l&#39;utiliser. Si les niveaux de LPS sont supérieures à 1 U LPS pour 1 pg de protéine, envisager de ne pas utiliser ce lot pour des expériences in vivo ou in vitro de cultures. </li><li> Traiter les HES recueillies à 24 h séparément de la même manière; elle contient le LPS et des protéines de l&#39;hôte et, tout en ne convient pas pour des expériences fonctionnelles, il est une source utile de molécules individuelles qui peuvent être isolés par monoclonal purification par affinité d&#39;anticorps. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Le cycle de vie de H. produit de polygyrus d&#39;une manière fiable cohérente. Après l&#39;ingestion naturelle ou gavage oral de L3 larves au jour 0, les kystes commencent à se former sous la séreuse duodénale par jour 5, progressant vers mues larvaires, puis en train de devenir des vers adultes dans la lumière intestinale du jour 10, les oeufs peuvent être vus dans les selles de 14 jours et les granulomes sont visibles sur la surface séreuse du duodénum au jour 21. Le protocole décrit ci-dessus (et résumés dans la figure 6) permet une production à haut débit de H. produits polygyrus de excréteurs-sécrétoire (HES), en plus de la récupération fiable des larves L3 viable pour les futures infections expérimentales du cycle et de la vie. L&#39;infection à H. polygyrus a été montré pour avoir un effet protecteur dans des modèles de l&#39;asthme dépendant de OVA ou Der p 1 (acariens allergène) 14. En outre, la suppression de l&#39;inflammation des voies aériennes peut être transférée avec CD4 + CD25 + </sup&gt; cellules T régulatrices CD19 + 14 ou CD23 des cellules B réglementaires hi 24 de non-sensibilisés, H. polygyrus infectés par souris. Dans les modèles d&#39;auto-immunité, H. polygyrus infection a été montré pour être suppressif dans le modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) de la sclérose en plaques 9, et la suppression peut être transféré avec des cellules T CD4 + ou des cellules B CD19 + de souris infectées 24. Produits d&#39;excrétion-sécrétion de Heligmosomoides (HES) modulent la réponse immunitaire de l&#39;hôte et supprimer l&#39;inflammation médiée par Th2 par un certain nombre de mécanismes (décrites dans la figure 7), comprenant: a) Inhibition de la réponse des cellules dendritiques pour stimulation 25, b) induction de CD4 lymphocytes T régulateurs Foxp3 + + 18. et c) le blocage de l&#39;IL-33 la production 20. HES a montré un effet protecteur lorsqu&#39;il est administré unet sensibilisation ou un défi dans le modèle OVA-alun de l&#39;asthme 19 et également lorsque administré par voie intranasale avec l&#39;extrait de Alternaria allergène 20, par la suppression de la petite IL-33 de presse. Éviter la contamination LPS des HES est souvent cruciale pour le succès des futures expériences immunologiques. Dans le protocole décrit ici, les étapes critiques dans la réalisation de cet doivent se assurer que les débris contenus dans les sacs de mousseline de l&#39;appareil Baermann ne entre pas dans la préparation de HES final (voir 2.10) et de mettre de côté la solution ES à partir des 24 premières heures de la culture (voir 5.1). Au cours des dernières années, HES a été caractérisé à fond au niveau protéomique avec plus de 370 protéines distinctes identifiées 26,27. En outre, ES à partir du 4ème stade larvaire a été soumis à l&#39;analyse protéomique 28. Les travaux en cours comprend la caractérisation des composants majeurs glycanes de HES, connues pour être fortement immunogène 3, et sécrétée micro-RNComme qui sont encapsulés dans des vésicules de 50 à 100 nm ou exosomes (Buck et al., Soumis pour publication). Avec la mise en place de protocoles reproductibles pour la collecte des ES de ce parasite très immunomodulateur, et avec de nombreuses données protéomiques identifiant les composants moléculaires de HES, le décor est désormais planté pour l&#39;identification et l&#39;essai thérapeutique de molécules individuelles de H. polygyrus qui peut médier les effets principaux sur le système immunitaire de l&#39;hôte.

Heligmosomoides polygyrus est un helminthes gastro-intestinal murin naturel qui est étroitement liée à la très répandues nématodes parasites humains 1. Contrairement à d&#39;autres modèles, tels que nématodes Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus établit toujours une infection chronique chez la souris comme un résultat direct de plusieurs mécanismes de immunomodulateurs puissant qu&#39;il emploie pour supprimer l&#39;hôte de la réponse immunitaire 2. H. polygyrus a un cycle de vie direct: larves L3 infectieux sont ingérés par transmission féco-orale (ou administré par gavage oral dans le cadre d&#39;un laboratoire), après quoi ils migrent vers la couche de sous-séreux du duodénum et enkystent avant de revenir à la lumière intestinale comme vers adultes environ huit jours après l&#39;infection initiale. L&#39;accouplement et la production d&#39;oeufs se produit par jour 10 et il est possible de récolter les vers adultes pour la culture et la collecte de produits d&#39;excrétion-sécrétion de da14 y compter trois. H. polygyrus interagit également avec la microflore commensale, à une augmentation de lactobacilles présente chez les souris sensibles infectés 4-6, et l&#39;augmentation des niveaux de H. polygyrus infection après exposition des souris à 6 lactobacilles. Infection active à H. polygyrus a été démontré que la protection contre l&#39;immunopathologie dans de nombreux modèles animaux de l&#39;auto-immunité 7-10, la colite 11,12 et 13 à 16 allergie. Il a donc été un grand intérêt dans le potentiel de molécules excréteur-sécrétoires de ce parasite (&quot;HES&quot;) en bas-modulent pathologie in vivo 17,18. En effet, des effets protecteurs sont vus après le traitement des souris avec des produits HES 19 par des voies qui sont maintenant identifiés 18,20. Ici, nous décrivons un protocole pour la production fiable de Heligmosomoides polygyrus et la récupération de ses produits sécrétésqui peut être en outre utilisés pour une gamme d&#39;études biochimiques et immunologiques fonctionnels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anciennement connu sous le nom Nematospiroides dubius, et également appelé par certains comme H. bakeri) est un helminthes gastro-intestinal qui emploie plusieurs mécanismes immunomodulateurs d&#39;établir une infection chronique chez la souris et étroitement ressemble infections prévalentes d&#39;helminthes humaines. H. polygyrus a été largement étudié dans le domaine de la régulation immunitaire helminthes dérivé et a été trouvé pour supprimer puissamment modèles expérimentaux de l&#39;allergie et de l&#39;auto-immunité (à la fois d&#39;une infection active et produits sécrétés isolés). Le protocole décrit dans le présent document décrit la gestion du H. polygyrus cycle de vie pour la production de larves L3 cohérente, la récupération des parasites adultes, et la collecte de leurs produits d&#39;excrétion-sécrétion (HES).

Susceptibilité à l&#39;infection par H. polygyrus est contrôlée dans une large mesure par l&#39;arrière-plan génétique de la souche de la souris (tableau 1); Souris C57BL / 6 et de l&#39;ABC sont très sensibles 21,22. Pour l&#39;entretien du cycle de vie du parasite, l&#39;hybride F1 entre ces deux souches a été choisi pour sa capacité à résister beaucoup plus élevés charge parasitaire sans morbidité (dommages épithéliales intestinales excessive) soit par rapport à la souche parentale. Gavage oral de 400 larves L3 est utilisé pour maintenir le cycle de vie chez les souris F1 (résultant en charge parasitaire adultes présentés dans la figure 2), tandis que la dose de 200 larves L3 est généralement utilisé pour des expériences de souches consanguines homozygotes (par exemple, C57BL / 6 ou BALBc). Toutefois, cette dose peut être nécessaire de réduire en fonction de co-facteurs environnementaux qui peuvent différer entre les établissements d&#39;origine animale, tels que les variations de la flore intestinale. Lots de HES ont prouvé effi reproductiblecacité dans des dosages fonctionnels et de la composition de protéine; De plus, quand les surnageants de chaque semaine successive de culture ont été analysés, jusqu&#39;à un total de 4 semaines, les profils de protéines se sont avérées très similaire (figure 3). Lorsque la concentration HES est mesurée par dosage de Bradford (voir 5.5), le total protéine est généralement d&#39;environ 1 mg / ml (Figure 4). Un autre procédé de concentration HES est un concentrateur centrifuge (par exemple des membranes de coupure Vivaspin 3 kDa), dans lequel les échantillons sont centrifugés à jusqu&#39;à 4000 g dans un rotor centrifuge pivotant vers l&#39;extérieur, l&#39;élimination des sels tampons et des composants de faible poids moléculaire. Concentration centrifuge est plus adapté aux petits volumes de traitement (1-10 ml) et sont limitées à un facteur de concentration maximum d&#39;environ 30x. Lors de la collecte HES, éviter la contamination est critique. Pour éviter la contamination avec des molécules d&#39;accueil, nous écartons HES-suiteaining milieux de culture à partir de la 24 première heure après la récolte du ver adulte de l&#39;intestin de la souris. Nous quantifions également le niveau de contamination LPS dans chaque lot de HES avec un dosage chromogénique LAL (voir 5.7). 1 U de LPS équivaut à ~ 100 pg LPS et des niveaux inférieurs à ce 23 sont considérées comme négligeables. Dans nos mains, la plupart des lots de HES sont nettement en dessous de cette limite, la concentration moyenne de LPS dans HES étant 0,23 U / pg (Figure 5). Les effets de LPS dans des modèles in vivo de pathologie (par exemple, la suppression des réponses asthmatiques) nécessite au moins 10 ng de LPS 23. Ainsi, dans l&#39;administration in vivo de 5 ug HES partir d&#39;un lot de 100 pg LPS / pg HES comprendra 500 pg de LPS, bien en dessous de la concentration efficace lorsque LPS devient un problème. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figure 1: Appareil Baermann BaerAppareillage mann pour la collecte des adultes de H. polygyrus (tel que décrit dans la section 2). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figure 2: moyenne Worm Burden 14 jours après l&#39;infection avec 400 larves L3 ver moyenne pèse 14 jours après l&#39;infection avec 400 larves L3. Les points de données sont présentés à partir de 19 tours de l&#39;infection de souris C57BL / 6xCBA distincts. Moyenne ± SEM montrée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figure 3: profils protéiques de HES partir semaines consécutives dans la culture profil SDS-PAGE de protéines HES recueillies au cours des semaines successives de la culture. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figure 4: </strong&gt; Quantité final de HES de 500 ml contenant ES médias rendement de protéines HES de 11 lots différents provenant d&#39;environ 500 ml de surnageant de culture. Moyenne ± SEM montrée. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figure 5: LPS contamination de niveaux de contamination HES LPS en 41 lots d&#39;HES mesurées par le test de Limulus ameobocyte. Concentration médiane LPS = 86 U par mg de HES. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figure 6: Schéma d&#39;animation de H. Résumé du cycle de vie polygyrus des étapes clés du cycle de vie du gavage des larves L3, grâce à la récupération des larves et les vers adultes à l&#39;isolement des HES. Figure 7: Schéma d&#39;animation des HES et ses fonctions d&#39;effets immunomodulateurs clés de médiateurs solubles et exosomes contenues dans HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Génotype (et la souche de fond) </td><td> Phénotype de l&#39;infection primaire </td><td> Référence </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Souches consanguines </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, ABC, C3H </td><td> Très sensible </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 et des souris C57BL / 10 </td><td> Sensible </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermédiaire </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Faible sensibilité </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénique pour des cytokines ou des récepteurs de cytokines </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Plus sensibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Moins sensible (a); aucune modification de la sensibilité, mais une augmentation des granulomes (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rß transgénique (C57BL / 6) </td><td> Résistant </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> La fécondité supérieur </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (souris C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Très sensible </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (souris BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Très résistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgéniques(FVB) </td><td> Résistant </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Insuffisantes Th2, diminué granulome gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Plus sensibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Aucune modification de la sensibilité </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Haute Th1, sensibilité accrue </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénique pour les marqueurs de cellules T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité légèrement supérieur </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité supérieur </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité supérieur &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgéniques pour loci immunitaire innée </td><td></td></tr><tr><td> Type 1 récepteur de l&#39;interféron (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> La fécondité supérieur, plus de granulomes </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Plus résistantes, plus de granulomes </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Plus sensibles </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: infections primaires avec H. polygyrus dans des souches génétiquement différentes et gènes ciblée souris.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus est un nématode murin avec de puissantes capacités immunomodulateurs qui ressemblent étroitement à celles de l&#39;infection hautement répandue helminthes humaine. Ici, nous décrivons un protocole pour le maintien à long terme de la H. polygyrus cycle de vie.

La culture de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.0K vues.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus est un nématode murin avec de puissantes capacités immunomodulateurs qui ressemblent étroitement à celles de l'infection hautement répandue helminthes humaine. Ici, nous décrivons un protocole pour le maintien à long terme de la H. polygyrus cycle de vie. 

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A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Recherche

Immunologie et infection

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Développement d&#39;un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l&#39;identification des médicaments immunomodulateurs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagation du parasite microsporidien Edhazardia aedis chez les moustiques Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...