L’imagerie vibratoire hautement multiplexée fournit une approche optique unique pour interroger plusieurs marqueurs protéiques dans les tissus avec une résolution subcellulaire. Cette plate-forme fournit une image complète des interactions protéiques des systèmes biologiques. Le principal avantage de cette technique est sa multiplexité sans cycle.
Cette technique est particulièrement adaptée aux applications où les stratégies de cyclisme ne fonctionnent pas bien, comme dans les sections de tissus épais. Cette méthode permet la caractérisation cellulaire individuelle in situ pour comprendre les structures du système complexe, telles que la construction de l’atlas tissulaire, le phénotypage des micro-environnements tumoraux et le profilage du circuit cérébral. Pour commencer, préparez environ 0,1 bicarbonate de sodium molaire dans un tampon PBS à PHA 0,3 à utiliser comme tampon de conjugaison et stockez-le à quatre degrés Celsius.
Préparez ensuite trois solutions de sonde MARS fonctionnant à l’ester de n-hydroxysuccinimide millimolaire dans du sulfoxyde de diméthyle anhydre. Dissoudre les solides d’anticorps dans le tampon de conjugaison à une concentration de deux milligrammes par millilitre. Pour les anticorps dissous dans d’autres tampons, concentrez-les dans un filtre centrifuge, puis ajoutez-les dans le tampon de conjugaison à une concentration de un à deux milligrammes par millilitre.
Pour effectuer la réaction de conjugaison pour les anticorps secondaires, ajouter 15 fois l’excès molaire de solution de colorant à la solution d’anticorps dans un flacon en verre lentement en remuant et incuber le mélange réactionnel à température ambiante en remuant pendant une heure. Pour effectuer la purification, préparez la boue en ajoutant 10 millilitres de poudre de résine de filtration de gel dans 40 millilitres de tampon PBS dans un tube de 50 millilitres. Conservez la solution au bain-marie à 90 degrés Celsius pendant une heure.
Ensuite, décantez le surnageant, ajoutez le PBS jusqu’à 40 millilitres et stockez la boue à quatre degrés Celsius. Emballez la colonne d’exclusion de taille avec la solution de boue à la hauteur de 10 à 15 centimètres, puis rincez et lavez la colonne avec environ 10 millilitres de PBS pour emballer davantage la résine. Par la suite, pipetter le mélange réactionnel de conjugaison à la colonne.
Après avoir chargé le mélange réactionnel, ajouter immédiatement un millilitre de PBS comme tampon d’élution. Ensuite, collectez l’éluant de la solution conjuguée en regardant la couleur sur la colonne ou en mesurant l’absorbance à 280 nanomètres. À l’aide du filtre centrifuge, concentrez la solution collectée à un à deux milligrammes par millilitre.
À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez une limite autour des sections de tissu sur la diapositive. Ensuite, incubez les tissus avec 0,3 à 0,5% pbST pendant 10 minutes et un tampon bloquant pendant 30 minutes. Pour préparer la solution de coloration primaire, ajouter tous les anticorps primaires à 200 à 500 microlitres de tampon de coloration aux concentrations souhaitées.
Centrifuger la solution de coloration primaire à 13 000 fois G pendant cinq minutes et utiliser le surnageant si un précipité apparaît. Ensuite, incubez le tissu dans la solution d’anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant un à deux jours. Lavez les lames trois fois avec 0,3 à 0,5% pbST pendant cinq minutes à température ambiante dans un bocal coulissant et assurez-vous que les tissus sont immergés dans la solution.
Plus tard, incuber le tissu dans 200 à 500 microlitres de tampon bloquant pendant 30 minutes. Pour préparer la solution de coloration secondaire, ajouter tous les anticorps secondaires à 200 à 500 millilitres de tampon de coloration avec les concentrations souhaitées. Ensuite, centrifugez la solution de coloration secondaire à 13 000 fois G pendant cinq minutes et utilisez le surnageant si un précipité apparaît.
Ensuite, incuber les tissus dans 200 à 500 microlitres de solution d’anticorps secondaire à quatre degrés Celsius pendant un à deux jours. Ensuite, lavez les lames deux fois avec 0,3 à 0,5% PBST à température ambiante pendant cinq minutes chacune. De plus, incuber avec 200 à 500 microlitres de solution DAPI pendant 30 minutes.
Encore une fois, lavez les lames trois fois avec du PBS à température ambiante pendant cinq minutes chacune et transférez les sections de tissu flottant sur les lames de verre avec la pipette de goutte de verre. Étalez le mouchoir avec une brosse à mouchoirs et nettoyez l’environnement avec des lingettes si nécessaire. Par la suite, montez le tissu dans une goutte de réactifs anti-décoloration avec un couvercle en verre et fixez-le avec du vernis à ongles.
Pour effectuer une imagerie eprSRS multicanal, réglez la puissance laser du faisceau de la pompe sur 10 à 40 milliwatts et le faisceau stokes sur 40 à 80 milliwatts sur le panneau de commande laser. Ensuite, réglez le temps de séjour des pixels à deux à quatre microsecondes et utilisez plusieurs images avec une moyenne de 10 à 20 images sur le logiciel de microscopie. De plus, réglez les constantes de temps de l’amplificateur de verrouillage sur la moitié du temps de séjour des pixels.
L’imagerie par colorant Raman de marqueurs protéiques distincts et de cellules HeLa fixées au paraformaldéhyde du cortex cérébral de la souris et du tissu FFPE rénal humide a été réalisée par marquage immunologique. L’imagerie immuno-eprSRS des cellules HeLa avec une alpha-tubuline a révélé de fines structures subcellulaires telles que des microtubules. L’imagerie eprSRS des astrocytes colorés MARS 2145 et des neurones granulaires cérébelleux colorés MARS 2228 dans le tissu cérébral de souris a démontré des modèles tridimensionnels avec une résolution subcellulaire.
L’imagerie en tandem de fluorescence SRS à sept couleurs des hormones et des facteurs de transcription sur le tissu d’îlots de souris congelés a été réalisée. Les images obtenues ont révélé un bon contraste et des motifs corrects. L’imagerie en tandem de fluorescence SRS à huit couleurs de marqueurs de type cellulaire sur des tissus de cervelet de souris fixés au paraformaldéhyde a été réalisée.
Différents types de cellules ont été identifiés tels que les neurones granulaires cérébelleux, les neurones de Purkinje, les astrocytes, les oligodendrocytes et les neurones GABAergiques. Cette procédure peut être combinée avec le nettoyage des tissus pour effectuer une imagerie protéique hautement multiplexée dans des tissus épais intacts. Notre groupe a développé un protocole de nettoyage des tissus adapté aux colorants Raman.
