Ce protocole décrit l’isolement, la culture et l’identification des microorganismes dégradant les hydrocarbures dans les habitats écologiques. Cette méthode ne nécessite pas d’instruments sophistiqués et peut être facilement réalisée dans une configuration de laboratoire standard. Il peut également être facilement adapté pour étudier d’autres substrats.
Cette technique peut facilement être transposée à diverses niches écologiques, et la dégradation de différents substrats peut être évaluée. La démonstration de la procédure sera Deepa Sethi, une étudiante au doctorat du laboratoire du Dr Richa Priyadarshini. Pour commencer, prélevez 500 millilitres d’échantillon d’eau dans cinq bouteilles en verre stériles provenant de différents sites de plan d’eau et mesurez le pH et la température de chaque échantillon.
Ensuite, filtrez l’échantillon dans des conditions aseptiques en lots de 100 millilitres à travers des feuilles filtrantes de la taille des pores de 0,22 micron. Et placez les feuilles sur différentes plaques de milieux nutritifs, en plaçant un papier par assiette. Après deux heures, décollez le papier à l’aide de pinces stériles.
Ensuite, diluez les échantillons d’eau non filtrée en ajoutant 100 microlitres de l’échantillon d’eau collecté à 900 microlitres d’eau distillée double stérile. Poursuivre les dilutions décuplées jusqu’à ce qu’un rapport de dilution de 1 à 1 000 000 soit atteint. Mélanger par pipetage et s’assurer que le volume final de chaque dilution est d’un millilitre.
Étaler 100 microlitres d’échantillons d’eau diluée individuellement sur toutes les plaques de milieux de croissance, en trois exemplaires. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures, selon la croissance des colonies. Pour obtenir des colonies isolées, choisissez une colonie à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’un embout de pipette.
Effectuez des stries de quadrant et incuber la plaque pendant la nuit. Le lendemain, filtrez les colonies en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, telles que la couleur, la texture, la forme, la taille, la marge et l’élévation. Re-striez les colonies pour obtenir des cultures pures.
Après avoir effectué la coloration de gramme de chaque culture pure, préparez des stocks de glycérol en inoculant une seule colonie dans trois millilitres de milieu de croissance approprié et en incubant à 30 degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez 700 microlitres de culture de nuit et 300 microlitres de 100% glycérol dans des flacons cryogéniques. Congelez les flacons à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.
Dans une assiette fraîchement striée, choisissez une colonie et inoculez-la dans cinq millilitres de bouillon de soja triptyque ou de bouillon nutritif. Cultiver la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius, avec agitation à 200 RPM, jusqu’à ce que l’absorbance atteigne environ deux. Le lendemain, pelletez les cellules.
Jetez le surnageant et lavez la pastille deux fois avec deux millilitres de solution saline autoclavée. Faites tourner à nouveau les cellules, puis remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu basal liquide sans carbone, ou LCFBM, et mesurez l’absorbance. Ensuite, étiquetez deux flacons d’erlenmeyer stériles de 150 millilitres comme A et B, respectivement pour le groupe témoin et le groupe expérimental.
Dans le flacon A, ajouter 40 millilitres de LCFBM, suivis d’un styrène à une concentration finale de cinq millimolaires. Dans la fiole B, ajouter 35 millilitres de LCFBM et de styrène. Ajoutez ensuite la suspension cellulaire avec une absorbance finale d’environ 0,1.
Après avoir porté le volume dans la fiole B à 40 millilitres avec du LCFBM, incuber les deux flacons à 30 degrés Celsius en agitant à 200 tr/min pendant 30 jours. Mesurer l’absorbance de chaque fiole tous les cinq jours et tracer une courbe de croissance. Augmentez l’incubation jusqu’à 45 jours si la bactérie peut utiliser le styrène.
Une augmentation de l’absorbance indique que la bactérie peut métaboliser le styrène. Pour isoler l’ADN génomique des bactéries à Gram négatif, choisissez une seule colonie et inoculez-la dans un milieu de croissance frais dans un tube à essai stérile. Après une nuit d’incubation dans un incubateur à secousses, pelletez 1,5 millilitre de la culture cultivée.
Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 microlitres de tampon de lyse. Ajoutez ensuite 66 microlitres de solution de chlorure de sodium à cinq molaires et mélangez bien. Après avoir centrifugé le mélange obtenu, pipeter le supinate clair dans un tube microcentrifuge frais et ajouter un volume égal de chloroforme.
Mélanger la solution en l’inversant plusieurs fois, jusqu’à ce qu’une solution laiteuse soit observée. Faites tourner à nouveau le tube et transférez le surnageant dans un flacon propre. Ensuite, ajoutez un millilitre d’éthanol glacé à 100% et mélangez par inversion, jusqu’à ce que des brins blancs d’ADN précipitent.
Centrifuger l’ADN précipité. Jetez le surnageant. Et lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol à 70%.
Après avoir jeté le lavage, laissez la pastille d’ADN sécher pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois séché, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon Tris-EDTA. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et exécutez l’ADN sur un gel d’agarose à 1% pour évaluer sa qualité.
Pour identifier les souches, amplifiez l’ADN isolé des cultures bactériennes pures par PCR, avec des amorces universelles ciblant la séquence d’ARN ribosomique 16S pour les bactéries. Préparez 25 microlitres du mélange PCR sur de la glace, ajoutez un microlitre de la matrice d’ADN et définissez les conditions de cycle pour l’amplification des gènes. Après la PCR, mélanger cinq microlitres de l’échantillon avec un microlitre de cinq fois le colorant de chargement de l’ADN.
Et exécutez-le sur un gel d’agarose à 1% pour vérifier l’amplification. Pour le ribosomal 16S, le séquençage du gène de l’ARNr a mis en place la même réaction que celle décrite précédemment, mais dans un volume plus élevé. Ensuite, pour purifier les amplicons pour le séquençage de Sanger, mélangez l’échantillon entier avec un colorant de chargement d’ADN et chargez-le sur un gel d’agarose pour effectuer la méthode d’extraction du gel.
Une fois le séquençage terminé, convertissez le fichier de résultats dans un format plus rapide et vérifiez la similitude de séquence à l’aide de l’outil BLAST sur NCBI. Des colonies bactériennes isolées à partir d’échantillons d’eau provenant d’une zone humide à Dadri, en Inde, sont montrées ici. Les bactéries isolées ont été cultivées individuellement dans les milieux respectifs, avec du styrène liquide comme seule source de carbone.
Le potentiel de dégradation des hydrocarbures des isolats bactériens a été évalué à l’aide d’un test de dégradation des catéchols. Un dosage représentatif pour l’un des isolats est présenté ici. L’intégrité de l’ADN génomique a été confirmée en visualisant un petit échantillon d’ADN sur un gel d’agarose.
Et le gène ribosomique 16S de l’ARNr a été amplifié à l’aide d’amorces universelles. Un arbre phylogénétique a été construit pour décrire la parenté entre les souches d’exiguobacterium isolées d’une zone humide, avec les espèces d’exiguobacterium connues. Une étape critique du protocole consiste à vérifier l’utilisation du substrat testé.
Selon les caractéristiques de croissance, le microbe peut ne pas s’adapter immédiatement à l’utilisation du substrat testé et peut nécessiter un processus d’enrichissement. Cette méthode se concentre sur la population bactérienne cultivable dans les échantillons environnementaux. Les chercheurs peuvent également effectuer des expériences, telles que le séquençage du génome entier bactérien et le profilage métabolique, qui peuvent fournir des informations précieuses sur les gènes et les voies impliqués dans la dégradation des hydrocarbures.
